不同種群羅氏沼蝦幼體的腸道菌群結構與功能特征分析

施金谷,武 霞,黃光華,楊慧贊,梁 怡,呂 敏,曾 蘭,胡大勝,黃立斌,王 瑞

( 1.廣西水產科學研究院,廣西水產遺傳育種與健康養殖重點實驗室,廣西 南寧 530021; 2.廣西水產技術推廣站,廣西 南寧 530022; 3.廣西師范大學 生命科學學院,廣西 桂林 541006 )

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii),又稱金錢蝦、馬來大蝦或長腳大蝦,屬節肢動物門甲殼綱十足目長臂蝦科沼蝦屬[1],是世界上個體最大的淡水蝦。羅氏沼蝦肉質鮮嫩,具有食性雜、養殖周期短、生長快、病害少等特點,是一種優良的淡水養殖品種。近年來,羅氏沼蝦養殖業發展迅猛,但在養殖過程中,溶解氧、溫度、飼料等均可影響羅氏沼蝦的免疫機能[2-3],免疫機能的下降會引起蝦的疾病和死亡,從而影響上市蝦的產量和規格,影響養殖戶的收益。研究表明,在基礎飼料中添加益生菌能顯著增強腸道免疫機能[4-6]以及腸道內優勢菌群的生長[7-8],提升機體的抗病能力[2,9-10]。腸道菌群失調會引起全身性的炎癥,健康的腸道菌群由固定的菌群組成[11-12]。所以,腸道菌群的結構和豐度影響著宿主的生長與健康。

腸道微生物群是生活在動物腸道部位的生物集合,細菌是腸道中的主要定殖者,其他為真菌、古生菌、原生動物、真核寄生生物以及病毒等[13]。在長期的進化中,腸道微生物除了可以引起疾病的暴發,還可以與宿主互利共生,對宿主的營養代謝、吸收和生長等產生重要影響[14]。腸道微生物群結構的分析研究方法主要有傳統純培養法、ERIC-PCR分子雜交技術、基于16S rRNA的分子技術、熒光原位雜交技術以及宏基因組學研究方法等[15]。近幾年,16S rRNA高通量測序是分析腸道微生物的主要技術,可以準確定位到分類學屬水平。韓娜等[16]研究出一種新的定量16S rRNA基因擴增子測序方法,采用隨機標簽和內參法相結合,能降低試驗因素的影響,有效提高腸道微生物群結構檢測的精準性。16S rRNA測序技術已應用到畜牧學[17-19]、醫學[20-21]、農學[22]和水產學[23-25]等多種學科專業。基于16S rRNA技術,鄧祥宜等[26]研究了克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)的腸道菌群多樣性,表明核心菌群在消化利用腸道中的蛋白質上起重要作用。目前,國內學者主要研究報道了凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[27-28]、克氏原螯蝦[13,29]、日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)[30]等蝦類的腸道菌群結構與特征,而關于羅氏沼蝦的腸道菌群研究報道較少,主要集中在飼料中添加微生態制劑[2]、發酵豆粕[31]等對羅氏沼蝦腸道菌群的影響及不同養殖條件對羅氏沼蝦腸道菌群的影響[32]方面。筆者利用16S rRNA高通量測序技術,探究羅氏沼蝦的腸道菌群結構與功能,分析不同種群羅氏沼蝦幼體間的腸道菌群差異,以豐富和擴展羅氏沼蝦腸道菌群的基礎研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用緬甸種群、斯里蘭卡種群、越南種群、孟加拉種群和自有品種1種群等5個不同種群的羅氏沼蝦幼體,試驗材料采自廣西南寧國家級羅氏沼蝦良種場。育苗用水為濃縮海水加入淡水配制,鹽度10～12,水溫28～29 ℃,pH 7.5～8.0,溶解氧質量濃度≥5 mg/L。早晚各投喂鹵蟲(Artemia)無節幼體1次,中間投喂蒸蛋微粒2次。所有樣品為同一批孵化且孵化20 d的幼蝦。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集

從育苗車間采集孵化20 d的5個不同種群的羅氏沼蝦幼體,每個種群的幼體樣本各2份,每份含羅氏沼蝦幼體約3 g。樣品采集后用無菌水沖洗5次,使用15 mL離心管存放,-80 ℃保存備用。

