基于轉錄組測序的姜黃側根發育分析及相關基因篩選

李永寧，尹彥棚，周羅靜，藍 鑫，侯飛俠，彭 成，高繼海

? 藥材與資源 ?

基于轉錄組測序的姜黃側根發育分析及相關基因篩選

李永寧，尹彥棚，周羅靜，藍 鑫，侯飛俠，彭 成，高繼海*

成都中醫藥大學 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137

姜黃主根形成中藥姜黃，側根形成藥材郁金。為探知姜黃主根與側根形成過程的差異和側根生長膨大的分子機制，對姜黃主根與側根進行轉錄組測序，挖掘促使側根生長膨大的關鍵基因。以姜黃主根和側根為材料，采用Illumina HiSeq高通量測序平臺進行轉錄組測序，組裝與注釋后進行差異表達基因篩選。轉錄組測序共獲得42.69 Gb clean data，共得到42 748條Unigene，其中35 456條被注釋。主根和側根中的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）有1551個，（gene ontology，GO）富集結果表明，姜黃主根與側根的DEGs主要富集于代謝過程、細胞過程、催化過程、轉運過程、結合等功能，COG富集結果表明，主根與側根中DEGs主要富集于碳水化合物代謝和信號轉導機制。KEGG富集分析顯示，根中DEGs主要富集在淀粉和糖代謝、植物激素信號傳遞等代謝通路中。通過注釋信息篩選出姜黃側根生長膨大相關的差異表達基因，關鍵差異表達基因與通路分析表明側根中蔗糖合成酶基因、生長素響應基因（、、）的表達上調可能是姜黃側根生長膨大的影響因素。通過對姜黃主根與側根高通量轉錄組測序，揭示了姜黃側根生長膨大的關鍵基因，可以為姜黃根系生長的生物學機制提供參考。

姜黃；轉錄組；主根；側根；生長；代謝過程；細胞過程；催化過程；轉運過程

姜黃L.為姜科（Zingiberaceae）姜黃屬多年生草本植物，主根炮制后作藥材“姜黃”，側根炮制后作藥材“郁金”，姜黃主根呈不規則倒卵圓形，表面深黃色，有明顯環節；側根呈紡錘形，表面棕灰色[1]。姜黃具破血行氣、通經止痛的功效，郁金具活血止痛、行氣解郁、清心涼血的功效。姜黃主根與側根主要化學成分為姜黃素類和揮發油類成分，此外，主根中包含姜黃二酮、樟腦，側根中包含郁金二酮、龍腦及樟腦等成分。現代藥理表明姜黃主根及側根有抗炎、抗腫瘤、抗氧化作用，側根還可治療抑郁，對心血管病有較好的治療作用[2]。

姜黃根系生長膨大是多因素作用的復雜過程，受內源激素、蔗糖及淀粉代謝等相關因素的影響[3]。其中生長素是側根生長的主要調控因子，在側根發生的建成細胞選擇、側根原基的發育和側根分生組織的激活3個階段均起調控作用[4]，可以促進側根的生長發育[5-6]。側根膨大需要物質和能量，在光合產物從源到庫后，側根作為庫器官，蔗糖在庫器官轉化為干物質，促使側根膨大。姜黃的側根在10月下旬進入膨大期，部分側根末端開始發育膨大，光合產物向側根轉移，側根干物質量增加，于12月側根質量達到最大值。而姜黃主根在8月開始膨大，11月中旬至次年1月為主根干物質量達到最大值[7]。姜黃主根與側根的發育及膨大時間均不相同，乃至種植方式亦有區別，因此在實際生產中，受內外環境影響，形成犍為、沐川的姜黃道地產區和崇州、雙流的郁金道地產區[8]。姜黃側根相對主根的生長過程差異較多，其受生長素、蔗糖及淀粉代謝等其他內環境因素影響的分子機制不明，利用RNA-Seq技術，選擇發育成熟的姜黃植株根系進行轉錄組測序研究，對姜黃側根發育相關的差異表達基因進行篩選，從轉錄組水平探究姜黃側根發育的基因表達特征，可為實際生產中姜黃主根與側根的栽培和育種提供數據基礎。

1 材料

姜黃于2021年12月采收于四川省犍為縣（坐標：104°07′22″E，029°03′48″N），經成都中醫藥大學高繼海副教授鑒定為姜科植物姜黃L.。挖取新鮮姜黃主根和側根共6個樣本，立即投入液氮保存，之后置于?80 ℃保存備用。主根編號為JH-1、JH-2、JH-3；側根編號為YJ-1、YJ-2、YJ-3。

