克氏原螯蝦前列腺素E2受體EP4基因的序列特征及表達(dá)分析

江紅霞,張 冉,李屹錚,劉雪巍,張帥帥,于 淼,王 磊,張 猛,喬志剛,李學(xué)軍

( 河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院,水產(chǎn)動(dòng)物疾病控制河南省工程實(shí)驗(yàn)室,河南省水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,河南 新鄉(xiāng) 453007 )

前列腺素(PG)廣泛存在于動(dòng)物體的各種組織和體液中,主要包括前列環(huán)素I2(PGI2)、前列腺素E2(PGE2)、前列腺素F2α(PGF2α)、前列腺素D2(PGD2)和血栓素A2(TxA2),由環(huán)氧合酶(COX)途徑代謝產(chǎn)生[1],在炎癥、免疫反應(yīng)、心血管控制和大多數(shù)動(dòng)物的繁殖中發(fā)揮著積極的作用[2]。而其中的PGE2則與許多雌性節(jié)肢動(dòng)物的卵巢和卵母細(xì)胞的發(fā)育有關(guān),如:PGE2量的增加可以促進(jìn)日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)處于卵黃發(fā)生階段的卵巢的發(fā)育[3];給斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)飼喂含有PGE2的多毛類動(dòng)物,卵母細(xì)胞發(fā)育速度和排卵效率有提高[4];給普通黃道蟹(Oziotelphusasenexsenex)施加PGE2,其性腺指數(shù)和卵母細(xì)胞直徑以劑量依賴性方式不斷增加[5]。

PGE2通過結(jié)合其特異性受體發(fā)揮功能。現(xiàn)已鑒定出4種不同的PGE2受體,分別為EP1、EP2、EP3和EP4。早期的研究指出,EP4分布十分廣泛,其mRNA幾乎在大鼠(Rattusnorvegicus)所有的組織中都能檢測(cè)到[6]。雖然可以與EP4相結(jié)合的前列腺素類似物眾多,但是其與PGE2的親和力是最高的[7]。已有研究顯示,EP4在動(dòng)物體的卵巢發(fā)育、排卵和生殖調(diào)控方面也具有重要的作用,如Segi等[8]的研究表明,小鼠(Musmusculus)的卵巢在超排過程中表達(dá)大量的EP4 mRNA,且其原位雜交結(jié)果顯示EP4 mRNA信號(hào)主要定位于腔前卵泡的卵母細(xì)胞,這些結(jié)果充分地證明EP4在排卵反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用。Bayne等[9]的研究也發(fā)現(xiàn),在人的原始生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有EP4的表達(dá),且對(duì)一些重要的生殖調(diào)控基因的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii),屬節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱十足目螯蝦科原螯蝦屬,俗名淡水小龍蝦,是我國(guó)重要的淡水蝦類養(yǎng)殖品種。克氏原螯蝦營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美,深受人們的喜愛,近幾年的價(jià)格也一路攀升,在我國(guó)具有非常重要的經(jīng)濟(jì)地位,據(jù)《2020中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》[10]數(shù)據(jù)顯示,2019年,全國(guó)克氏原螯蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到208.9604萬t,在淡水甲殼動(dòng)物養(yǎng)殖中位居第一位。隨著克氏原螯蝦在我國(guó)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)需要在同一時(shí)期內(nèi)提供規(guī)格整齊的苗種,因此,如何促進(jìn)克氏原螯蝦卵巢同步發(fā)育和排卵已成為克氏原螯蝦規(guī)模化養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中重要的研究課題。

