長鏈非編碼RNA FAM83H-AS1對子宮內膜癌細胞增殖、侵襲和轉移的影響

宋曉霞 田金 劉玉玲 姜秋慧 劉曉妍 王倩倩 張麗麗 周曉麗趙曉麗

1河南中醫藥大學第五臨床醫學院 鄭州人民醫院婦科，鄭州 450000；2鄭州大學第二附屬醫院婦科，鄭州 450000

子宮內膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤。隨著醫療技術的進步，用于子宮內膜癌治療的方法在不斷提高，但晚期子宮內膜癌患者的治愈率仍然很低。對于有腫瘤轉移或復發的患者，無論其分級或分期，預后均較差；這些患者的死亡風險顯著增高，通常生活質量較差，中位總生存時間明顯較低［1-2］。目前，子宮內膜癌的發病和轉移機制尚不清楚。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 個核苷酸，不編碼蛋白質的功能性RNA 分子［3-4］。雖然lncRNA 不具有編碼蛋白質的功能，但是能夠通過調節mRNA剪切、降解和翻譯等生理過程發揮作用［5］。序列相似性家族83成員H 反義RNA 1（FAM83H-AS1）是一種與癌癥進展密切相關的lncRNA，其異常的高表達水平與多種癌癥的發生發展密切相關。目前，FAM83H-AS1 在子宮內膜癌中的作用及其機制和FAM83H-AS1 對子宮內膜癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用仍不清楚。本研究主要通過檢測人子宮內膜癌組織及癌旁組織中LncRNA FAM83H-AS1 的表達水平，并通過細胞學試驗驗證LncRNA FAM83H-AS1 對子宮內膜癌細胞增殖、侵襲和轉移的影響。

資料與方法

1.主要資料

收集2018年10月至2020年10月就診于鄭州人民醫院的39 例子宮內膜癌患者的腫瘤組織以及配對的癌旁組織，其中包括子宮內膜樣癌20 例（其中G1 5 例，G2 7 例，G3 8例），非內膜樣癌19例（其中包括漿液性癌10例，黏液性癌5 例，透明細胞癌4 例）。組織標本于手術期間取得，并立即在-80 °C 下冷凍直到下一步使用。在樣本收集之前，從每個參與者處獲得了書面知情同意，研究方案經鄭州人民醫院臨床研究倫理委員會批準備案。

納入標準：年齡范圍25～75 歲；符合《子宮內膜癌診斷與治療指南》中子宮內膜癌的診斷標準［6］；經病理組織學檢查確診者；入院前3 個月無性激素類藥物治療史者；術前未接受過放療、化療等抗腫瘤治療方案者；依從性良好者。

排除標準：腦外傷、中樞神經系統感染引起的癡呆等；精神疾病患者；有酗酒或藥物濫用史的患者；心肝腎嚴重功能障礙患者；合并其他腫瘤性疾病者；血液性系統疾病患者。

4 種子宮內膜癌細胞系（HEC-1B、HEC-1A、ishikawa 以及RL-952）和1株正常子宮內膜上皮細胞系（hEEC）購自湖南豐暉生物科技有限公司。

2.主要方法

2.1.逆轉錄定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR） 采用qRT-PCR 檢測臨床上收集的39 例子宮內膜癌患者的腫瘤組織以及配對的癌旁組織中FAM83H-AS1的表達水平。具體步驟：通過TRIzol 試劑（Thermofisher Scientific，美國）提取，并且使用NanoDrop 1000 分光光度計（Thermofisher Scientific，美國）測定蛋白質濃度。使用Agilent 2100生物分析儀（Agilent Technologies，美國）評估提取的RNA 的質量，使用PrimeScript synthesis cDNA kit（Takara Biotechnology，日本）反轉錄合成cDNA，SYBR Green PCR Master Mix（Takara Biotechnology，日本）進行qPCR，將GAPDH mRNA 含量標準化 。 引 物 序 列 如 下 。 FAM83H-AS1：（R） 5’-AGCTCCACCTCCCGGGTTCACG-3’、 （F）5’-CGTGAACCCGGGAGGTGGAGCT3’。逆轉錄反應體系嚴格按照說明書進行。

2.2.構建低表達FAM83H-AS1 的子宮內膜癌細胞系靶向FAM83H-AS1 的shRNA 由生工生物科技有限公司合成，并插入pLKO.1-TRC 克隆載體（Addgene）中，靶向序列分別為：5’-CTTGCGATCGGGTCGATCGATCTTAGCTTTGCGA-3’（shRNA1）和5’-GTCCGTAGCTAGCTAAAGTCGATTCGATCGTACAAGA-3’（shRNA-2）。另外，將pLKO.1-TRC 對照載體用作對照的空載體（命名為sh-NC）。

