Mcl-1基因在陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥異常克隆抗凋亡機制中的作用研究

林鶯 張榮東 陳仁利 陳琦

寧德師范學院附屬寧德市醫院血液科，寧德 352100

陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一種獲得性造血干細胞克隆缺陷性疾病。目前，關于PNH 克隆如何取得增殖優勢的機制還不清楚，免疫機制、抗凋亡機制、二次基因突變或異常表達機制以及微環境改變均可在其中發揮重要作用［1-2］。Heeney等［3］發現一些抗凋亡基因在PNH 患者中有明顯的高表達，抗凋亡基因上調可能導致PNH 和相關疾病凋亡抵抗，這也提示了凋亡機制參與PNH 克隆的增殖。本研究主要探討Mcl-1 基因異常表達在PNH 克隆增殖中的抗凋亡作用，現報道如下。

資料與方法

1.一般資料

選取2020年2月至2022年2月在寧德師范學院附屬寧德市醫院住院或門診就診的PNH患者13例，其中男7例，女6 例，中位年齡27（21，56）歲；對照組為同期健康體檢者15例，且經PNH Flaer檢測未檢測出PNH 克隆，其中男8例，女7 例，中位年齡38（23，67）歲。病例組與對照組在性別、年齡等一般資料方面比較差異均無統計學意義（均P>0.05）。納入標準：既往確診或新診斷的PNH 患者，PNH 克隆陽性，無自身免疫性疾病病史、近期無感染史，PNH 診斷符合國內統一標準［4］。排除標準：PNH 克隆陰性存在自身免疫性疾病或近期有嚴重感染者。

本研究通過寧德師范學院附屬寧德市醫院醫學倫理委員會批準（審查編號：20200318），受試者均知情同意并簽署知情同意書。

2.主要試劑和儀器

藻紅蛋白（PE）標記的鼠抗人CD59 單抗、抗PE 的免疫磁珠、MS 分選柱均為美國Becton Dickinson 公司；Ficoll-Paque 分離液、磁珠緩沖液、凋亡試劑盒、Trizol RNA Reagent、逆轉錄試劑盒等均購于美國Invitrogen 公司；FACS Calibur 流式細胞儀為美國Becton Dickinson 公司產品；PCR儀器為日本Takara公司。

3.實驗步驟

（1）標本的采集和處理：采集PNH患者及對照組的骨髓液10 ml，使用Ficoll-Paque 分離液提取骨髓中單個核細胞，并洗滌后重懸細胞。在PNH患者的骨髓單個核細胞中先后加入抗CD59 抗體及抗PE 的免疫磁珠，用分選柱行磁珠分選細胞，得到CD59-細胞及CD59+細胞。使用流式細胞術檢測磁珠分選后CD59-及CD59+比例，其中CD59-細胞純度達96% 以上。（2）CD59-細胞的培養和處理：將分選出的CD59-細胞用培養基定容并計數細胞，并將細胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養基培養。將PNH 患者CD59-細胞接種于6 孔板，每孔2×105細胞，并用lipofectamin2000 轉染細胞，分為3 組，分別為轉染Mcl-1 siRNA 組（siRNA-Mcl-1 轉染組）、轉染無義序列組（siRNA-scr 轉染組）和空白對照組，轉染后檢測各組細胞的增殖、凋亡及細胞周期分布等生物學變化。（3）RT-PCR 檢測各組細胞Mcl-1 基因mRNA 的表達：各組細胞分別提取總RNA，然后進行RNA 純度測定，同時使用紫外分光光度計測OD260∕280的比值，要求吸光度OD260∕280>1.8，然后進行RNA 逆轉錄，獲得各組的cDNA，行PCR 擴增檢測，各引物由上海吉凱基因化學技術有限公司設計合成，并按比例配制反應體系，最后計算機分析獲得樣本及內參的Ct值后行數據處理。（4）MTS法檢測各組細胞增殖情況：收集各組細胞以適當密度接種于96 孔板中，37 ℃ 5% CO2培養箱培養，培養終止前3 h 加入20 μl MTS，3 h 后，振蕩器振蕩10 min，酶標儀490 nm 檢測OD 值。（5）檢測細胞凋亡率：轉染培養24 h、48 h、72 h后，收集各組細胞，調整適當細胞密度為1×106∕ml，用流式細胞儀以AnnexinV∕PI 雙染法檢測各組細胞的凋亡率。（6）流式檢測細胞周期分布情況：轉染培養后，收集各組的CD59-細胞，用PBS 洗滌并重懸細胞，按照操作說明，依次加入ABC 液，過濾后收集濾液上機檢測。

4.統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件。正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗，計數資料以例（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法，P<0.05示差異有統計學意義。

結果

1.患者特征（表1）

表1 13例陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥患者的基本臨床特征

13 例PNH 患者中表現為骨髓衰竭型患者4 例、經典型PNH 患者9 例，兩者在性別、年齡、CD59-、CD55-、網織紅細胞絕對值（Ret）方面比較差異均無統計值意義（均P>0.05）。

2.PNH 患者CD59-細胞Mcl-1 基因mRNA 的表達量（圖1）

圖1 使用流式細胞術檢測13例陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥患者標本磁珠分選后CD59-（A）、CD59+（B）比例