2 方法

2.1 總RNA的提取與文庫構建

采用Trizol Kit （Burlington Co.，加拿大）提取各樣品總RNA, Oligo （dT）磁珠分離純化，將mRNA分解成短基因片段后反轉錄成cDNA鏈，委托北京百邁客生物科技有限公司構建測序文庫。

2.2 轉錄組測序、組裝及功能注釋

采用Illumina Hiseq2500高通量測序平臺對姜黃轉錄組文庫進行測序。截取測序引物，過濾原始序列的低質量數據，得到clean reads。使用Trinity軟件將測序Reads打斷為較短是片段（K-mer），然后將這些片段延伸成較長的片段（Contig），并得到長片段集合Comonent（Unigene）。利用BLAST軟件將Unigene序列與NCBI的非冗余蛋白序列（NR）、Swiss-Prot蛋白序列（Swiss-Prot）、（gene ontology，GO）、直源同源群集數據庫（clusters of orthologous group，COG）、真核同源群數據庫（eukaryotic orthologous groups，KOG）、eggNOG4.5、京都基因與基因組百科全書Kyoto encyclopedia of genes and genomes（KEGG）等數據庫進行比對。使用KOBAS2.0得到了Unigene在KEGG中的KEGG Orthology結果，并得到了Unigene的注釋信息。

2.3 基因表達與差異富集分析

利用TransDecoder軟件預測Unigene的編碼區域及其對應的氨基酸序列。用MISA軟件對大于1 kb的Unigene進行SSR分析。利用STAR軟件對每個樣本的reads和Unigene序列進行比較，并通過GATK針對RNA-Seq的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）識別（SNP Calling）流程，識別SNP位點。在FPKM表達量分析的基礎上，設置錯誤率（false discovery rate，FDR≤0.5）、絕對值差異倍數（Fold Change，FC）≥2，采用DEGseq R進行姜黃轉錄組樣品差異表達分析，使用Goseq R、KOBAS軟件對差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）進行GO、COG、KEGG、KOG、Pfam、eggNOG等的富集分析。

2.4 實時熒光定量PCR（qRT-RCR）驗證

隨機選取5個參與生長素途徑相關差異表達基因進行qRT-RCR驗證，5個差異基因為生長素響應基因16（auxin response factor 16）、生長素運輸蛋白BIG（auxin transport protein BIG）、生長素響應基因12（auxin response factor 12）、吲哚-3-乙酸-酰胺合成酶GH3.1（indole-3-acetic acid-amido synthetase GH3.1）、生長素響應基因7（Auxin transport protein 7），以測序實驗同批次樣品的cDNA為模板，使用為Actin內參基因，利用CDS序列和Primer5軟件設計qRT-PCR特異性引物（表1）。采用SsoFastTMEva Green Su-peremix （Bio-Rad，美國）進行定量表達檢測，同2???Ct方法計算基因的相對表達量。

表1 qRT-RCR擴增特異引物

Table 1 Specific primers of qRT-PCR amplification

基因ID正向引物（5’-3’）反向引物（5’-3’） actinAGGAACCACCGATCCAGACAGGTGCCCTGAGGTCCTGTT c410320.graph_c0CCTGCGGCTTGTGGATTAGTTTCGCTGTGACCTTGGGGA c409034.graph_c0CATGAGGATGACGCAGCAAACCGCAAACTGTCGGAGAACG c397769.graph_c0GGCAACCCCGTAGACATCTGATTCCCAACCTCAACACCCC c405834.graph_c0CTTTCGCTGGTTTGTACCGTTATCCACCTCGTCCGTCTTGTC c404082.graph_c0TACAGGGAGCCAGGCAAGATGCGCTAGGGGGACAGGAAACT

3 結果與分析

3.1 轉錄組測序與注釋

對姜黃主根和側根6個樣品轉錄組文庫進行測序，共獲得42.69 Gb clean data，各樣品clean data均達到6.48 Gb，Q30堿基百分比在93.32%及以上，其中主根70 279 161條clean reads，側根72 305 640條Clean Reads，經過Trinity組裝共得到42 748 條Unigene，50為1768，表明本實驗姜黃轉錄組數據庫質量較高，可用于后續數據分析。

通過選擇BLAST參數E-value不大于1×10?5和HMMER參數E-value不大于1×10?10，最終獲得35 456個有注釋信息的Unigene，統計結果見表2。