筆者從克氏原螯蝦卵巢轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中得到EP4基因的包含有完整的開放閱讀框的cDNA序列,命名為PcEP4基因,對(duì)該基因的cDNA序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析及表達(dá)模式的檢測(cè),并檢測(cè)注射PGE2后雌蝦卵巢中PcEP4基因的表達(dá)變化和蝦的抱卵率變化,以期為克氏原螯蝦卵巢同步發(fā)育和排卵的調(diào)控研究提供一定的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用蝦取自河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地,養(yǎng)殖水溫20～25 ℃,每日早晚各投喂商品飼料1次,1周換水1次。采集卵巢發(fā)育處于成熟期(Ⅴ期)的雌性克氏原螯蝦(25±5) g的不同器官、組織樣品,包括卵巢、肝胰腺、心臟、胃、腸道、腦、眼柄、肌肉、鰓和腹神經(jīng)索共10種;采集成年雌蝦的Ⅰ～Ⅵ期的不同發(fā)育階段的卵巢樣品(Ⅰ期:卵原細(xì)胞增殖期;Ⅱ期:卵黃發(fā)生前期;Ⅲ期:初級(jí)卵黃發(fā)生期;Ⅳ期:次級(jí)卵黃發(fā)生期;Ⅴ期:成熟期;Ⅵ期:恢復(fù)期),卵巢分期參照李勝等[11]方法進(jìn)行。每種試驗(yàn)樣品采集6尾蝦,樣品獲得后立即放入RNA保存液(天根,北京)中,并于冰箱-80 ℃保存,直到進(jìn)行RNA的提取。

1.2 PcEP4基因cDNA序列的獲得

利用RNA提取試劑盒(Omega公司)提取克氏原螯蝦Ⅴ期卵巢組織的總RNA,提取步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo,美國(guó))和1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度、純度和完整性,檢測(cè)合格后,將卵巢RNA樣品(20尾蝦的混合樣)送上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,建立克氏原螯蝦卵巢cDNA文庫(kù),從文庫(kù)中獲得PcEP4基因的轉(zhuǎn)錄本序列,包含完整的開放閱讀框。

1.3 PcEP4基因序列的生物信息學(xué)分析

使用在線軟件對(duì)PcEP4基因進(jìn)行序列分析,在線網(wǎng)址為: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/orfig.cgi(基因開放閱讀框的預(yù)測(cè))、http://web.expasy.org/compute_pi/(蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量以及理論等電點(diǎn)的預(yù)測(cè))、http://www.dabi.temple.edu/disphos/(蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè))、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/(蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè))、http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/(蛋白的跨膜螺旋預(yù)測(cè))和https://swissmodel.expasy.org/interactive(蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè))等。通過Predict Protein軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位,應(yīng)用ClustalX 2程序進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì),應(yīng)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 PcEP4基因在不同組織和不同發(fā)育階段的卵巢中的表達(dá)分析

PcEP4基因在克氏原螯蝦成蝦的不同組織和不同發(fā)育階段的卵巢中的表達(dá)模式利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行。首先利用RNA試劑盒(Omega公司)提取克氏原螯蝦的不同樣品的總RNA。利用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)(Thermo,美國(guó))和1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度、純度和完整性。以RNA為模板,使用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒合成用于qPCR反應(yīng)的cDNA。依據(jù)PcEP4基因cDNA序列在其開放閱讀框區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量引物,上、下游引物分別為5′-GCTGGTGGAACCCTGTCATC-3′和5′-CCTCATA-CTCGTGGGCTCGT-3′,擴(kuò)增片段大小為 158 bp;以18S rRNA作為內(nèi)參基因,上、下游引物分別為 5′-TATACGCTAGTGGAGCTGGAA-3′和5′-GGGGAG-GTAGTGACGAAAAAT-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad,USA)進(jìn)行操作,反應(yīng)體系按SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa,大連)試劑的說明書配制;反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán);72 ℃ 30 s。其中每個(gè)樣品的目的基因和內(nèi)參基因分別進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法[12]計(jì)算PcEP4基因在不同組織和不同發(fā)育階段的卵巢中的相對(duì)表達(dá)量。利用SPSS 20.0軟件對(duì)各數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,并進(jìn)行LSD多重比較和鄧肯多重比較,當(dāng)P<0.05時(shí)表明具有顯著性差異。所有圖片采用GraphPad Prism 5軟件繪制,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

