基于UPLC-Q-TOF/MS技術分析加味左金丸化學成分及指紋圖譜研究

陳會朋，王 銀，余惠旻，周紅祖

基于UPLC-Q-TOF/MS技術分析加味左金丸化學成分及指紋圖譜研究

陳會朋1，王 銀1，余惠旻2*，周紅祖3*

1. 北京中醫藥大學深圳醫院（龍崗），廣東 深圳 518116 2. 深圳大學醫學院，廣東 深圳 518060 3. 深圳市中醫院，廣東 深圳 518033

采用 UPLC-Q-TOF/MS 技術對加味左金丸中的化學成分進行定性分析。色譜柱為ACQUITY Premier BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為乙睛-甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫，體積流量為0.3 mL/min；質譜的離子源為ESI，模式為正、負離子模式。通過質譜給出的分子離子峰和二級質譜碎片離子峰，結合對照品的相對保留時間，參考相關的文獻，對于加味左金丸中的化學成分進行鑒定。并建立不同批次加味左金丸樣品的指紋圖譜。通過對數據的分析，從加味左金丸中鑒定出92個成分，其中包括16個有機酸類成分、34個黃酮類成分、17個生物堿類成分、21個萜類成分與4個其他類成分。建立的加味左金丸指紋圖譜有13個共有峰，分別為黃芩苷、山柰酚-3--葡萄糖苷、槲皮素、漢黃芩素、甘草素、千層紙素A、芍藥苷、吳茱萸次堿、小檗堿、巴馬汀、枸橘苷、橙皮苷、柴胡皂苷d。指紋圖譜方法的精密度、穩定性、重復性良好，多批次加味左金丸的成分基本一致。建立的UPLC-Q-TOF/MS方法對化學成分進行了鑒定，建立的指紋圖譜方法為進一步分析加味左金丸的物質基礎提供了重要依據。

HPLC-MS；加味左金丸；裂解規律；指紋圖譜；黃芩苷；山柰酚-3--葡萄糖苷；漢黃芩素；甘草素；千層紙素A；芍藥苷；吳茱萸次堿；小檗堿；柴胡皂苷d

中成藥由于由多個中藥材組成，同時經過多次提取分離，其化學成分相對較為復雜，研究難度比較大。采用傳統的提取分離鑒定手段，不僅周期長、效率低，同時還不能比較全面地進行分析研究。UPLC-Q-TOF/MS的分析技術作為目前一種快速分析中成藥、中藥材、中藥提取物中化學成分的手段，因其高靈敏度、高效、準確的特點，被廣泛應用于中藥的定性研究中[1-4]。UPLC-Q-TOF/MS一方面可以對相對分子質量進行精確分析，結合數據庫可推導化合物結構，另一方面可以進行二級質譜分析，通過二級質譜中碎片峰，進一步確證其結構，定量與定性雙重分析手段提高了化合物結構確證的準確性。

加味左金丸收載于《中國藥典》2020年版，由黃連（姜炙）、吳茱萸（甘草炙）、黃芩、柴胡、木香、香附（醋炙）、郁金、白芍、青皮（醋炙）、枳殼（去瓤麩炒）、陳皮、延胡索（醋炙）、當歸、甘草14味中藥材組成，具有平肝降逆、疏郁止痛的功效[5]，臨床上用于胃炎、胃潰瘍、結腸炎等[6-13]，同時具有抗腫瘤的活性[14]。目前，通過文獻調研，加味左金丸的成分研究只限于指標含量的測定[15]，未見到對其化學成分進行系統和深入的研究。課題組在前期已經對其進行了指標成分的定量研究與無機元素的分析研究[15-16]，在此基礎上為了進一步剖析其物質基礎與有效成分。本實驗采用高分辨質譜對其含有的化學成分進行定性分析，對該中成藥中化學成分進行精確的相對分子質量測定，通過質譜裂解規律，進而確定其分子式，同時結合參考文獻與對照品準確定位，為加味左金丸的系統深入研究提供研究的基礎。最后，進一步通過建立指紋圖譜，為該中成藥的質量控制提供依據。

1 儀器與材料

1290 Infinity II液相色譜系統（美國Agilent公司）；1260液相色譜系統（美國Agilent公司）；6230 B飛行時間（TOF）液質聯用系統，MassHunter Acquisition 色譜工作站（美國Agilent公司）；Arium?水純化系統（德國Sartorius公司）；Secura125-1C型電子天平（德國Sartorius公司）；SB-1200DT型超聲波清洗器（寧波新芝超聲波儀器有限公司）。

