草魚脂肪組織及脂肪細胞qRT-PCR內參基因的篩選

胡澤超,鄒孝翠,孫 健,邊晨晨,吉 紅

( 西北農林科技大學 動物科技學院,陜西 楊凌 712100 )

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術已成為分子生物學領域開展基因定量表達分析的重要手段[1-2]。然而,RNA質量、基因擴增效率等因素均會影響qRT-PCR結果的準確性[3-4]。因此,通常需要引入合適的內參基因對試驗數據進行標準化和校正,以減少試驗誤差。理想情況下,內參基因應在任何條件下均具有恒定的表達水平。試驗常用的內參基因有18S核糖體RNA(18S rRNA)基因、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因、延伸因子1α(EF1α)基因、β-肌動蛋白(β-actin)基因等。研究發現,一些內參基因表現出不同程度的表達穩定差異性[5-6]。金屬鉻脅迫下的草魚(Ctenopharyngodonidella)肝胰臟組織18S rRNA、GAPDH、β-actin、β微球蛋白(β2m)內參基因的穩定性研究表明,β-actin基因的表達水平與其他基因有顯著差異[7]。這與嗜水氣單胞菌(Aeromonasehydrophila)感染的肝臟和頭腎組織18S rRNA、GAPDH、β-actin、EF1α基因穩定性研究結果類似,β-actin基因的表達極不穩定[8]。草魚呼腸孤病毒感染后的草魚脾組織18S rRNA、GAPDH、β-actin、EF1α基因穩定性研究顯示,EF1α基因表達穩定性很差[9]。以18S rRNA基因作為內參基因,會對草魚肌球蛋白重鏈基因的表達檢測結果造成偏差[10]。因此,需要篩選出特定條件下穩定表達的內參基因或其組合,以保證qRT-PCR結果的準確性。而對營養干預條件下草魚內參基因表達穩定性的研究尚未見報道。

筆者以不同脂肪水平日糧所飼養草魚的腹腔脂肪組織及不同濃度油酸處理的草魚脂肪細胞為試驗材料,利用qRT-PCR技術并結合GeNorm[11]、NormFinder[12]、BestKeeper[13]軟件對β-actin、EF1α、GAPDH、18S rRNA內參基因的表達穩定性進行評估,以篩選出穩定表達的內參基因或其組合,從而為今后在脂肪營養干預條件下的草魚脂肪組織及脂肪細胞中基因表達分析研究提供理論基礎和參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養管理

試驗草魚購自廣州金沙水產養殖場;選取90尾體質量為(15.0±0.5) g的草魚,隨機分配,共3個試驗組,每組設3個平行,每個平行10尾。試驗開始前用4%脂肪含量的草魚日糧飼喂暫養1周,使其適應新環境和飼料;暫養1周后,3個組隨機分配用脂肪質量分數為4%、8%、12%的草魚日糧飼喂,并將其飼養在室內9個1.0 m×0.5 m×0.6 m的魚缸中;按魚體質量的1%～3%飼喂,每日8:00、12:00、18:00投喂,養殖期間充氣泵24 h充氧,保證充足溶解氧,開關室內日光燈模擬室外晝夜交替,每隔3 d更新1/3～1/2水體,飼養4周。試驗期間養殖水溫26.5～27.5 ℃,pH 7.5～8.5,溶解氧質量濃度>5.0 mg/L。

1.2 樣品采集

飼養試驗結束后,禁食24 h,再用麻醉劑間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽麻醉草魚,采集草魚的腹腔脂肪組織,液氮處理后-80 ℃儲存備用。