1.2.2 細菌的16S rRNA基因V3～V4區測序

于-80 ℃取出羅氏沼蝦幼體樣品,冰上融化后,按照HiPure Stool DNA Kit說明書方法提取腸道微生物的總DNA。采用PCR擴增細菌16S rRNA V3和V4區,擴增引物為341F(CCTACGG GNGGCWGCAG)和806R(GGACTACHVGGGT ATCTAAT)。反應體系(50 μL)為:10×Buffer KOD 5 μL、2 mmol/L dNTPs 5 μL、25 mmol/L MgSO43 μL、正向引物 (10 μmol/L) 和反向引物 (10 μmol/L)各1.5 μL、KOD 聚合酶 1 μL、模板 DNA 100 ng、超純水補至50 μL。PCR擴增程序為: 94 ℃ 預變性2 min,98 ℃ 變性10 s,62 ℃ 退火30 s,68 ℃ 延伸30 s,30個循環;68 ℃終延伸 5 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒按照說明書方法進行回收,采用ABI StepOnePlus 實時PCR系統進行定量后在Illumina平臺進行PE250測序,測序工作由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.2.3 生物信息學分析

對羅氏沼蝦幼體腸道菌群16S rRNA高通量測序數據進行生物信息學分析,主要分析步驟包括:(1)原始測序序列的拼接和質控:使用FASTP軟件過濾低質量Reads,然后利用FLASH將雙端Reads拼接為Tags,再過濾低質量的Tags,最后使用Usearch軟件的UPARSE算法對運算分類單元進行聚類分析,相似度大于97%的序列聚為一類,計算每個運算分類單元在各個樣品中的Tags絕對豐度和相對信息。(2)采用RDP Classifier的Na?ve Bayesian assignment算法,與GreenGene 數據庫(設定置信度的閾值為0.8～1.0)對代表性運算分類單元進行物種注釋;計算Alpha多樣性;在生物學分類的門水平和科水平進行細微生物群落結構和相對豐度分析,繪制群落Circro圖和堆疊圖,根據物種、樣本間豐度相似性進行聚類,分析樣本細微生物群落門、科水平組成的相似情況以及主要差異。(3)根據運算分類單元的物種注釋和豐度信息,使用PICRUSt軟件進行微生物群KEGG通路功能注釋。(4)使用SPSS 26.0、WPS軟件進行相關數據圖形化處理。

2 結 果

2.1 運算分類單元分析

腸道菌群通過16S rRNA高通量測序及處理,5組樣品共獲得有效序列966 423條,按97%的相似度共劃分出8185個運算分類單元。緬甸種群、斯里蘭卡種群、越南種群、孟加拉種群和自有品種1種群羅氏沼蝦組共有的運算分類單元為256個,每組獨有的運算分類單元分別為131、247、231、144、184個(圖1)。樣本運算分類單元數量依次為越南種群>孟加拉種群>緬甸種群>斯里蘭卡種群>自有品種1種群(圖2),這說明5個種群的羅氏沼蝦樣品均含有較豐富的菌群種類,且核心菌群較相似。

圖1 運算分類單元韋恩圖Fig.1 Veen diagrams of OTUs

圖2 各組運算分類單元數量Fig.2 Column diagram of OTUs in different groups

2.2 Alpha多樣性分析

5組羅氏沼蝦幼體腸道菌群的Alpha多樣性指數見表1。組間平均覆蓋率為99.67%～99.72%,表明試驗所測數據能夠真實反映樣品中菌群的組成,測序深度已經基本覆蓋到樣本中所有的物種,存在新物種的可能性很小。孟加拉種的Chao指數和Ace指數均高于其他4組,表明孟加拉種群幼蝦的腸道菌群物種豐富度最高。各組樣品的香農指數依次為越南種群>斯里蘭卡種群>緬甸種群>孟加拉種群>自有品種1種群,表明羅氏沼蝦越南種群幼蝦的腸道菌群多樣性最高,與運算分類單元的檢測結果相符。各組樣品的辛普森指數依次為斯里蘭卡種群>越南種群>緬甸種群>孟加拉種群>自有品種1種群,表明羅氏沼蝦斯里蘭卡種群幼蝦的腸道菌群種數最多,且各種個體分配更均勻,物種多樣性程度高。

表1 各組樣品的Alpha多樣性指數Tab.1 Alpha-diversity index of the samples in different groups

2.3 腸道菌群整體結構分析

2.3.1 腸道菌群在門水平上的結構分析

在生物分類學門水平上,5組樣品的腸道菌群共注釋到13個門,平均相對豐度大于1%的門有5個,分別為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、藍藻菌門和浮霉菌門。緬甸種群、越南種群、孟加拉種群和自有品種1種群的平均相對豐度排名前3的菌門一致,由大到小依次為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門,只有細菌豐度比例存在一定的差異:緬甸種群為64.43%、32.89%和1.94%;越南種群為77.34%、18.64%和1.80%;孟加拉種群為68.15%、28.56%和1.76%;自有品種1種群的為84.73%、12.65%和0.66%。這4個組的絕對優勢菌門均為變形菌門和擬桿菌門。而斯里蘭卡種群中厚壁菌門的豐度相對較高,其優勢菌門依次為變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門,占比分別為85.32%、7.97%和4.46%(圖3)。