3.2 差異表達分析

設置篩選差異條件為FDR＜0.01且FC≥2作為篩選標準，共獲得1551個差異基因，其中側根表達量上調基因為675個，下調基因876個（圖1）。

表2 Unigene注釋統計

Table 2 Statistics of annotated Unigene

數據庫注釋數量長度≥300長度≥1000 COG10 362 4 297 6 065 GO25 66711 90713 760 KEGG20 082 8 93011 152 KOG17 341 7 766 9 575 Pfam24 48010 79413 686 Swissprot18 887 7 96810 919 TrEMBL29 16513 54115 624 eggNOG23 51710 31513 202 nr34 98718 04316 944 All35 45618 45517 001

圖1 姜黃主根側根DEGs統計

3.3 主根、側根DEGs分析

將姜黃和郁金之間的DEGs注釋到GO蛋白質數據庫，按照功能被注釋到生物過程（biological process）、細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）3個大類58個功能小類，富集最多的是細胞組分亞類。與細胞組分相關的功能主要富集于細胞485個、細胞部分485個。與分子功能相關的富集功能主要有結合共622個，有254個DEGs上調和368個DEGs下調。與生物過程有關的功能主要富集在代謝過程489個（圖2）。476條差異基因獲得COG注釋（圖3），在注釋到的26個功能分類中，其中碳水化合物運輸和代謝包含的Unigene數量最多（G，84），其次是信號傳導機制（T，53），一般功能預測項目（R，50）和次生代謝物的生物合成、運輸和分解代謝（C，40）。

圖2 姜黃主根與側根中DEGs的GO功能分類

圖3 姜黃主根與側根轉錄組序列DEGs的COG分類

3.4 DEGs KEGG代謝通路分析

本研究將姜黃與郁金的差異基因在KEGG數據庫對比，結果表明，有909條差異基因被注釋到5個大類中，包括細胞過程、環境信息處理、遺傳信息處理、新陳代謝和生物系統，富集最多的為新陳代謝類。差異基因被富集到115個代謝通路，按照差異基因注釋量大小依次排序，選取前20個代謝通路（表3），主要注釋到植物激素信號轉導（plant hormone signal transduction）、碳代謝（carbon metabolism）、植物-病原互作（plant-pathogen interaction）、內質網蛋白加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、MAPK信號通路-植物（MAPK signaling pathway-plant）、氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）等通路，富集程度最高的代謝通路為植物激素信號轉導，有46個差異基因。在姜黃生長素信號通路途徑上發現了10個生長素受體，相對姜黃主根，上調表達的生長素相關基因有6個，下調表達的4個，生長素IPA合成途徑基因有4個，上調表達3個，下調表達1個（表4），表明相對主根，姜黃側根生長素信號通路途徑更活躍。其次為碳代謝和植物病原菌互作，分別有44、33個差異基因。此外淀粉和蔗糖代謝（29個）、苯丙素生物合成（22個）也有大量差異基因富集。生長素合成和響應關鍵差異表達基因熱圖和生長素促進植物根系生長通路圖見圖4。

表3 姜黃轉錄組DEGs KEGG通路分析統計

Table 3 KEGG pathway classifications of DEGs in C. longa transcriptome

編號通路通路IDDEGs數量 1植物激素信號轉導（plant hormone signal transduction）ko0407546 2碳代謝（carbon metabolism）ko0120044 3植物-病原互作（plant-pathogen interaction）ko0462633 4內質網蛋白加工（protein processing in endoplasmic reticulum）ko0414129 5淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）ko0050029 6MAPK信號通路-植物（MAPK signaling pathway-plant）ko0401629 7氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）ko0123026 8糖酵解/糖異生（glycolysis/gluconeogenesis）ko0001022 9苯丙烷類化合物生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）ko0094022 10剪接體（spliceosome)ko0304019 11氨基糖和核苷酸糖的代謝（amino sugar and nucleotide sugar metabolism）ko0052018 12乙醛酸和二羧酸代謝（glyoxylate and dicarboxylate metabolism）ko0063015 13半胱氨酸和蛋氨酸代謝（cysteine and methionine metabolism）ko0027014 14光合生物中的碳固定（carbon fixation in photosynthetic organisms）ko0071013 15內吞作用（endocytosis）ko0414412 16半乳糖代謝（galactose metabolism）ko0005212 17RNA運輸（RNA transport）ko0301312 18核糖體（ribosome）ko0301011 19丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（alanine, aspartate and glutamate metabolism）ko0025011 20甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（glycine, serine and threonine metabolism）ko0026011