1.3 脂肪細胞培養及油酸處理

自楊凌康樂市場購得體質量約1 kg健康無病草魚6尾。麻醉后剪斷鰓弓放血,用洗潔精清洗魚體3遍至潔凈后待用。草魚前體脂肪細胞分離和培養參考實驗室建立的培養體系[14]:分離出腹腔脂肪組織,用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)對組織進行4次洗滌,在0.1% I型膠原酶(Sigma,美國)與2% BSA(Sigma,美國)中于室溫下剪碎30 min。細胞懸浮液通過200 μm尼龍過濾器過濾,于2305 r/min(離心半徑10 cm)下離心10 min。離心后沉淀的細胞顆粒在紅細胞裂解緩沖液中室溫孵育6 min,然后洗滌2次,再懸浮于由DMEM/F12培養基、10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素組成的生長培養基(GM)中。以10 g/25 cm2的密度接種在明膠預處理的24孔板中。生長7 d后,用添加10 μg/mL胰島素、10 nmol/L三碘甲狀腺原氨酸、1 μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)的含GM的成脂培養基中誘導分化。培養基每2 d更換1次。在分化第6天,用濃度0、40、80、120 mmol/L的油酸生長培養基孵育細胞,24 h后收集細胞,于-80 ℃條件下儲存備用。對照組和處理組各設置4個平行。

1.4 總RNA提取及cDNA合成

依照RNeasy?Plus Mini Kit試劑盒(QIAGEN,德國)說明書進行草魚脂肪組織和脂肪細胞的總RNA提取。總RNA質量檢測采用質量體積1.5%瓊脂糖凝膠電泳法,RNA濃度和純度則使用NanoDropTMLite (Thermo Scientific,美國)核酸濃度測定儀檢測。遵循PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa, 日本)逆轉錄試劑盒說明書的指導將提取的RNA合成單鏈cDNA,再用60 μL的滅菌水稀釋混勻,于-20 ℃保存,用于qRT-PCR分析。

1.5 引物設計及合成

β-actin、EF-1α、GAPDH、18S rRNA 4個候選內參基因的引物由北京擎科生物科技有限公司合成,引物序列[9]見表1。

表1 候選內參基因的引物序列Tab.1 Primer sequences for the candidate reference genes

1.6 內參基因擴增效率檢驗

將所合成的脂肪組織和細胞cDNA進行每份10 μL等量混合,制成2種cDNA混合液,按照5倍比例稀釋6個梯度(1、1/5、1/25、1/125、1/625、1/3125),以其為模板進行qRT-PCR分析;每個稀釋梯度的起始模板濃度與循環閾值間呈線性關系,根據循環閾值進行自然對數作圖做線性回歸分析,得出相關系數r2和回歸直線斜率k,再根據E=(10-1/k-1)×100%計算擴增效率E。

1.7 qRT-PCR分析

以所制備的cDNA為模板,采用所合成的引物,對包含上、下游引物各0.6 μL(0.5 μmol/L),1.0 μL cDNA,10 μL ChamQ TM SYBR?qPCR Master Mix(諾唯贊生物科技有限公司,中國)和7.8 μL滅菌雙蒸水的20 μL擴增體系利用CFX96TM實時PCR檢測系統(Bio-Rad,美國)進行實時PCR擴增。PCR的擴增程序:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性10 s,60 ℃退火及延伸共60 s,40個循環。熔曲程序:95 ℃變性15 s,以 0.05 ℃/s 速度由60 ℃升至 95 ℃;記錄熒光信號的變化。每個樣品3個技術重復。

1.8 內參基因穩定性軟件分析及綜合評估

按照文獻所介紹的方法,采用GeNorm、NormFinder、BestKeeper軟件分析所獲取的qRT-PCR結果[15]。簡單而言,利用GeNorm和NormFinder軟件分析前,需要對數據預處理,首先用每組基因的所有樣品中的循環閾值減去該組基因樣品中最小的循環閾值,得到差值(△Ct)并轉換成相對表達量2-△Ct。GeNorm軟件通過每組基因樣品的相對表達量2-△Ct來計算4個候選內參基因的表達穩定值,若表達穩定值越小則該基因表達穩定性越高,相反則越差;其次,以標準化因子的配對變異值(Vn/Vn+1)來判斷最適的內參基因個數,當Vn/Vn+1<0.15時,最適內參基因數是n個,當Vn/Vn+1>0.15時,則最適內參基因數是n+1個。NormFinder軟件利用2-△Ct值來得到表達穩定值,其表達穩定值越小表明穩定性越高,反之越低。而BestKeeper軟件則是直接利用qRT-PCR檢測的結果循環閾值來計算標準偏差和變異系數,并將其作為評估標準,且以標準偏差為第一標準。當標準偏差和變異系數越小,內參基因表達穩定性越好,反之越差;而當標準偏差>1時,則該內參基因表達極不穩定。最后根據GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件的分析結果,對內參基因表達穩定性進行綜合排名,綜合排名是根據候選內參基因在各個軟件中的表達穩定性排序給予得分(第1得4分,第2得3分,以此類推),計算總分,根據總分由高到低進行綜合排名,以此篩選出穩定表達的內參基因或組合。