1.5 PGE2注射試驗(yàn)

PGE2粉劑(購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司,美國(guó))溶于磷酸鹽緩沖液,配制成2 mg/mL的PGE2母液。挑選卵巢發(fā)育處于Ⅴ期的克氏原螯蝦分成2組,每組80尾蝦,試驗(yàn)組用微量注射器在第2腹節(jié)處按照1.0 μg/g體質(zhì)量的劑量[13]肌肉注射20 μL由母液稀釋后的不同質(zhì)量濃度的PGE2溶液,對(duì)照組注射同體積的磷酸鹽緩沖液。在注射后的0、12、24、36、48、60、72 h,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組各取6尾未抱卵蝦,解剖取其卵巢,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PGE2注射對(duì)克氏原螯蝦卵巢中PcEP4基因表達(dá)量的影響。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法同1.4部分。統(tǒng)計(jì)72 h后各組中所剩的抱卵蝦占總蝦數(shù)的百分比。在整個(gè)試驗(yàn)過程中有少量蝦的死亡,對(duì)照組死亡率為15%,試驗(yàn)組死亡率為17.5%。總蝦數(shù)為除去死亡和解剖后所剩的活蝦。

2 結(jié) 果

2.1 PcEP4基因cDNA和氨基酸序列分析

PcEP4基因開放閱讀框2505 bp,共編碼835個(gè)氨基酸,推導(dǎo)的蛋白分子質(zhì)量為93.246 ku,理論等電點(diǎn)為8.29,分子式為C4123H6363N1197O1216S34。在其氨基酸組成中,含量最高的是蘇氨酸,占 9.7%,其次是絲氨酸和亮氨酸,各占9.0%和8.6%。另外,在該氨基酸序列上預(yù)測(cè)到35個(gè)磷酸化位點(diǎn),包含14個(gè)絲氨酸、15個(gè)蘇氨酸、6個(gè)酪氨酸,預(yù)測(cè)到2個(gè)糖基化位點(diǎn),分別位于第49位和第173位氨基酸處。在該氨基酸序列上還預(yù)測(cè)到有7個(gè)跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)域序列,分別位于第61～87、97～123、135～165、177～199、226～255、282～312和323～348位氨基酸處。跨膜α-螺旋序列及附近共有41個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成配體結(jié)合口袋(圖1)。

2.2 PcEP4氨基酸序列同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心BLASTP軟件,將克氏原螯蝦與其他已知?jiǎng)游锏腅P4氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì),結(jié)果顯示,克氏原螯蝦的EP4氨基酸序列與其他已知?jiǎng)游锏南嗨菩詾?2%～50%,其中:與甲殼動(dòng)物凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)的相似性最高,為49.1%;與魚類中的斑馬魚(Daniorerio)和軟體動(dòng)物真蛸(Octopusvulgaris)的相似性次之,分別為32.2%和32.1%;與哺乳動(dòng)物智人(Homosapiens)的相似性最低,為30.1%(表1)。

表1 克氏原螯蝦與其他動(dòng)物EP4氨基酸序列的同源性比對(duì)Tab.1 Comparative identity of amino acid sequence of EP4 between P. clarkii and other animals

利用Predict Protein軟件對(duì)EP4進(jìn)行了亞細(xì)胞定位,EP4定位于細(xì)胞膜部位(圖2a)。利用Expasy在線軟件預(yù)測(cè)了EP4的三維結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)該蛋白具有7個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)(圖2b),結(jié)合TMHMM軟件的跨膜螺旋預(yù)測(cè),得知這是7個(gè)跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)。使用Clustal X2將克氏原螯蝦EP4氨基酸序列與其他動(dòng)物的進(jìn)行多重比對(duì),發(fā)現(xiàn)他們均具有7個(gè)跨膜α-螺旋區(qū),2個(gè)半胱氨酸殘基形成的1個(gè)二硫鍵,3個(gè)配體結(jié)合殘基和1個(gè)能與PGE2的羧基相結(jié)合的以精氨酸為中心的三聯(lián)體,其氨基酸序列結(jié)構(gòu)見圖3。利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)EP4進(jìn)化樹分為兩大支,脊椎動(dòng)物聚為一支,無脊椎動(dòng)物聚為一支,克氏原螯蝦EP4與其他無脊椎動(dòng)物的聚為一支,并與其中的凡納濱對(duì)蝦的親緣關(guān)系最近(圖4)。