表4 姜黃根中生長素途徑基因

Table 4 Genes of auxin pathway regulated in roots of C. longa

基因編號表達變化基因注釋 c397769.graph_c0上調生長素響應因子（auxin response factor） c391677.graph_c0上調生長素響應因子（auxin response factor SAUR32） c389801.graph_c0上調生長素響應因子（auxin response factor SAUR76） c409034.graph_c0上調生長素響應因子（auxin response factor） c407275.graph_c0上調生長素響應因子（auxin response factor AUX/IAA） c395155.graph_c0上調生長素響應因子（auxin response factor SAUR50） c410320.graph_c0下調生長素響應因子（auxin response factor AUX/IAA） c404082.graph_c0下調生長素響應因子（auxin response factor GH3） c405834.graph_c0下調生長素響應因子（auxin response factor） c407971.graph_c0下調生長素響應因子（auxin response factor AUX/IAA） c396355.graph_c0上調生長素合成酶（auxin response factor YUCCA2） c401872.graph_c0上調生長素合成酶（auxin response factor TAA4） c409165.graph_c0上調生長素合成酶（auxin response factor TAA2） c387677.graph_c0下調生長素合成酶（auxin response factor YUCCA10）

JH1～JH3-主根 YJ1～YJ3-側根

3.5 轉錄因子分析

將所注釋的Unigene與Plant TFDB（Plant transcription factor database）和Animal TFDB （Animal transcription factor database）數據庫進行比較，在姜黃主根與側根差異基因轉錄組數據中共有2510條Unigene被注釋為轉錄因子，最多的轉錄因子類型有 C2H2、bZIP、bHLH、AP2/ERF等，其中數目最多的轉錄因子是C2H2（圖5）。AP2/ERF家族轉錄因子中91個差異基因主要在側根中高表達，反映該家族轉錄因子通過轉錄調控姜黃側根發育中起重要作用。

3.6 qRT-PCR驗證

本研究為驗證轉錄組數據的可靠性，隨機選取5個生長素相關差異表達基因進行qRT-PCR驗證，5個差異基因的相對表達量與轉錄組數據的FPKM值變化趨勢基本上一致（圖6），結果表明生長素響應基因2、生長素響應基因16在側根中表達上調，與轉錄組測序結果趨勢基本一致，說明轉錄組數據結果可靠。

圖5 姜黃轉錄因子家族統計

4 討論

植物側根生長膨大需要能量補充和生物量累積，在淀粉和糖代謝、碳代謝等基礎代謝的共同作用下，側根開始生長發育。本研究通過富集分析發現，姜黃主根和側根在碳代謝、淀粉和糖代謝差異基因富集較多，側根中淀粉和蔗糖代謝相關的基因表達上調，側根膨大和蔗糖和淀粉代謝相關，姜黃側根郁金是作為塊根，淀粉是其生長膨大的原因之一，本研究中淀粉和蔗糖代謝通路富集差異基因較多，蔗糖合成酶通路找到3個基因sucrose synthase 1（）、、上調，基因在植物中可以促進淀粉合成和生長發育，在百合鱗莖[9]、石蒜[10]、鐵棍山藥[11]、白及[12]等植物中得到證實，占雷雷[13]發現促進甘薯塊根膨大，表明蔗糖合成酶可能是促進姜黃側根膨大的重要因素（圖4）。

植物激素是植物體內天然存在的一系列有機化合物，對植物根系發育起著重要的調節作用[14]。主要包括生長素（auxin，IAA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、赤霉素（gibberellin，GA）、細胞分裂素（cytokinin，CTK）、乙烯（ethylene）等。本實驗通過對姜黃主根和側根的轉錄組學差異分析發現，與姜黃根系生長發育相關調控激素的信號轉導通路顯著富集。

1-生長素響應基因16（c410320.graph_c0） 2-生長素運輸蛋白BIG（c409034.graph_c0） 3-生長素響應基因2（c397769.graph_c0） 4-吲哚-3-乙酸-酰胺合成酶GH3.1（c405834.graph_c0） 5-生長素響應基因7（c404082.graph_c0）