2 結果與分析

2.1 基因擴增效率分析

4個候選內參基因qRT-PCR擴增效率分析結果見表1,以梯度稀釋的cDNA為模板制作標準曲線計算擴增效率,結果表明,4個內參基因的擴增效率均為95%～105%,符合qRT-PCR對擴增效率的要求,且相關系數r2均接近1,具有高線性擬合度,結果可靠,可進行后續的研究分析。

2.2 候選內參基因表達穩定性分析

2.2.1 GeNorm軟件分析

候選內參基因表達穩定性GeNorm分析結果見圖1和圖2。結果顯示,在脂肪組織中,4個候選內參基因的表達穩定值排序為:18S rRNA=EF1α

圖1 候選內參基因GeNorm分析穩定值排序Fig.1 Stability value ranking in GeNorm of candidate reference genesa.脂肪組織;b.脂肪細胞.a.adipose tissue; b.adipocytes.

圖2 GeNorm分析最適內參基因數目Fig.2 Analysis of the optimal number of reference genes by GeNorma.脂肪組織;b.脂肪細胞.a.adipose tissue; b.adipocytes.

2.2.2 NormFinder軟件分析

候選內參基因表達穩定性NormFinder分析結果見圖3,結果顯示,在脂肪組織中,4個候選內參基因的表達穩定值排序為:18S rRNA<β-actin

圖3 候選內參基因Normfinder分析的穩定值排序Fig.3 Stability value ranking in Normfinder of candidate reference genesa.脂肪組織;b.脂肪細胞.a.adipose tissue; b.adipocytes.

2.2.3 BestKeeper軟件分析

候選內參基因表達穩定性BestKeeper分析結果見表2和圖4。結果顯示,在脂肪組織中,4個候選內參基因表達標準偏差排序為:β-actin<18S rRNA

圖4 候選內參基因Bestkeeper分析的穩定性排序Fig.4 Stability ranking in Bestkeeper of candidate reference genesa.脂肪組織;b.脂肪細胞.a.adipose tissue; b.adipocytes.

表2 候選內參基因Bestkeeper軟件的穩定性分析Tab.2 Stability analysis of candidate reference genes by Bestkeeper software

2.2.4 候選內參基因綜合分析及排序

一般認為,結合多種算法的分析結果而篩選出來的穩定內參基因或組合可以達到準確校正數據結果的目的。綜合3種算法得出的結果見表3。在脂肪組織中,4個候選內參基因表達穩定性的綜合排名為:18S rRNA>β-actin>GAPDH>EF1α,18S rRNA基因是表達穩定性最佳的內參基因;在脂肪細胞中,4個候選內參基因表達穩定性的綜合排名為:18S rRNA=β-actin>GAPDH>EF1α,18S rRNA、β-actin基因是表達穩定性最佳的內參基因;另外,GeNorm的標準化因子配對差異分析結果均顯示,最適內參基因數至少是2個,所以選取表達穩定性靠前的18S rRNA、β-actin基因作為最佳內參基因組合(表3)。

表3 候選內參基因綜合分析及排序Tab.3 Comprehensive analysis and sequencing of candidate reference genes