使用流式細胞術檢測PNH 患者標本磁珠分選后CD59-及CD59+比例，其中CD59-細胞純度達96%以上；PNH患者CD59-細胞組、CD59+細胞組、對照組的Mcl-1基因mRNA的表達量分別為（2.48±0.25）、（1.61±0.19）、（1.21±0.08），CD59-細胞組均高于CD59+細胞組及對照組（P=0.031、0.022），而CD59+細胞組和對照組間比較差異無統計學意義（P=0.126）；同時，PNH 患者Mcl-1 基因mRNA 的相對表達量與CD59-克隆細胞數呈正相關（r2=0.523，P=0.012）。

3.沉默Mcl-1基因效果的驗證

PNH 患者CD59-細胞轉染靶向siRNA-Mcl-1 后，Mcl-1 mRNA 表達水平下降，siRNA-Mcl-1 轉染組Mcl-1 mRNA 表達量為（1.05±0.07），低于siRNA-scr 轉染組的（1.87±0.21）和空白對照組的（1.49±0.11），差異均有統計學意義（P=0.038、0.046）。

4.細胞增殖率檢測（圖2）

圖2 siRNA-Mcl-1轉染后13例陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥患者CD59-細胞各組不同時間點的增殖情況

MTS 法檢測siRNA-Mcl-1 轉染前后PNH 患者CD59-細胞的增殖情況，結果提示Mcl-1基因沉默后CD59-細胞增殖率明顯下降，同時隨著轉染時間的延長，其細胞增殖率進一步下降。

5.細胞凋亡率檢測（圖3）

圖3 siRNA-Mcl-1轉染后13例陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥患者CD59-細胞各組不同時間點的凋亡率情況

流式檢測各組細胞的凋亡率情況，siRNA-Mcl-1轉染組細胞凋亡率高于siRNA-scr 轉染組和空白對照組［（43.12±16.33）%比（24.07±15.42）%、（21.56±14.85）%］，差異均有統計學意義（均P<0.05），提示Mcl-1基因可能有抗凋亡作用。

6.細胞周期分布情況

流式檢測細胞周期分布情況，siRNA-Mcl-1轉染組G0∕G1期細胞比例高于siRNA-scr轉染組和空白對照組［（93.16±3.06）%比（91.52±4.01）%、（90.78±3.62）%］，而S 期細胞比例低于siRNA-scr 轉染組和空白對照組［（4.96±3.21）%比（6.86±3.87）%、（7.05±3.59）%］，差異均有統計學意義（均P<0.05）。這提示減低Mcl-1 基因后，G0∕G1期細胞比例增加，S 期細胞比例減低，表明了細胞周期向G0∕G1期移動，細胞的增殖能力下降。

討論

目前，關于PNH克隆如何獲得增殖優勢尚未形成共識，我們既往的研究提示，調節性T 細胞的免疫抑制作用在PNH 患者中增強，可能在PNH 異常克隆中起了逃避免疫監視的作用［5］。Horikawa 等［6］和Brodsky［7］分別報道了PNH 患者的異常血細胞有抵抗凋亡的能力，現多項研究已表明單獨的PIG-A 基因突變并不能引起異常克隆對凋亡的抵抗，PNH 克隆在體內獲得生存及增殖優勢可能與其他因素有關［8-12］。凋亡機制在PNH 克隆增殖中的作用是PNH 發病機制研究的熱點。有研究指出，凋亡的減少是由于GPI 陰性細胞持續存在及占據優勢所致，如果突變的PNH 細胞能夠抵抗凋亡，那么易使其獲得克隆優勢［13-15］。Heeney 等［3］發現一些抗凋亡基因（Mcl-1、human A1、Hhr23B、RhoA）在PNH 患者有明顯的高表達，且其外周血中性粒細胞和單核細胞中又發現了抗凋亡基因過度表達。抗凋亡基因上調可能導致PNH 和相關疾病凋亡抵抗，這也提示了凋亡機制參與PNH克隆的增殖。

Mcl-1 基因作為Bcl-2 家族的一個抗凋亡成員，是在研究人ML-1 髓白血病細胞系用佛波酯誘導后，沿單核∕巨噬細胞途徑分化過程中，作為早期誘導基因被首次發現的，其表達與調節異常與許多疾病有關［16-18］。相關研究顯示，通過反義寡核苷酸技術或小分子干擾RNA 抑制Mcl-1基因的表達，可引起表達Mcl-1 的腫瘤細胞的凋亡［19-21］。另外，阻斷調節Mcl-1 基因表達的信號途徑也能有效地誘導細胞凋亡［22-23］，表明Mcl-1 的過表達可以促進惡性腫瘤細胞生存。Heeney 等［3］發現Mcl-1 在PNH 患者有顯著的高表達，但目前，沒有關于應用siRNA 抑制PNH 患者Mcl-1 表達的研究。本研究探討Mcl-1 基因表達是否降低PNH 克隆的凋亡率，發現同一PNH 患者CD59-細胞的Mcl-1 mRNA 的表達量明顯高于CD59+細胞和對照組，且Mcl-1 mRNA 的表達量與CD59-細胞克隆數呈正相關，表明Mcl-1基因在PNH 的克隆擴增中可能起促進作用。本研究中利用siRNA 干擾技術減低Mcl-1 基因的表達后，PNH 患者CD59-細胞的增殖率下降，凋亡率增加，同時，細胞周期分布提示其向G0∕G1期推進，細胞增殖力下降，進一步表明了Mcl-1 基因促進CD59-細胞的增殖，與既往研究發現抗凋亡基因在PNH 患者體內存在高表達是一致的。

研究表明，PNH 克隆逃逸凋亡可能致增殖優勢，Mcl-1 基因的過表達可能在PNH 克隆抗凋亡中起作用，但本研究例數偏少，研究結論還需要加大病例數進一步驗證結果。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突