圖2 預(yù)測(cè)的EP4的亞細(xì)胞定位(a)和三維結(jié)構(gòu)(b)Fig.2 The predicted subcellular localization (a) and three-dimensional structure (b) of EP4圖a中預(yù)測(cè)的EP4定位部分以綠色進(jìn)行突出顯示.The predicted positioning part of EP4 in figure (a) is highlighted in green.

圖4 基于EP4氨基酸序列的鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree based on amino acid sequences of EP4線的長(zhǎng)度與遺傳距離成正比,克氏原螯蝦用“▲”表示.The length of the phylogenetic tree identified the genetic distance, and the EP4 of P. clarkii was marked by “▲”.

2.3 PcEP4基因的組織表達(dá)模式

PcEP4基因在成體克氏原螯蝦不同組織中的表達(dá)模式見圖5。由圖5可見,PcEP4基因在所檢測(cè)的10個(gè)組織中均有表達(dá),但在成熟期卵巢中的相對(duì)表達(dá)量最高,其次是腦,在鰓中的表達(dá)量最低。PcEP4基因在成熟期卵巢中的表達(dá)量顯著高于其他9種組織(P<0.05)。腸道、眼柄和鰓中的PcEP4基因的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

圖5 PcEP4基因在成年克氏原螯蝦各組織中的表達(dá)模式Fig.5 Expression pattern of PcEP4 gene in different tissues of adult P. clarkii1.成熟期卵巢;2.肝胰腺;3.心臟;4.胃;5.腸道;6.腦;7.眼柄;8.肌肉;9.鰓;10.腹神經(jīng)索;不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同.1.ovary; 2.hepatopancreas; 3.heart; 4.stomach; 5.intestines; 6.brain; 7.eyestalk; 8.muscle; 9.gill; 10.ventral nerve cord; means with different lowercase letters are significant differences (P<0.05), et sequentia.

2.4 PcEP4 基因在不同發(fā)育階段的卵巢中的表達(dá)模式

PcEP4基因表達(dá)量隨著克氏原螯蝦卵巢的發(fā)育呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)(圖6)。 PcEP4基因的表達(dá)量在Ⅰ～Ⅴ期的卵巢中隨著卵巢的發(fā)育逐漸升高,在Ⅴ期卵巢中達(dá)到最大值,然后在Ⅵ期卵巢中又下降。Ⅴ期卵巢中PcEP4基因的表達(dá)量顯著高于其他5個(gè)時(shí)期的卵巢(P<0.05),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅵ期卵巢中PcEP4基因的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

圖6 PcEP4基因在克氏原螯蝦不同發(fā)育時(shí)期卵巢中的表達(dá)模式Fig.6 Expression pattern of PcEP4 gene in different ovarian stages of P. clarkii

2.5 PGE2注射對(duì)克氏原螯蝦卵巢中PcEP4基因表達(dá)和抱卵率的影響

PGE2注射36 h后,卵巢中的PcEP4基因表達(dá)量與對(duì)照組相比極顯著上升(P<0.01),注射48、60 h后,PcEP4基因表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著上升(P<0.05),而PGE2注射后0、12、24、72 h的PcEP4基因表達(dá)量與對(duì)照組均無顯著差異(P>0.05)(圖7a)。PGE2注射72 h后,對(duì)照組有11.7%的蝦抱卵,而注射組有40.0%的蝦抱卵,PGE2注射組蝦的抱卵率高于對(duì)照組(圖7b)。

圖7 PGE2對(duì)克氏原螯蝦卵巢中PcEP4基因表達(dá)(a)及抱卵率(b)的影響Fig.7 Effect of PGE2 on PcEP4 gene expression in ovary (a) and holding egg rate (b) of P. clarkii**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01),*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05).** represent extremely significant difference at the level of P<0.01 from control, * represent significant difference at the level of P<0.05 from control.

