金邊鯉肌球蛋白結合蛋白C3基因的克隆與表達分析

韋玲靜,呂業堅,甘寶江,黃 杰,劉 康,張 盛,滕忠作,莫飛龍,葉香塵

( 1.廣西壯族自治區水產引育種中心,廣西 南寧 530031; 2.柳州市漁業技術推廣站,廣西 柳州 545006 )

皮膚是魚類的重要組織器官,具有多種不同的顏色。魚的膚色和著色模式與其交配、信息傳遞和生理調節等生物學活動息息相關,同時膚色也是水產養殖中重要的經濟表型特征。遺傳條件是影響魚類膚色的主要因素[1]。已有研究人員提出了魚類皮膚著色遺傳基礎的初步見解[2-4]。真黑素主要產生黑色和棕色皮膚表型,而褐黑素主要產生黃色和紅色皮膚表型[5],這2種色素均通過黑色素合成途徑產生。目前已發現的與皮膚色素沉著相關的遺傳信號通路有黑色素合成通路、細胞外因子/β-連環蛋白信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路等,其中涉及的體色調控相關基因包括酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關蛋白1(TYRP1)、酪氨酸酶相關蛋白2(TYRP2)和黑素皮質激素受體1(MC-1R)、灰鼠信號蛋白、小眼畸形相關轉錄因子和黑色素濃集素等[6-8]。然而魚類皮膚顏色調控分子機制尚不十分清楚,各色素沉著相關基因及其調節網絡還需要進一步研究。

金邊鯉(Cypinuscarpio)是針對稻田養殖而選育出的鯉魚新品系。金邊鯉的原始選育群體中有黑色和金邊2種膚色個體,其中金邊個體數約占30%,其背部金色皮膚面積較小,呈斷續狀未連成條帶。而經選育后的金邊鯉,其背部金色條帶面積增大呈連續狀,并且能夠穩定遺傳[9]。在前期的研究工作中,筆者主要對金邊鯉的皮膚顏色差異、群體遺傳結構、肌肉營養成分、腸道菌群等方面進行了系統分析[10-14]。在金邊鯉皮膚轉錄組和蛋白質組差異表達分析中,2個組學分析均富集到了肌球蛋白結合蛋白C3(MyBPC3),且金色皮膚中的MyBPC3 mRNA和蛋白表達量顯著低于黑色皮膚,認為肌球蛋白結合蛋白C3可能與金邊鯉皮膚顏色變異調控機制有關,這與前人對魚類皮膚色素沉著相關研究結果多有不同。

肌球蛋白結合蛋白C(MyBPC)是一種胞內多膜結構蛋白,屬于免疫球蛋白和纖維連接蛋白超家族[15]。MyBPC位于肌小節A帶C區中粗肌絲兩端肌球蛋白頭部的連接處,連接原肌球蛋白、肌聯蛋白和肌動蛋白,是粗肌絲的重要組成部分,具有維護肌小節的完整性和結構的穩定性功能,并通過磷酸化作用參與肌小節的收縮和舒張功能調節[16-19]。MyBPC基因具有3種不同的亞型:慢骨骼肌型MyBPC1、快骨骼肌型MyBPC2和心肌型MyBPC3。通常認為2種骨骼肌型MyBPC1/2基因只特異性表達于骨骼肌中,而MyBPC3基因特異性表達于心肌細胞[20]。人MyBPC3基因發生突變已被證實與心臟疾病的風險有關,是肥厚性心肌病發生的主要因素,因此該基因成為心血管疾病相關研究的熱點[21-22]。

目前國內外關于MyBPC3基因的研究主要集中在哺乳動物上,尚未有關于鯉MyBPC3基因克隆和表達分析的相關報道。筆者克隆金邊鯉心臟組織中MyBPC3基因,分析其結構和組織表達特性,并探索該基因與黑色素合成相關基因TYR、TYRP1、TYRP2和MC-1R的關系,為初步研究金邊鯉皮膚色素沉著差異分子調控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用金邊鯉取自廣西壯族自治區水產引育種中心武鳴基地。試驗魚有金邊鯉和無金邊鯉 (3月齡)均為同一池塘養殖,體質量(74.74±0.92) g。試驗分別采集8尾有金邊鯉和8尾無金邊鯉的大腦、心臟、皮膚、肌肉、肝臟、脾臟、腎臟和腸道共8種組織樣品于2 mL凍存管中(圖1)。樣品用液氮速凍后轉入—80 ℃冰箱保存備用。

圖1 不同皮膚顏色金邊鯉個體Fig.1 Jinbian carp with different skin coloursa.有金邊鯉;b.無金邊鯉.a.common carp with yellow skin; b.common carp with black skin.