2.3.細胞增殖試驗［細胞計數試劑盒8（CCK-8）］ 轉染后24 h 收集細胞并進行重懸，將細胞密度為1×106個/ml、濃度為2×105個/ml 的單細胞懸液接種到96 孔板中，并在細胞接種后96 h 進行CCK-8 測定（Beyotime，中國）。96 h 后取出孔板，將10 μl CCK-8 溶液添加到每個孔中并在37 ℃下孵育2 h后，使用酶標儀（Bio-Rad Laboratories，美國）在450 nm波長下分析細胞的增殖活性。將來自3 個獨立試驗的結果取平均值進行分析。

2.4.TUNEL 染色 首先用PBS 或HBSS 洗滌1 次。如果細胞貼得不牢，可以干燥樣品，使細胞貼得更牢；用4%多聚甲醛固定細胞30 min；用PBS 或HBSS 洗滌1 次；加入含0.3% Triton X-100的PBS，室溫孵育5 min；在樣品上加50 μl TUNEL 檢測液，37 ℃避光孵育60 min；PBS 或HBSS 洗滌3 次。最后，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發波長450～500 nm，發射波長515～565 nm。

2.5.EdU 染色 顯微鏡下觀察細胞，配制2×EdU 工作液，加入2×EdU 工作液，孵育-固定-棄去培養液，用4%多聚甲醛溶液來固定，固定時間20 min。洗滌-滲透劑-洗滌，EdU檢測。

2.6.流式細胞術 使用胰酶消化細胞，1 000 轉/min 離心收集所有細胞；使用4 ℃預冷的PBS 洗滌細胞2 次；將0.5 ml PBS 懸浮細胞緩慢加入到預冷的70%乙醇溶液中（用PBS 配制，-20 ℃預冷），快速混勻，使用封口膜封口，-20 ℃固定過夜；將固定過的細胞以4 ℃、1 000 轉/min 離心5 min，棄上清液，轉移到EP 管中，用PBS 洗滌2 次。計數細胞，調整細胞密度為1×106個細胞/ml，取1 ml 進行試驗。4 ℃，1 000 轉/min 離心5 min，取細胞沉淀；加入900 μl PBS緩沖液重懸細胞；加入100 μl RNaseA 溶液，使RNaseA 終濃度為100 mg/L，37 ℃孵育30 min；4 ℃，1 000 轉/min 離心5 min，棄去上清液；加入450 μl PBS 懸浮細胞，加入450 μl PI 染液，避光冰置20 min；上流式細胞儀檢測，分析記錄結果。

2.7.Transwell 試驗 Transwell 試驗檢測HEC-1A 和HEC-1B 的遷移和侵襲能力。Matrigel 膠4 ℃過夜，提前開制冰機，槍盒預冷。Matrigel 膠的原液為8.6 g/L。用無血清培養基將Matrigel 膠分別配制成100 mg/L 和30 mg/L 的溶液；向24 孔板的每孔中加入400 μl 30 g/L 的Matrigel 膠溶液，將transwell小室置于溶液內，再滴加200 μl濃度為30 g/L的Matrigel 膠溶液，冰上放置1.0 h 后吸棄溶液、晾干；將100 μg/L 的Matrigel膠溶液吹打均勻后，吸取100 μl緩慢滴加于transwell上室基底膜上。晃動均勻后置于37 ℃培養箱內放置0.5 h；將細胞在無血清培養基中培養過夜；將小室放入含有600 μl 無血清培養基的24 孔板小孔中后，放在孵育箱中活化30 min 以上；消化細胞，將其制成單細胞懸液，吸取1.0 ml 至標記好的1.5 ml EP 管內，離心后用無血清培養基重懸細胞。調整細胞濃度為2×105個/ml 的單細胞懸液；取200 μl細胞懸液加入到小室上室中，在小室的下室中加入600 μl 含15% FBS 的RPMI-1640 培養基，放在孵育箱中培養24.0 h；棄培養基，用含4%多聚甲醛的固定液室溫固定細胞20 min，接著用0.1%結晶紫染色20 min，然后用棉簽擦去小室上層細胞，沖洗晾干小室；于倒置顯微鏡下采集圖像（×100），隨機選取6個不同視野計數分析。

3.統計學方法

數據分析用GraphPad Prism 8.0 軟件，對于臨床樣本分析，使用配對t檢驗檢測數據間差異有無統計學意義，對于細胞試驗，使用單向方差分析或者雙向方差分析，方差分析后使用Tukey’s multiple comparison test 進行獨立檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1.lncRNA FAM83H-AS1 在子宮內膜癌組織中的表達水平明顯增高