3 討 論

蝦蟹類作為我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖甲殼動(dòng)物,其性腺發(fā)育的調(diào)控機(jī)制越來越受到人們的重視。目前,在水產(chǎn)甲殼動(dòng)物的規(guī)模化繁育中,人工摘除眼柄的方法由于其有效性和方便性而廣泛應(yīng)用,以促進(jìn)雌性蝦蟹的卵巢的同步發(fā)育、快速成熟并提高其抱卵量[14-18]。但眼柄摘除會(huì)使親蝦親蟹失去性腺抑制激素的調(diào)控,進(jìn)而使后期卵巢發(fā)育成熟和排卵的速度過快,導(dǎo)致卵黃積累不足,卵子質(zhì)量降低,生產(chǎn)的蝦蟹苗容易死亡。同時(shí)眼柄摘除手術(shù)對(duì)親蝦親蟹的損傷較大,死亡率也較高[19]。因此,從基因水平上來尋找新的人工調(diào)控水產(chǎn)甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育的方法已成為研究的重點(diǎn)。目前,有關(guān)克氏原螯蝦卵巢發(fā)育和產(chǎn)卵的調(diào)控基因的研究已有一些報(bào)道[20-22],但有關(guān)PGE2受體EP4基因在該蝦卵巢發(fā)育和產(chǎn)卵過程中的調(diào)控作用的研究迄今尚未見報(bào)道。筆者從克氏原螯蝦卵巢轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)中得到克氏原螯蝦EP4(PcEP4)基因的cDNA序列,包含有2505 bp的完整的開放閱讀框,編碼835個(gè)氨基酸。截至目前,甲殼類EP4基因,僅凡納濱對(duì)蝦在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄有完整的編碼序列,但尚無相關(guān)研究報(bào)道。

3.1 PcEP4基因序列特征

前列腺素受體是細(xì)胞表面七重跨膜受體的亞家族,是G蛋白偶聯(lián)受體。G蛋白偶聯(lián)受體是膜內(nèi)在蛋白,受體內(nèi)包含7個(gè)α-螺旋組成的跨膜結(jié)構(gòu)域,這些結(jié)構(gòu)域?qū)⑹荏w分割為膜外N端、膜內(nèi)C端、3個(gè)膜外環(huán)和3個(gè)膜內(nèi)環(huán)。受體的膜外部分常帶有糖基化修飾。膜外環(huán)上包含有2個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基,它們可以通過形成二硫鍵穩(wěn)定受體的空間結(jié)構(gòu)[23-24]。筆者將PcEP4基因所編碼的EP4氨基酸序列與其他已知無脊椎動(dòng)物的EP4氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)后發(fā)現(xiàn),這些動(dòng)物EP4的氨基酸序列均具有7個(gè)跨膜α-螺旋、2個(gè)半胱氨酸殘基形成的二硫鍵,以及N端的糖基化位點(diǎn)。這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)符合G蛋白偶聯(lián)受體的特征,說明PGE2與受體EP4結(jié)合后激活G蛋白,從而啟動(dòng)不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路,引起生物體的各種生理反應(yīng)。另外,在EP4的TM3中還有1個(gè)X-精氨酸-X的三聯(lián)體。研究表明,在EP4細(xì)胞質(zhì)末端與G蛋白的相互作用中,三聯(lián)體是重要參與者,與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[25]。