生長素是側根形成的主要激素調控因子[15]，和是生長素吲哚-3-丙酮酸（indole-3-pyruvic acid，IPA）合成途徑的關鍵酶[16]，通過轉氨基將色氨酸轉變為IPA，IPA被進而催化為IAA[17]，本研究中生長素合成途徑的3個關鍵基因、和在姜黃側根中表達上調，在側根中促進生長素合成和積累。是生長素早期響應基因家族，在生長素調控下基因通過酸生長理論正向調控植物細胞膨脹[18]，本研究中姜黃的生長素響應基因、和在姜黃側根中表達上調，且上調倍數最高。酸生長理論提出生長素可以激活細胞質膜上的H+-ATP酶，降低細胞原生質體的PH，進而激活細胞壁上相關蛋白促使細胞膨脹[19]。研究發現基因可以在生長素誘導下激活H+-ATP酶，如通過促進磷酸化來激活質膜H+-ATP酶的活性，進而加速擬南芥細胞膨大伸長[20]。可以促進擬南芥側根生長，是將生長素信號整合到乙烯信號中調控擬南芥根生長的，Li等[21]在研究中表明可以促進細胞擴張，可以和乙烯受體ETR2和EIN4相互作用，作為乙烯受體信號轉導下游降低乙烯反應，促進植物生長。Markakis等[22]在擬南芥過表達顯示，擬南芥植株根比敲除擬南芥植株根長20%，用IAA處理擬南芥幼苗后，擬南芥側根原基的的表達量高于對照，證明了在側根發育中的正向調控作用。此外有研究發現在擬南芥中亦可生長素刺激下通過誘導細胞壁酸化來促進細胞伸長[23]，因此推測姜黃側根膨大過程可能和側根中生長素響應基因、和的表達上調有關。

基因家族是不同轉錄因子控制植物發育和生長的共同靶點，其啟動子中有多種轉錄因子結合位點，如AP2/ERF類轉錄因子。AP2/ERF類轉錄因子是植物最大的轉錄因子家族之一，AP2/ERF轉錄因子可響應生長素的調節從而影響植物發育過程，如在楊樹、菊花、擬南芥等植物中可以促進側根生長[24]，在姜黃主根與側根間的DEGs中，篩選出含91個差異基因的AP2/ERF類轉錄因子，此外，在生長素誘導的液體培養基培養后，表達顯著增加[23-24]，故姜黃側根發育可能和AP2/ERF類轉錄因子調控基因家族，特別是SAUR50有關。

本研究通過高通量轉錄組測序，初步揭示了促進姜黃側根生長膨大的基因調控機制，對其中一些關鍵基因進行深入研究，可為姜黃側根發育的生物學機制提供科學依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Screening and analysis of genes related to lateral root development inbased on transcriptome sequencing

LI Yong-ning, YIN Yan-peng, ZHOU Luo-jing, LAN Xin, HOU Fei-xia, PENG Cheng, GAO Ji-hai

State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

The main roots ofform Chinese medicine Jianghuang (), and the lateral roots form Yujin (). Transcriptome sequencing was conducted to explore the differences in the formation process of main roots and lateral roots ofand the molecular mechanism of growth and expansion of ateral roots, so as to explore the key genes promoting lateral root growth and expansion.The main roots and lateral roots ofwere used as materials, and transcriptome sequencing was performed by Illumina HiSeq high-throughput sequencing platform. After assembly and annotation, differentially expressed genes were screened.A total of 42.69 Gb Clean Data and 42 748 Unigenes were obtained by transcriptome sequencing, of which 35 456 were annotated. There were 1551 differentially expressed genes (DEGs) in the main roots and lateral roots. The GO enrichment results showed that the DEGs in the main and lateral roots ofwere mainly enriched in metabolic processes, cellular processes, catalytic processes, transport processes, binding and other functions, and the COG enrichment results showed that the DEGs in the main and lateral roots were mainly enriched in carbohydrate metabolism and signal transduction mechanisms. KEGG enrichment analysis showed that DEGs were mainly enriched in starch and sugar metabolism and plant hormone signaling pathways. The differentially expressed genes related to lateral root development were screened from the annotated information. The key differentially expressed genes and pathway analysis indicated that the up-regulation of sucrose synthase gene and auxin response genes (,,) in the lateral roots ofmay be the influencing factors of the lateral root growth expansion of

L.; transcriptome; main root; lateral root; growth; metabolic processes; cellular processes; catalytic processes; transport processes

R286.12

A

0253 - 2670(2023)14 - 4623 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.023

2022-11-06

西南特色中藥資源多維評價多學科交叉創新團隊（ZYYCXTD-D-202209）；中藥品質性形成分子機制研究四川省青年科技創新研究團隊（22CXTD0009）；川產地道藥材大品種精深加工關鍵技術及產品開發的研究與示范（2020YFN0152）；杏林學者（QNXZ2018017，QNXZ2019001）

李永寧（1998—），男，研究生，研究方向為中藥資源學。E-mail: liyongning2021@163.com

高繼海（1983—），男，副教授，研究方向為中藥資源與開發、種質資源研究。E-mail: gaojihai@cdutcm.edu.cn

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