1.2 總RNA提取和cDNA合成

各組織總RNA采用Trizol法提取,電泳和超微量分光光度計檢測RNA完整性、濃度和純度。采用TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京全式金)合成cDNA第1鏈,用于中間片段擴增;采用TransScript All-in-One First-Stand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒(北京全式金)合成cDNA用于qPCR。

1.3 中間片段擴增

根據GenBank中鯉(XM_019108924)、鯽(Carassiusauratus)(XM026215405)和斑馬魚(Daniorerio)(NM_001044349)預測的MyBPC3基因序列,設計3對引物(MyBPC3-F1、R1、F2、R2、F3、R3)(表1)用于擴增MyBPC3基因中間片段。PCR反應體系(20.0 μL):cDNA 1.0 μL,引物F和R各0.5 μL(10 μmol/L),PCR Mix 10.0 μL,雙蒸水 8.0 μL;反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,32個循環;72 ℃ 5 min。PCR產物電泳檢測后測序。

表1 MyBPC3基因擴增引物序列Tab.1 Primer sequences of MyBPC3 gene amplification

1.4 5′ RACE和3′ RACE擴增

根據中間片段測序結果,采用Oligo 7.0軟件設計RACE引物MyBPC3 5′-GSP1、MyBPC3 5′-GSP2、MyBPC3 3′-GSP1、MyBPC3 3′-GSP2。UPM-long用于RACE第1輪PCR的通用引物,UPM-short用于RACE巢式PCR的通用引物(表1)。采用SMART RACE 5′/3′ Kit試劑盒(Clontech)進行RACE cDNA合成及PCR擴增。第1輪RACE PCR模板為cDNA,反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,5個循環;94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,70 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,5個循環;94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,25個循環;72 ℃ 10 min。以第1輪PCR反應產物(稀釋50倍)為模板,采用TransStart GoldPfu PCR Mix(北京全式金)進行第2輪反應,反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,25個循環;72 ℃ 10 min。擴增產物經純化克隆后測序,測序結果采用SeqMan軟件進行拼接,獲得完整的cDNA序列。

1.5 MyBPC3基因表達分析

根據擴增獲得的cDNA序列設計合成定量引物MyBPC3-DF和MyBPC3-DR,以β-actin為內參基因(表1)。以稀釋20倍的cDNA為模板,以TransStart Top Green qPCR SuperMix為反應試劑進行定量擴增。反應體系(20.0 μL):cDNA 2.0 μL,primer F 和R各0.5 μL(10.0 μmol/L),PCR Mix 10.0 μL,雙蒸水 7.0 μL。反應條件:94 ℃ 5 min,94 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,41個循環。每個樣品設置3個平行。同時利用本課題組前期研究已發表的金邊鯉皮膚黑色素合成相關基因(TYR、TYRP1、TYRP2和MC-1R)的相對表達量數據[23]與MyBPC3基因表達量數據結果進行相關性分析。

1.6 序列分析及數據處理

利用在線分析軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找MyBPC3基因開放閱讀框及其對應編碼氨基酸序列;利用在線工具ExPASY ProtPAram Tool (https://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白質的理化特性;利用NetPhos 3.0 server、TMHMM和SignalP 5.1等在線軟件預測蛋白磷酸化位點、跨膜結構和信號肽區域;利用Clustal X2和MEGA 7.1軟件進行氨基酸序列多重比對和系統進化樹構建(鄰接法,自展值為1000);利用WISS-MOEDL在線軟件預測蛋白三級結構;利用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量并利用Sigma Plot 12.5軟件作圖。

2 結 果

2.1 MyBPC3序列特征

金邊鯉MyBPC3基因cDNA全長為4253 bp,ORF為3783 bp,編碼1260個氨基酸。其5′非編碼區(5′UTR)為44 bp,3′非編碼區(3′UTR)為427 bp,末端含有AATAAA的加尾識別信號和28個堿基的poly(A)結構(圖2)。在線軟件預測可知,MyBPC3蛋白分子式為C6288H9961N1709O1908S48,分子質量為141.57 ku,理論等電點為6.42,半衰期為30 h,不穩定指數為38.80,總平均疏水性指數為-0.505,為親水性酸性蛋白,無信號肽和跨膜結構。MyBPC3共有119個潛在的蛋白磷酸化位點,其中PKC磷酸化位點21個,PKA磷酸化位點5個,屬于高度磷酸化蛋白(圖2)。MyBPC3蛋白的三級結構呈現環狀三角結構(圖3a、b)。