對照品阿魏酸（批號110773-201313，質量分數99.4%）、芍藥苷（批號110736-201842，質量分數97.4%）、黃芩苷（批號110715-201821，質量分數95.4%）、木香烴內酯（批號111524-201710，質量分數99.5%）、去氫木香內酯（批號111525-201912，質量分數99.6%）、延胡索乙素（批號110726-201819，質量分數99.8%）、吳茱萸次堿（批號110801-201608，質量分數99.7%）、鹽酸小檗堿（批號110713-201814，質量分數86.7%）、鹽酸巴馬汀（批號110732-201812，質量分數97.6%）、吳茱萸堿（批號110802-201710，質量分數99.6%）、柚皮苷（批號110722-201815，質量分數91.7%）、橙皮苷（批號110721-201818，質量分數96.2%）、柴胡皂苷a（批號110777-201912，質量分數94.8%）、柴胡皂苷d（批號110778-201912，質量分數96.3%）、槲皮素（批號100081-201610，質量分數98.6%）、漢黃芩素（批號111514-202207，質量分數98.6%），均購自中國食品藥品檢驗研究院。山柰酚-3--葡萄糖苷（批號221011，質量分數99.6%）、甘草素（批號220517，質量分數99.8%）、千層紙素A（批號220106，質量分數99.5%）、枸橘苷（批號220803，質量分數99.6%），購自深圳惠達生物科技有限公司。

加味左金丸為北京同仁堂制藥有限公司生產，批號為1903226、1705061、1705062、1705063、1903501、2005041、2007112、2009021、2011011、2012012、2103022、2105103、2107124、2109121、2111202，分別編號為S1～S15。甲醇、乙腈，色譜純，默克公司。水為超純水，其他試劑均為分析純。2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY Premier BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相A為乙腈-甲醇1∶1，B為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～3 min，5% A；3～10 min，5%～20% A；10～15 min，20%～40% A；15～20 min，40%～60% A；20～30 min，60%～80% A；30～38 min，80%～90% A；體積流量為0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量3 μL。

2.2 質譜條件

離子源為ESI源，采集模式正離子與負離子模式，離子掃描范圍為/100～1500，干燥氣溫度360 ℃，干燥氣體積流量10 L/min，霧化器壓力400 kPa，裂解電壓175 V，毛細管電壓3500 V，碰撞能量30 eV。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質量，超聲30 min（功率250 W、頻率40 kHz），放冷，用50%甲醇補足減失質量，搖勻，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3.2 藥材溶液的制備 按加味左金丸處方比例和工藝，分別制備含單味藥材的樣品，并按“2.3”項下方法制備各藥材溶液。

2.3.3 對照品溶液的制備 精密稱取各對照品適量，置10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，制成質量濃度約為10 μg/mL的對照品溶液。

3 結果

3.1 加味左金丸中化合物的鑒定與分析

取供試品溶液和各藥材溶液，按“2.1”項下的色譜與“2.2”項下的質譜條件，高分辨質譜測定，得到正、負離子模式下的總離子流圖，見圖1。通過質譜給出的分子離子峰和二級質譜碎片離子峰，結合對照品的相對保留時間，參考相關的文獻，從加味左金丸中分離和鑒定出92個成分，包括16個有機酸類成分、34個黃酮類成分、17個生物堿類成分、21個萜類成分與4個其他類成分。其中14個來自枳殼、陳皮和青皮，11個來自甘草，14個來自白芍，6個來自香附，10個來自黃連，2個來自吳茱萸，11個來自黃芩，7個來自延胡索，5個來自木香，5個來自柴胡，6個來自當歸，2個來自郁金，具體結果見表1。

