高山兀鷲拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬的分離鑒定

粟玉剛　李向勇　李蜜　劉彬　彭叢笑　夏青珍　劉友瓊

摘 要：從動(dòng)物園發(fā)病死亡的高山兀鷲的肝臟、心臟血液、胰臟中分離到2種菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色和分子生物學(xué)鑒定最終確定2種菌株分別為拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬。本次試驗(yàn)結(jié)果為高山兀鷲生物學(xué)特性研究提供了技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：高山兀鷲、拉奎拉棒狀桿菌、腸球菌屬、分離鑒定

中圖分類號(hào)：S858.39? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1673-1085（2023）07-0054-04

高山兀鷲（Gypshimalayensis），又名喜馬拉雅兀鷲，鷹形目（Accipitriformes）、鷹科（Accipitridae）[1-2]、禿鷲亞科（Aegypiinae），屬于大型猛禽，國(guó)家二級(jí)保護(hù)鳥類，被列入瀕危野生動(dòng)植物國(guó)際貿(mào)易公約（CITES公約）附錄Ⅱ限制貿(mào)易鳥類。高山兀鷲集中分布于我國(guó)的西部高山、高原地區(qū)，為不易歸類的分布型鳥，生活在海拔2 500～4 800 m區(qū)域。資料顯示生活在珠穆朗瑪峰自然保護(hù)區(qū)的高山兀鷲，秋季沿橫斷山脈向南遷徙至云南西部，或越過喜馬拉雅山脈到印度、緬甸等地越冬[3-4]。高山兀鷲體長(zhǎng)120～150 cm，體重可達(dá)8～12 kg，于高空翱翔，飛行狀態(tài)時(shí)翼尖而長(zhǎng)，略向上揚(yáng)[5]，有時(shí)結(jié)小群活動(dòng)，或停棲于多巖峭壁，以腐肉為食，對(duì)維持生態(tài)系統(tǒng)平衡有重要意義。本研究從動(dòng)物園一例死亡的高山兀鷲的肝臟、心臟血液、胰臟等病料分離出細(xì)菌，經(jīng)革蘭氏染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并通過分子生物學(xué)檢測(cè)鑒定分離菌為拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬，從而為高山兀鷲的疾病防治和動(dòng)物園飼養(yǎng)提供理論依據(jù)和有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 長(zhǎng)沙生態(tài)動(dòng)物園一例死亡的高山兀鷲采集其肝臟、心臟血液、胰臟等臟器組織作為病料樣品。

1.1.2 主要試劑 血瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自鄭州貝瑞特生物技術(shù)有限公司，藥敏紙片套裝購(gòu)自常德比克曼生物科技有限公司，DL5000 marker購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Premix Taq? （TaKaRa Taq? Version 2.0）、Nuclease-free Water購(gòu)自TakaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與革蘭氏染色鑒定 將死亡的高山兀鷲肝臟、心臟血液、胰臟等進(jìn)行組織處理后嚴(yán)格按照無(wú)菌操作，用高溫灼燒后的接種環(huán)蘸取少量病變組織液在血瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線接種，在37℃恒溫箱培養(yǎng)18 h后，分別挑取不同形態(tài)的單菌落并編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)菌，通過平板劃線法再次接種于血瓊脂平板進(jìn)行純化，挑取少量純化后的單菌落適當(dāng)稀釋后進(jìn)行革蘭氏染色鑒定。

1.2.2 細(xì)菌16S rDNA基因序列擴(kuò)增 用無(wú)菌接種環(huán)分別挑取不同形態(tài)的純化后的1號(hào)、2號(hào)菌，接種于150 ?L滅菌超純水中混勻，按照DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，根據(jù)先前研究[6]合成用于PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因序列的通用引物，16S rRNA-27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；16S rRNA-1492R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)總體系25 ?L，包括Premix Taq? 12.5 ?L，上下游引物各0.5 ?L，DNA模板1.0 ?L，Nuclease-free Water 10.5 ?L。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5.0 ?L PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，觀察結(jié)果。將擴(kuò)增的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序回來的結(jié)果使用DNAMAN拼接好后，提交至NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，同源性≥99%可以定義到種的水平；若同源性在97.0%～98.9%，可以定義到屬的水平；若同源性＜97.0%，則定義為科水平，鑒定標(biāo)準(zhǔn)按照同源性≥97.0%判定[7]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌形態(tài)及革蘭氏染色觀察結(jié)果

接種病料組織液后的血瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)表面長(zhǎng)有兩種形態(tài)不同的菌落，1號(hào)菌落為圓形、灰白，呈水滴狀，革蘭氏陽(yáng)性菌，鏡檢顯示兩端膨大呈棒狀，排列不規(guī)則，如圖1；2號(hào)菌落形狀不規(guī)則、灰白色，個(gè)別呈刺突狀，革蘭氏陽(yáng)性菌，鏡檢呈圓形或橢圓形短鏈狀排列，如圖2。

2.2 PCR擴(kuò)增及序列分析結(jié)果

用細(xì)菌通用引物對(duì)其16S rDNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，菌1和菌2均擴(kuò)增出大小約為1 500bp的片段，進(jìn)一步測(cè)序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)該兩種菌株序列分別與已知拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬同源性高于99%，提示獲得分離株為拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬。同源性分析結(jié)果見表1。

3 討論

本試驗(yàn)通過細(xì)菌形態(tài)、革蘭氏染色鑒定及PCR擴(kuò)增及序列分析，從發(fā)病高山兀鷲的肝臟、心臟血液、胰臟中分離到拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬2種菌株。關(guān)于拉奎拉棒狀桿菌在高山兀鷲糞便、病料等檢出的文獻(xiàn)研究較為少見[8]。腸球菌屬為當(dāng)前益生菌研究的熱點(diǎn)，多種常見的腸球菌菌株已廣泛應(yīng)用于多種發(fā)酵食品、藥物和微生態(tài)制劑當(dāng)中[9]。對(duì)于高山兀鷲這種食腐食性猛禽，其腸道中的腸球菌屬對(duì)其消化腐食以及抑制腐食中病原菌所發(fā)揮的作用是值得深入研究的課題，其對(duì)于進(jìn)一步研究高山兀鷲的生態(tài)習(xí)性等具有重要意義[10]。

拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬的病原體大多毒力不高或致病性不強(qiáng)，一些是條件性致病菌，疾病的發(fā)生常與創(chuàng)傷或動(dòng)物的免疫力低下有關(guān)。該例高山兀鷲死亡前經(jīng)歷籠舍調(diào)整，由大的開放籠舍轉(zhuǎn)移到面積小的封閉籠舍，可能存在飛行等行為無(wú)法得到有效滿足這一誘因。此外結(jié)合剖檢結(jié)果，不排除其因機(jī)體抵抗力降低，伴隨細(xì)菌感染后發(fā)病死亡的可能。因此，在高山兀鷲圈養(yǎng)實(shí)踐中應(yīng)從籠舍環(huán)境與其生活習(xí)性之間的關(guān)系及疫苗接種、飼養(yǎng)環(huán)境的消殺滅源等疫病防控措施作進(jìn)一步探討，本研究為高山兀鷲的動(dòng)物園飼養(yǎng)和疾病防治提供理論依據(jù)和有益參考。

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第一作者簡(jiǎn)介：粟玉剛（1985—），女，湖南長(zhǎng)沙人，中級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疾病治療與防治工作，E-mail：412635016@qq.com。

*通信作者簡(jiǎn)介：李向勇（1981—），男，河南周口人，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疾病治療與防治工作，E-mail：29778693@qq.com。