癌組織lncRNA FAM83H-AS1 表達水平明顯高于癌旁組織（圖1）。為了進一步分析FAM83H-AS1 的表達水平與患者的臨床表型的相關性，研究分析了FAM83H-AS1 表達水平與患者年齡、腫瘤大小、FIGO 分期、淋巴結轉移、腫瘤組織學分級以及組織學類型的關系，結果發現，FAM 83H-AS1 的表達水平與患者的年齡、腫瘤大小無明顯相關性（均P＞0.05）。但是，在FAM83H-AS1 陽性的患者中，具有更高的FIGO 分期；此外，研究還發現，非內膜樣癌FAM83H-AS1 的表達水平更高，且腫瘤的組織學分級越高越有轉移的可能，預示著預后更不佳（表1）。

表1 子宮內膜癌患者腫瘤組織中FAM83H-AS1的表達水平與子宮內膜癌患者臨床病理特征相關性[例（%）]

圖1 FAM83H-AS1在子宮內膜癌組織中的表達水平明顯提高

2.低表達FAM83H-AS1的子宮內膜癌細胞系構建成功

為了驗證FAM83H-AS1 在子宮內膜癌中的作用，我們將shRNA 靶向FAM83H-AS1 轉染至子宮內膜癌細胞HEC-1A 和HEC-1B 中，通過qRT-PCR 檢測細胞中FAM83H-AS1 的表達水平，確認敲低效率，發現shRNA-1 與shRNA-2 均具有良好的敲低效應，并且shRNA-1的效率更高（圖2）。

圖2 shRNA對FAM83H-AS1敲低效率的檢測。A：逆轉錄定量聚合酶鏈式反應檢測在shRNA 靶向FAM83H-AS1 轉染至子宮內膜癌細胞HEC-1A和HEC-1B中之后FAM83H-AS1的表達水平；B：熒光顯微鏡下觀察轉染后細胞中綠色熒光表達以確認轉染成功

3.敲低FAM83H-AS1削弱子宮內膜癌細胞的增殖活性

采用CCK-8 試劑盒在敲低FAM83H-AS1 之后檢測HEC-1A 和HEC-1B 的增殖活性，結果顯示，在敲低FAM83H-AS1 的子宮內膜癌細胞HEC-1A 和HEC-1B 中，24 h 后細胞活性顯著低于轉染Scr-shRNA 的細胞（圖3A）；進一步將子宮內膜癌細胞系HEC-1A 和HEC-1B 接種在瓊脂糖凝膠平皿中，用于分析細胞的克隆形成數量，接種后7 d，對平板進行結晶紫染色，研究結果顯示，敲低FAM83H-AS1 的子宮內膜癌細胞HEC-1A 和HEC-1B 在平板中形成的細胞克隆數量顯著減少（圖3B）。采用EdU染色檢測細胞中的增殖細胞數量，結果顯示，EdU 陽性細胞數量明顯減少（圖3C）。

圖3 敲低FAM83H-AS1 削弱子宮內膜癌細胞的增殖活性。A：細胞計數試劑盒8 檢測HEC-1A 與HEC-1B 在敲減FAM83H-AS 前后細胞增殖情況；B：細胞克隆形成試驗檢測HEC-1A與HEC-1B在敲減FAM83H-AS前后細胞增殖情況；C：EdU染色檢測細胞的DNA復制能力

4.敲低FAM83H-AS1促進子宮內膜癌細胞的凋亡

采用TUNEL 染色檢測敲低FAM83H-AS1 的子宮內膜癌細胞HEC-1A 和HEC-1B 的凋亡小體的形成數量，觀察到在sh-NC 的細胞中，平均每個視野有2～3 個綠色熒光基團（凋亡小體），然而在敲低FAM83H-AS1 的子宮內膜癌細胞中，平均每個視野的凋亡小體數量明顯增加（圖4A）。進一步采用流式細胞術檢測細胞中的凋亡比例，我們觀察到敲低FAM83H-AS1 會顯著促進細胞凋亡（圖4B）。以上結果均充分說明：敲低FAM83H-AS1 會導致子宮內膜癌細胞活性降低，并且促進細胞凋亡。