3.2 有機酸類化合物

有機酸類是分子結構中含有羧基的化合物，在中草藥的葉、根、特別是果實中廣泛分布。方中的有機酸類化合物根據羧基相連的結構，主要分為脂肪族類有機酸和芳香族類有機酸。加味左金丸中共鑒定出16個有機酸，包括化合物1、4、5、7、10、12、13、18、45、63、68、73、77、78、82、91。由于結構中都含有羧基，因此質譜中的負離子模式的響應最好，二級質譜容易產生CO2，H2O等中性丟失。例如綠原酸的裂解規律，負離子模式可見其分子離子峰/353 [M－H]?，其特征碎片離子為/191、/179、/173、/161、/135，其中/191與/179是其酰氧鍵斷裂產生的碎片，/191與/179的碎片峰丟失H2O形成/173、/161的碎片峰，/173的碎片峰丟失CO2形成/135的碎片峰，經與文獻報道[33]對比，確定該化合物為綠原酸。例如沒食子酸的質譜裂解規律，負離子模式可見其分子離子峰/169 [M－H]?，其特征碎片離子為/125、107、97，分別為分子離子峰丟失CO2、CO2與H2O、CO2與CO產生的裂解的碎片，經與文獻報道[34]對比，確定該化合物為沒食子酸。

圖1 加味左金丸提取液的UPLC-Q-TOF/MS總離子流色譜圖

表1 加味左金丸提取液中化合物的UPLC-Q-TOF/MS定性分析結果

Table 1 Qualitative analysis results of chemical constituents in Jiawei Zuojin Pill extracting solution by UPLC-Q-TOF/MS

峰號tR/min準分子離子峰分子式實測值(m/z)理論值(m/z)誤差(×10?6)碎片離子化合物名稱來源植物 10.65[M－H]?C7H12O6191.053 8191.054 5?3.66127.103 4, 109.044 1, 93.160 4奎寧酸陳皮、青皮、枳殼[17] 21.26[M＋H]+C27H30O15595.165 2595.165 9?1.18577.165 3, 433.117 3新西蘭牡荊苷II甘草[18] 31.43[M＋H]+C27H30O14579.184 1579.184 7?1.04136.065 1野漆樹苷陳皮、青皮、枳殼[17] 41.78[M－H]?C7H6O5169.013 3169.013 5?1.18125.023 2沒食子酸白芍[19] 52.68[M－H]?C6H8O7191.019 6191.019 31.57173.008 3, 129.021 3檸檬酸白芍[19] 63.72[M－H]?C23H28O14S559.112 8559.112 30.89530.106 1, 397.074 5氧化芍藥苷亞硫酸酯白芍[19] 74.31[M－H]?C9H10O3165.056 3165.055 54.85121.066 4, 119.050 1, 93.034 5對羥基苯丙酸甘草[20] 85.11[M＋H]+C23H28O12497.166 5497.165 71.61467.153 3, 359.127 4, 335.112 7氧化芍藥苷白芍[19] 95.23[M＋H]+C23H28O11481.170 6481.170 30.62319.117 1, 301.107 5, 197.080 4芍藥內酯苷白芍[20] 105.51[M－H]?C10H10O5209.046 2209.045 62.87165.056 6, 121.065 3對羥基芐基丙二酸甘草[20] 115.92[M＋H]+C15H23NO234.178 6234.177 40.85146.173 2rotundine B香附[21] 126.43[M－H]?C15H14O6289. 070 1289. 071 3?0.69271.060 6, 181.070 2兒茶素白芍[19] 136.91[M－H]?C16H18O9353.087 2353.086 51.98191.064 2, 179.043 1, 161.021 6綠原酸黃連[18] 147.88[M＋H]+[M－H]?C15H12O4257.080 6255.080 4257.080 9255.080 9?1.17?1.96147.044 1, 137.023 3, 135.009 22',4,4'-三羥基查耳酮甘草[20] 158.93[M＋H]+C18H13N3O288.114 1288.114 7?2.08273.089 8, 244.087 5217.076 9, 190.066 2吳茱萸次堿*吳茱萸[22-23] 1610.14[M－H]?C23H28O13S543.116 9543.117 3?0.74513.106 5, 381.075 3芍藥苷亞硫酸酯白芍[19] 1711.05[M－H]?[M＋H]+C21H18O11445.085 2447.085 7445.084 9447.084 90.671.79269.046 3黃芩苷*黃芩[24] 1811.63[M＋H]+C16H24O8345.051 3344.047 11.98181.052 7, 161.065 8牡丹皮苷F白芍[19] 1912.02[M＋H]+C15H23NO234.178 2234.177 33.84216.173 5, 188.172 8, 160.162 6, 146.175 2(+)-β-rotunol香附[21] 2012.64[M＋H]+C20H17NO5352.116 5352.117 4?2.56337.091 4, 322.399 8, 308.088 9, 294.072 9氧化小檗堿黃連[25] 2113.42[M＋H]+C26H28O14565.154 7565.155 3?1.06433.114 2, 415.105 2夏佛托苷甘草[18] 2213.62[M＋H]+C17H18O6319.116 8319.117 8?3.13301.106 5, 197.080 6, 105.033 2, 77.039 3芍藥內酯C白芍[20] 2313.78[M＋H]+C21H25NO4356.177 8356.178 5?1.97340.154 1, 308.128 4, 192.101 6, 177.078 1, 148.075 8異紫堇球堿延胡索[26] 2414.22[M＋H]+C20H19NO5354.125 3354.126 1?2.26336.123 2, 188.070 3, 149.059 4, 135.044 3原阿片堿延胡索[26] 2514.22[M＋H]+C21H25NO4356.178 8356.178 21.68178.086 5, 163.062 4, 151.057 6延胡索乙素*延胡索[26] 2614.51[M＋H]+C21H23NO5370.156 9370.157 4?1.35342.169 4, 295.069 1, 206.081 5隱品堿延胡索[26] 2714.73[M＋H]+C21H25NO4356.177 7356.178 2?1.40340.154 1, 310.119 5, 292.096 2海罌粟堿延胡索[26]