圖3 各組樣品門水平上的菌群群落Circos圖Fig.3 Circro diagram of microbial community on phylum level in different groups

2.3.2 腸道菌群在科水平上的結構分析

在生物分類學科水平上,羅氏沼蝦不同種群幼蝦的腸道菌群結構分析見圖4。各組樣品檢測到的絕對優勢菌科均為腸桿菌科,其他優勢菌科(相對豐度大于1%且排名前4)在各組樣品的分布具有明顯差異。緬甸種群以腸桿菌科(51.05%)、螺旋體科(23.77%)、黃桿菌科(10.42%)和Stappiaceae(7.38%)為優勢菌科;斯里蘭卡種群以腸桿菌科(60.07%)、弧菌科(21.53%)、煙桿菌科(97.23%)和希瓦氏菌科(4.9%)為優勢菌科;越南種群以腸桿菌科(48.31%)、黃桿菌科(15.49%)、弧菌科(10.5%)和Cellvibrionaceae(7.41%)為優勢菌科;孟加拉種群以腸桿菌科(59.37%)、黃桿菌科(26%)、螺旋體科(4.11%)和希瓦氏菌科(3.68%)為優勢菌科;自有品種1種群以腸桿菌科(81.31%)、黃桿菌科(6.01%)、Stappiaceae(4.16%)和螺旋體科(3.8%)為優勢菌科。

圖4 各組樣品科水平上的菌群群落結構及相對豐度Fig.4 The community structure and relative abundance on family level in different groups

2.4 細菌群落功能預測

PICRUSt分析表明,羅氏沼蝦腸道菌群所預測到的功能基因可注釋到KEGG數據庫中6條1級通路以及33條2級通路(平均相對豐度>1%)。1級通路結果表明,基因主要富集在新陳代謝、遺傳信息處理、細胞進程、環境信息處理、生物系統、人類疾病通路中。在5個組中,新陳代謝類通路富集的功能基因均占所有通路富集到的功能基因的約80%(圖5),表明羅氏沼蝦幼蝦腸道菌群的主要功能是參與腸道內各種物質的消化與代謝。2級通路結果表明,基因主要富集在新陳代謝通路中的碳水化合物代謝、氨基酸代謝、維生素代謝、萜類和聚酮類化合物代謝、其他氨基酸代謝、脂質代謝、外源生物降解和代謝、能量代謝和糖基生物合成與代謝等,遺傳信息處理類通路中的復制與修復、折疊、分類和降解,細胞進程類通路中的細胞運動,以及環境信息處理類通路中的膜轉運。

圖5 各組樣品1級通路功能占比Fig.5 Functional proportion of primary pathway in different groups

3 討 論

3.1 羅氏沼蝦幼體腸道菌群結構特征分析

羅氏沼蝦幼體的腸道非常細小,不易分離取出,研究表明,腸道菌群約占個體全部菌群的78%～80%[33-34],而外部使用消毒殺菌的溶劑沖洗,可以成功沖洗掉附著于幼體外表面的細菌[35-36];醫學試驗證明,無菌水的沖洗同樣可以有效清除幼體表面附著的微生物[37-39],故筆者通過使用無菌水的多次沖洗和漂洗,去除羅氏沼蝦幼體表面的微生物,提高試驗的準確性,以提取到的羅氏沼蝦幼體總菌群DNA來代替腸道菌群。