圖2 金邊鯉MyBPC3基因的cDNA全長序列及對應氨基酸序列Fig.2 The nucleotide and amino acid sequences of the cDNA of MyBPC3 in Jinbian carp C. carpio黑色方框標示起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA);圓圈表示PKC磷酸化位點,六邊形表示PKA磷酸化位點;粗體下劃線表示3′-UTR端AATAAA序列;粗體表示為poly(A).The AA corresponding to start codon (ATG) and termination codon (TAA) is shown in the black box; circles represent PKC phosphorylation sites, hexagon represent PKA phosphorylation sites; the nucleotides corresponding to the polyadenylation signal in the 3′-untranslated region (AATAAA) are marked with bold and underlined; the poly (A) is marked with bold.

圖3 金邊鯉MyBPC3蛋白二級和三級結構預測Fig.3 Prediction of the second structure and tertiary structure of MyBPC3 protein in Jinbian carp C. carpioa.MyBPC3三級結構卡通模型; b.MyBPC3三級結構空間立體球模型.a.Cartoon model of tertiary structure of MyBPC3; b.Space fill model of tertiary structure of MyBPC3.

2.2 MyBPC3同源性比較與進化樹分析

圖4 基于MyBPC3氨基酸序列的鄰接系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of MyBPC3 based on Neighbor-Joining method of species amino acid sequence

2.3 MyBPC3基因的組織表達特性

以腎臟組織為參考,qRT-PCR檢測MyBPC3基因mRNA在金邊鯉不同組織中的相對表達量。結果顯示:MyBPC3在檢測的8個組織中均有表達,其中在心臟中的表達量最高,顯著高于大腦、皮膚、肌肉、脾臟、肝臟、腸道和腎臟組織(P<0.05)(圖5);同時MyBPC3基因在金邊個體的心臟和皮膚中的表達量顯著低于黑色個體(P<0.05)。

圖5 MyBPC3基因在不同組織中的相對表達量Fig.5 Expression levels of MyBPC3 gene in difference tissuesHe.心臟;Br. 腦;Sk. 皮膚;Mu. 肌肉;Sp. 脾臟;Li. 肝臟;Gu. 腸道;Ki. 腎臟.圖中不同大寫字母表示不同組織表達差異顯著(P<0.05),小寫字母表示同種組織表達差異顯著(P<0.05).He. heart; Br. brain; Sk. skin; Mu. muscle; Sp. spleen; Li. liver; Gu. gut; Ki. kidney; different capital letters indicate significant difference in different tissues (P<0.05), different letters indicate significant difference in the same tissues (P<0.05).

2.4 MyBPC3與黑色素合成相關基因的相關性分析

MyBPC3基因與黑色素合成相關基因表達水平的相關性分析結果顯示,MyBPC3與TYR、TYRP1、TYRP2及MC-1R均呈正相關,其中與TYR、TYRP2及MC-1R基因相關性顯著(P<0.05)(圖6)。

圖6 MyBPC3基因與黑色素合成相關基因TYR(a)、TYRP1(b)、TYRP2(c)和MC-1R(d)的相關性分析Fig.6 Correlation analysis of MyBPC3 and related genes TYR(a), TYRP1(b), TYRP2(c) and MC-1R(d) of melanin synthesis

3 討 論

3.1 MyBPC3基因序列及結構特點

目前已有文獻報道了多個物種的MyBPC3序列和功能信息,其中研究較為深入的主要集中在小鼠和人類等哺乳動物上,關于魚類的相關研究甚少[24-26]。筆者從金邊鯉心臟組織中克隆獲得了MyBPC3的cDNA序列全長,其開放閱讀框長3783 bp,編碼1260個氨基酸。MyBPC3無信號肽和跨膜結構,為胞內蛋白。同源性比較和系統進化樹分析顯示,MyBPC3與鯽和斑馬魚的親緣關系較近,與原雞、小鼠和智人等禽類和哺乳類的進化距離分別為0.12、0.16和0.16,表明MyBPC3在各物種進化過程中相對保守。