圖4 敲低FAM83H-AS1 促進子宮內膜癌細胞凋亡。A：TUNEL 染色檢測細胞中的凋亡小體數量；B：流式細胞術檢測細胞中的凋亡細胞比例

5.敲低FAM83H-AS1 抑制子宮內膜癌細胞的遷移與侵襲

為了進一步明確敲低FAM83H-AS1對子宮內膜癌細胞轉移的影響，采用Transwell 試驗檢測HEC-1A 和HEC-1B細胞的遷移和侵襲能力，從結果中我們發現，敲低FAM83H-AS1 會顯著抑制子宮內膜癌細胞的遷移和侵襲（圖5A、B）。

圖5 敲低FAM83H-AS1 抑制子宮內膜癌細胞的遷移與侵襲。A：Tranwell 試驗檢測HEC1A 和HEC1B 的遷移能力；B：Tranwell 試驗檢測HEC1A和HEC1B的侵襲能力

討論

在人類基因組中大約只有2%的基因編碼蛋白質；大多數基因組不會翻譯成蛋白質，而是可以編碼一系列非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）［7-10］。在最近的幾十年中，已經鑒出了一組稱為lncRNA 的ncRNA。大多數lncRNA 通常位于細胞核中，在那里它們可能在表觀遺傳調控中起關鍵作用，包括通過染色質修飾；但是，越來越多的研究已經確定了細胞質中也存在lncRNA。這表明lncRNA 在基因的表達、翻譯以及翻譯后調控中都起著重要作用［11-14］。研究表明，具有序列相似性的FAM83H-AS1的lncRNA家族的異常表達與癌癥患者的預后不良有關。有研究發現，肝癌患者中FAM83H-AS1 高表達與總生存期（overall survival，OS）具有明顯相關性［15-17］。在胃癌中，FAM83H-AS1 高表達能夠影響胃癌患者的OS 和無病生存率（disease-free survival，DFS），FAM83H-AS1 在胃癌的發生發展中扮演著癌基因的作用［18-19］。另一項研究表明，卵巢癌患者腫瘤組織中FAM83H-AS1 的表達水平明顯高于癌旁組織，并且FAM83H-AS1 高表達與卵巢癌的腫瘤分化程度、腫瘤淋巴結轉移（LNM）和遠處轉移有關［20］。

本研究主要采用qRT-PCR 檢測臨床收集的39 例子宮內膜癌患者的腫瘤組織及其配對的癌旁組織中FAM83H-AS1的表達情況，為了進一步分析FAM83H-AS1的表達水平與患者的臨床表型的相關性，研究分析了FAM83H-AS1 的表達水平與患者的年齡、腫瘤大小、FIGO分期、淋巴結轉移、腫瘤分化程度以及組織學類型的關系，結果發現，FAM83H-AS1的表達水平與患者的年齡、腫瘤大小無明顯相關性（均P＞0.05）；但是，高表達FAM83H-AS1的患者具有更高的FIGO 分期；此外，研究還發現，非內膜樣癌FAM83H-AS1 的表達水平更高，且腫瘤的組織學分級越高越有轉移的可能，預示著預后更不佳。進一步使用Lipofectamine 2000 轉染試劑盒將靶向FAM83H-AS1 的shRNA 質粒轉染至子宮內膜癌細胞HEC-1A 和HEC-1B中，通過qRT-PCR 檢測shRNA 的轉染效率，結果顯示，敲低FAM83H-AS1 會顯著抑制子宮內膜癌細胞在體外的增殖，其主要表現在低表達FAM83H-AS1 HEC-1A 和HEC-1B 的子宮內膜癌細胞的增殖活性被顯著抑制，在平板上形成的克隆數量也顯著減少，EdU 陽性細胞數量也顯著降低；而且，進一步通過TUNEL 染色以及流式細胞術檢測發現，敲低FAM83H-AS1 會顯著促進HEC-1A 與HEC-1B 中凋亡小體的形成；進一步采用Transwell 試驗檢測HEC-1A 和HEC-1B 的遷移和侵襲能力，從結果顯示，敲低FAM83H-AS1 會顯著抑制子宮內膜癌細胞的遷移和侵襲，表明低表達FAM83H-AS1會明顯促進子宮內膜癌細胞的凋亡。以上結果說明，FAM83H-AS1 在子宮內膜癌的發生和發展中具有重要的作用。

綜上所述，lncRNA FAM83H-AS1高表達可能與子宮內膜癌的發生發展有關。但是，由于樣本數量較少，lncRNA FAM83H-AS1在子宮內膜癌發病機制中的作用以及表達和調控機制還有待進一步研究。此外，該基因是否可作為子宮內膜癌患者的易感篩查指標，以及如何找到有效下調lncRNA FAM83H-AS1 的方法，并能夠讓其應用于臨床，是我們下一步研究的目標。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突