水生生物的優勢菌群多以變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門等為主[27-30]。通過16S rRNA高通量測序技術對羅氏沼蝦不同種群幼體的菌群結構進行檢測,發現羅氏沼蝦緬甸種群、斯里蘭卡種群、越南種群、孟加拉種群和自有品種1種群幼體的腸道菌群優勢菌門前3位均為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門,是羅氏沼蝦幼體的核心菌群。變形菌門內細菌種類豐富,涵蓋了極為廣泛的生理代謝類型[40],其中弧菌科細菌的代謝產物會引發細胞衰亡和慢性炎癥,是引起慢性腸道疾病的主要因素[41],腸桿菌科的細菌可以將非必需氨基酸轉化為必需氨基酸或蛋白質[42],但在蝦患病時,其豐度的升高會造成健康蝦類中丁酸的豐度降低,從而造成抵抗力下降[43]。本試驗結果顯示,5個種群的腸道菌群中變形菌門均為最優勢菌(豐度均大于60%),對宿主蝦的生長快慢和健康與否起決定性作用。擬桿菌門中的黃桿菌科細菌可以分解復雜的高分子物質[36],腸擬桿菌(Bacteroidesintestinalis)和卵擬桿菌(B.ovatus)等可以降解木聚糖[44-45]、阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)和果膠等植物多糖[46]。厚壁菌門則更傾向于分解多糖和多脂類物質[47]。本試驗結果中,只有斯里蘭卡種群的厚壁菌門豐度大于擬桿菌門,表明斯里蘭卡種群對飼料中的多脂類物質分解更加充分,宿主蝦也更容易吸收脂類物質。由此可知,核心菌群主要參與生產生命活動必需物質以及分解腸道中最難分解的高分子物質,筆者認為,在羅氏沼蝦幼體階段可以通過改變其飼料中蛋白質、多糖等高分子物質的成分比例,來改變蝦腸道核心菌群的種類和豐度,這可為研究羅氏沼蝦腸道菌群和宿主免疫以及宿主食性之間的聯系提供前期資料。

與本研究結果類似:Zhang等[29]發現,克氏原螯蝦腸道菌群中的優勢菌群為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門;曾晨爔等[30]發現日本囊對蝦的腸道中的優勢菌群為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和梭桿菌門。金若晨[27]研究表明,健康和患病的凡納濱對蝦腸道菌群中的優勢菌門均為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門,與本試驗研究結果存在差異的是菌門的豐度大小不同,這可能是由于試驗蝦的種類不同所致。洪斌等[48]在對比研究凡納濱對蝦和羅氏沼蝦的腸道微生物的過程中發現,羅氏沼蝦腸道中的優勢菌門為厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門。董學興等[32]研究不同養殖條件下羅氏沼蝦的腸道菌群,發現其不同養殖條件下的優勢菌門相類似,單養羅氏沼蝦的優勢菌群為變形菌門和厚壁菌門。這與本試驗結果差異較大,可能是因為養殖環境、養殖時間等的不同,或因試驗所用羅氏沼蝦所處的成長階段有很大差別。以上研究結果表明,正常健康蝦類的腸道菌群優勢菌門均為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門,不同種類蝦以及同種蝦不同種群間的腸道菌群結構存在一定的共性,但物種豐度存在差異,同時也證明了筆者采用羅氏沼蝦幼體直接進行16S rRNA測序開展腸道菌群研究的可信度與可行性。

3.2 羅氏沼蝦幼體腸道菌群功能預測分析

本研究中PICRUSt功能預測結果顯示,羅氏沼蝦腸道菌群的基因功能主要與新陳代謝類功能有關,包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝等,表明腸道菌群積極參與了羅氏沼蝦的基礎生理代謝過程。有研究表明,腸道菌群參與控制能量代謝[49]與氨基酸代謝[50],向宿主提供營養,與宿主建立共生關系,與宿主的免疫系統相互作用[51]。這主要是由優勢菌門基因功能決定的。變形菌門內的一些細菌會進行氨基酸代謝為宿主提供生存的必要條件[43];擬桿菌門和厚壁菌門是魚蝦等水生動物體內的益生菌[52];厚壁菌門與擬桿菌門的比值降低,可以降低脂肪沉積,改善肌肉的風味[53]。故筆者推測,本研究中羅氏沼蝦腸道中厚壁菌門與擬桿菌門的比值同樣會影響蝦肉的風味,兩菌門比值在斯里蘭卡種群中大于1,在其他4個種群中小于1,猜測斯里蘭卡種群的肉質會比其他種群含脂質多,相關驗證還需后期對各種群蝦的肌肉營養成分進行檢測。筆者認為,在之后的生產中,可以因此改變腸道菌群的種類和豐度,生產出符合市場口味的羅氏沼蝦。

4 結 論

羅氏沼蝦的腸道菌群結構,不同種群之間存在共性,其優勢菌門為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門,同時又存在一定的差異。不同種群羅氏沼蝦幼體腸道菌群研究,可為進一步研究不同種群羅氏沼蝦的生長發育機制打下基礎。另外,腸道菌群的優勢菌門在羅氏沼蝦的碳水化合物代謝、氨基酸代謝和能量代謝活動中發揮了主要作用,也可為開發羅氏沼蝦幼體孵育益生菌提供參考。