3.2 MyBPC3基因組織表達特點

不同MyBPC亞型在心肌和骨骼肌中都有不同的調控,在MyBPC3缺失的情況下,骨骼亞型可以在心臟發生轉補體[20]。Dhoot等[27]認為骨骼肌和心肌MyBPC通常主要表達于相應的組織中,但是MyBPC1和MyBPC2在心臟組織中也有表達,同樣MyBPC3在骨骼組織中也可表達。Ward等[28]發現MyBPC3在鳥類和兩棲類動物的骨骼肌發育中均有表達。本試驗中MyBPC3基因在金邊鯉心臟、腦、皮膚和肌肉等組織中均有表達,其中在心臟中的表達量最高,為主要效應組織,這與已有研究的人MyBPC3基因組織表達的結果基本一致[29]。同時筆者還發現,MyBPC3基因在金邊個體的心臟和皮膚中的表達量均顯著低于黑色個體,推測其表達差異可能與其皮膚顏色變異有關。

3.3 MyBPC3功能與金邊鯉體色變異的關系

MyBPC3通常以磷酸化形式存在于血清中。腎上腺素能受體激活、膽堿能受體激活、內皮素、Ca2+等均可引起MyBPC3磷酸化,且主要通過蛋白激酶和鈣/磷脂依賴性蛋白激酶途徑進行[30-31]。在受到β-腎上腺素刺激時,MyBPC3通過磷酸化作用于肌聯蛋白、肌動蛋白和肌球蛋白,加速橫橋與肌動蛋白結合,調節肌絲運動[32-33]。筆者預測得到MyBPC3的多個PKA和PKC磷酸化位點,推測這些磷酸化位點在調節肌絲的收縮和舒張功能上發揮重要作用。黑色素是存在于脊椎動物體內的主要色素,其生物合成由多種酶類參與,并受多基因調控[34-35]。大量研究已證實,黑素皮質激素受體1、酪氨酸酶、酪氨酸相關蛋白1、酪氨酸相關蛋白2是調控黑色素合成途徑中的主要基因[5,36-38]。細胞骨架和肌絲微管相關蛋白參與黑色素在角質形成細胞內的分布和運動,肌動蛋白可作為黑素體的運輸馬達,與肌球蛋白一同為黑素體轉運提供動力[39]。筆者在前期的金邊鯉皮膚轉錄組研究中富集到了與細胞骨架和肌絲蛋白的相關基因,包括心肌肌球蛋白結合蛋白基因(MyBPC2和MyBPC3)、肌動蛋白基因(ACTC1和ACT3)、肌球蛋白基因(MYH1、MYH2、MYH6和MYH7)、肌漿球蛋白基因(TPM1、TPM2和TPM3),這些基因均在金邊個體皮膚中表達下調,并發現,除了MyBPC2和MyBPC3基因,其余的均為心肌腎上腺素信號通路中的基因[10]。有研究顯示,β2腎上腺素能受體通過G蛋白-腺苷酸環化酶-蛋白激酶A(GS-AC-PKA)途徑調節酪氨酸酶活性及其相關基因,從而影響黑色素的合成[40]。本研究中,金邊鯉皮膚中MyBPC3基因表達量與黑色素合成相關基因TYR、TYRP2及MC-1R基因均為顯著正相關,且金邊個體皮膚中的MyBPC3表達量下調,推測MyBPC3可能通過心肌腎上腺素信號通路間接參與黑色素合成以及調節黑色素在角質形成細胞的分布和運動,從而形成了金邊鯉皮膚色素沉著差異。

4 結 論

筆者從金邊鯉的心臟組織中克隆獲得了MyBPC3基因序列,其開放閱讀框為3783 bp,編碼1260個氨基酸。金邊鯉MyBPC3與鯽的進化地位最為接近。組織表達分析和相關性分析結果顯示,MyBPC3基因與黑色素合成相關基因TYR、TYRP2及MC-1R基因均為顯著正相關,且其在金邊個體的心臟和皮膚中表達量顯著低于金邊個體(P<0.05)。結果表明,MyBPC3基因可能影響金邊鯉皮膚黑色素的合成,其基因表達差異可能是金邊鯉皮膚顏色差異形成的原因。該結果可為研究金邊鯉皮膚色素沉著差異調控機制提供參考。