3 討 論

qRT-PCR技術是基因表達分析的常規手段。研究表明, 內參基因的表達穩定性會隨試驗條件的變化而產生差異性[9,16]。因此,篩選在具體試驗條件下理想的內參基因的研究至關重要。

3.1 18S rRNA內參基因的表達穩定性分析

目前,有關魚類內參基因表達穩定性的研究結果不盡相同。在大西洋鮭(Salmosalar)[17]、斑馬魚(Daniorerio)[18]和黃鱔(Monopterusalbus)[19]中,不同組織間最為穩定表達的內參基因為EF1α;而在青鳉(Oryziaslatipes)[20]、草魚[9]和泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[21]中,不同組織間穩定表達的內參基因是18S rRNA。18S rRNA在機體各組織中表達量都很高,是由最為保守的基因之一18S rDNA轉錄而來,故18S rRNA基因通常都能穩定存在,受因素調控較小,是一種常用的內參基因[22]。本試驗顯示,18S rRNA基因是脂肪組織及脂肪細胞中表達穩定性最高的內參基因。在褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)不同發育階段及低溫處理的胚胎中發現,18S rRNA基因較β-actin、GAPDH及EF1α 3個基因更適合作為內參基因[23]。這樣的現象也在草魚的9個組織及在草魚呼腸孤病毒感染后的不同時間點的草魚脾組織中均有發現,18S rRNA基因同樣穩定表達[9]。在重金屬鎘脅迫下的草魚肝胰臟的相關研究中再一次被證明,18S rRNA基因在所選內參基因中擁有最高的表達穩定性[7]。這些研究結果與本試驗類似,均顯示18S rRNA基因在各自的試驗條件下穩定表達;有研究表明,rRNA合成的調控與mRNA無關,并在影響mRNA表達的各種條件下,rRNA的表達幾乎沒有變化,在各種試驗條件下均相對穩定[24]。所以可以推測,18S rRNA基因的表達在本試驗涉及的脂肪營養條件下不易被干預,至少其優于其他3種候選內參基因。但在采用18S rRNA基因作為草魚肌球蛋白重鏈基因mRNA 在發育階段的內參基因時,其表達量呈不穩定狀態[10];并且一些研究證實,核糖體RNA確實會受到某些藥物和生物因素的影響[25]。所以將18S rRNA基因作為理想內參基因不能成為普適性規律。總之,18S rRNA基因在本試驗條件下可作為一種理想的內參基因。

3.2 β-actin內參基因的表達穩定性分析

β-actin在維持細胞生理活動方面如細胞結構、運動、分裂等都發揮著十分重要的作用,是一種編碼肌動蛋白的高度保守基因,是微絲的結構成分,也是細胞骨架的主要成分[22]。因表達穩定,已被廣泛應用于qRT-PCR研究中,正如PubMed搜索結果所示,超過50%的qRT-PCR研究是使用β-actin基因作為參考基因[25]。本試驗結果顯示,β-actin基因在草魚脂肪組織中的表達穩定性僅次于18S rRNA基因,而在脂肪細胞中同18S rRNA基因一樣也能穩定表達。與本試驗選擇一致的候選內參基因(18S rRNA、β-actin、EF1a、GAPDH)的研究發現,在草魚的9個組織及被草魚呼腸孤病毒感染的CIK細胞中,β-actin基因表達穩定性均較差,而在草魚呼腸孤病毒感染后不同時間點的脾組織中β-actin基因表達穩定性僅次于18S rRNA基因[9]。而關于羅非魚(Oreochromis)[26]、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[27]、斑馬魚[28]等的研究顯示,β-actin基因分別在繁殖、病毒感染和細菌感染等特定條件下是最穩定的內參基因。然而,越來越多的證據表明,β-actin基因在某些情況下有表達差異,其表達會受生長、分化,甚至一些生物刺激的影響[29]。筆者設計的不同脂肪營養水平處理會導致脂代謝差異,組織及細胞的生長和營養水平密切相關,理論上β-actin基因的表達水平存在差異性,本試驗結果顯示,脂肪組織的β-actin基因表達穩定性雖不是最佳,但其穩定性接近18S rRNA基因。脂肪細胞β-actin和18S rRNA基因表達穩定性一致,這可能與脂代謝復雜的調控過程有關,β-actin可能較小程度受到脂肪代謝的調節。所以,最終建議將兩者結合作為基因表達分析中的雙內參,這樣可以避免單一內參基因校正的局限性(如內參基因與目的基因的擴增效率差異等),還能使試驗結果更加準確。