3.2 PcEP4基因組織表達(dá)和不同時(shí)期卵巢中的表達(dá)

PcEP4基因組織表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),在雌性克氏原螯蝦成蝦的各組織中,PcEP4基因在成熟期卵巢中的表達(dá)量顯著高于其他9種組織,表明EP4受體在克氏原螯蝦的卵巢中起著重要的作用。PcEP4基因在克氏原螯蝦不同發(fā)育階段的卵巢中的表達(dá)結(jié)果顯示,該基因表達(dá)量在Ⅰ～Ⅴ期的卵巢中隨著卵巢的發(fā)育逐漸升高,在Ⅴ期卵巢中達(dá)到最大值,然后在Ⅵ期卵巢中又下降,Ⅴ期卵巢中該基因的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期的卵巢(P<0.05)。卵巢的整個(gè)發(fā)育周期中伴隨著卵子的發(fā)生、發(fā)育、成熟和排出。在克氏原螯蝦Ⅰ～Ⅳ期的卵巢發(fā)育中,其主要事件為卵原細(xì)胞分化為卵母細(xì)胞和卵母細(xì)胞的發(fā)育,在Ⅴ期卵巢中,卵母細(xì)胞已發(fā)育為成熟的卵子即將排出,而Ⅵ期則為卵子排空后的卵巢。據(jù)此推測(cè)EP4受體可能在克氏原螯蝦卵巢中卵子的發(fā)育成熟和排卵中起重要的作用。在克氏原螯蝦卵巢發(fā)育的卵黃發(fā)生期間,高效液相色譜法檢測(cè)到其體內(nèi)的PGE2持續(xù)增加[26];斑節(jié)對(duì)蝦的卵巢和血淋巴中的PGE2的含量也隨著卵巢的發(fā)育而不斷增加[27]。這與本研究中PcEP4基因在克氏原螯蝦Ⅰ～Ⅴ期的卵巢中表達(dá)量隨卵巢的發(fā)育逐漸升高的規(guī)律一致。表明EP4作為PGE2的受體,其在克氏原螯蝦卵巢內(nèi)的多寡是受PGE2含量影響的,PGE2含量越高,卵巢中所需要的EP4受體也越多。

3.3 PGE2對(duì)卵巢中PcEP4基因表達(dá)和抱卵率的影響

為進(jìn)一步確定PGE2與EP4之間的關(guān)系,筆者檢測(cè)了PGE2注射后克氏原螯蝦卵巢中PcEP4基因表達(dá)和蝦的抱卵率的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PGE2注射后48、60 h,PcEP4基因表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著上升(P<0.05),PGE2注射后72 h,注射組蝦的抱卵率也高于對(duì)照組。此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了克氏原螯蝦卵巢內(nèi)EP4的多寡受PGE2含量的影響,PcEP4基因表達(dá)水平與PGE2含量一致。另外研究表明,PGE2具有促進(jìn)動(dòng)物排卵的作用[3,5],本試驗(yàn)中PGE2注射后72 h蝦的抱卵率提高的研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。以上研究結(jié)果均表明,EP4作為PGE2的受體,其在克氏原螯蝦卵巢中含量和作用均與PGE2一致,且具有促進(jìn)卵巢中卵子成熟和排卵的作用。

4 結(jié) 論

筆者通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法從克氏原螯蝦卵巢中得到了PcEP4基因cDNA序列,包含2505 bp的開放閱讀框,編碼835個(gè)氨基酸,其編碼的蛋白是1個(gè)典型的具有7個(gè)跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白。在克氏原螯蝦各組織中,卵巢中的PcEP4基因表達(dá)量最高,并在不同發(fā)育階段的卵巢中,Ⅴ期卵巢中的表達(dá)量最高。PGE2注射會(huì)促進(jìn)克氏原螯蝦卵巢中PcEP4基因的表達(dá)和蝦的排卵。EP4作為PGE2的受體在卵巢中與PGE2一起具有促進(jìn)克氏原螯蝦卵子的成熟和排卵的重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果可為克氏原螯蝦卵巢發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制的深入研究提供基礎(chǔ)的分子生物學(xué)資料。