3.3 GAPDH內參基因的表達穩定性分析

GAPDH也是較常見的管家基因之一,常被用于基因表達數據的標準化,在DNA復制、細胞外分泌和細胞骨骼結構研究方面至關重要[30]。本試驗結果顯示,GAPDH基因表達穩定性相對弱于18S rRNA和β-actin基因。Su等[9]在對草魚的鰓、頭腎、心臟、腸道、肝臟、肌肉、皮膚、脾臟和體腎等9個不同組織及用草魚呼腸弧病毒感染了不同時間的脾組織進行內參基因篩選的研究中發現,GAPDH基因在所選4個內參基因中的表達穩定性均排名第3,穩定性相對較差,這和本試驗有著相似的研究結果。有研究顯示,GAPDH易受到試驗條件的影響,并因為它是糖酵解和糖異生過程中的關鍵酶,容易不穩定[31]。因此,GAPDH基因作為內參基因也存在一定的爭議。而本試驗涉及不同脂肪含量飼料投喂,不同脂肪量攝入的試驗組脂肪代謝存在差異,結合脂肪代謝與糖代謝的緊密聯系,可預見GAPDH基因表達存在差異。因此,GAPDH基因不適合作為本試驗條件下的理想內參基因。

3.4 EF1α內參基因的表達穩定性分析

延伸因子1α(EF1α)參與了mRNA的翻譯,是細胞中表達比較多的蛋白質之一[32]。本試驗結果表明,EF1α在脂肪組織及細胞中表達穩定性最差,不及其他3個內參基因。這與草魚呼腸孤病毒感染草魚脾組織的研究具有相似的結果,EF1α基因在4個內參基因中表達穩定性最差[9]。在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染不同時間的脾臟中,EF1α基因穩定性最佳[27],在達氏鱘(Acipenserdabryanus)[33]、藍點馬鮫(Scomberomorusniphonius)[34]的相關研究中均出現與之類似的研究結果。有研究表明,EF1α在生物的新陳代謝過程中發揮著非常重要的作用,是蛋白質合成過程的關鍵因子[35]。在本試驗的不同脂肪營養干預條件下,試驗組脂代謝存在差異,結合蛋白質代謝與脂代謝的緊密聯系,可預見EF1α表達存在差異,說明該基因可能在脂代謝過程中發揮調節作用。所以,EF1α基因不適合作為草魚脂肪組織和脂肪細胞的理想內參基因。

以上結果表明,造成與本試驗中脂肪組織和脂肪細胞的穩定內參基因種類異同性的因素可能一方面是樣品種類特性,另一方面是所選內參基因數量和種類,但更多還是取決于試驗處理條件。研究再次證明,基本上不存在具備普遍穩定表達特性的內參基因,一般而言,內參基因均會受到不同因素的干擾。因此,在開展qRT-PCR試驗前,需要篩選合適的內參基因,以確保研究結果的準確性。雖然在很多研究中都能篩選出穩定表達的內參基因,但是也存在篩選失敗的情況,如被細菌感染后,條石鯛(Oplegnathusfasciatus)[36]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[37]等都未能篩選出在所有組織中均能穩定表達的內參基因。

4 結 論

本試驗條件下,在草魚脂肪組織和脂肪細胞中穩定表達的內參基因是18S rRNA基因,而β-actin基因在脂肪細胞中與18S rRNA基因表達穩定性一致。考慮到研究工作的復雜性、成本以及單一內參校正的局限性,結合本試驗結果,建議選擇18S rRNA、β-actin基因作為草魚脂肪組織和脂肪細胞的內參基因組合。