續表1

峰號tR/min準分子離子峰分子式實測值(m/z)理論值(m/z)誤差(×10?6)碎片離子化合物名稱來源植物 2815.33[M－H]?C26H28O13547.154 5547.153 12.56487.114 5, 457.107 2, 367.076 1, 337.069 4白楊素-6-C-阿拉伯糖- 8-C-葡萄糖苷黃芩[24] 2915.56[M＋H]+C23H28O11481.172 1481.171 21.87451.160 1, 359.135 9, 329.122 2芍藥苷*白芍[19] 3015.76[M]+C20H24NO4342.169 1342.169 6?1.46297.115 2, 265.091 3木蘭堿黃連[18] 3115.84[M－H]?[M＋H]+C21H18O11445.086 1447.083 9445.084 4447.084 43.82?1.12269.060 5, 225.040 3197.040 2去甲漢黃芩素-7-O- β-D-葡萄糖醛酸苷黃芩[24] 3217.17[M－H]?C36H58O10649.237 2649.236 21.54487.081 5長梗冬青苷陳皮、青皮、枳殼[17] 3318.41[M－H]?C27H32O15595.176 9595.177 6?1.18287.084 1, 151.039 5圣草枸杞苷陳皮、青皮、枳殼[17] 3418.72[M＋H]+C11H13NO3208.096 3208.096 8?2.40165.094 6, 150.073 2唐松草林堿黃連[18] 3518.91[M＋H]+C21H19NO4350.132 1350.131 12.86334.107 2, 320.091 4, 304.096 2, 290.081 7 二氫白屈菜紅堿延胡索[26] 3619.13[M－H]?C27H32O15595.176 9595.177 8?1.51287.089 4, 151.160 1, 135.096 7新圣草枸杞苷陳皮、青皮、枳殼[17] 3719.65[M＋H]+C15H10O7303.049 2303.049 5?0.99257.043 1, 229.051 3槲皮素*甘草[18] 3820.21[M＋H]+C21H20O12465.103 8465.103 41.29303.051 5, 285.039 5, 257.044 3金絲桃苷白芍[19] 3920.66[M＋H]+C21H20O11449.107 3449.108 3?2.23287.055 4, 153.081 6,135.024 3山柰酚-3-O-葡萄糖苷*白芍[19] 4021.13[M＋H]+C15H12O4257.080 5257.080 8?1.17239.073 1, 137.027 2甘草素*甘草[18] 4121.24[M－H]?C27H32O14579.167 6579.168 7?1.90433.167 2, 271.090 6, 153.001 4柚皮苷*青皮、枳殼[17]，陳皮[21] 4221.38[M＋H]+C15H20O2233.153 1233.153 6?2.14215.143 2, 187.147 1, 159.116 5, 145.100 4, 131.084 1, 119.084 2, 105.069 5, 91.053 4, 81.069 6木香烴內酯*木香[27-28] 4321.86[M－H]?[M＋H]+C16H12O6299.063 8301.064 1299.063 3301.063 31.672.66286.038 15,7,4′-三羥基-8-甲氧基黃酮黃芩[24] 4422.41[M＋H]+C15H20O3249.148 6249.148 21.61231.138 3, 203.143 1, 213.125 1, 185.131 6, 157.099 4, 143.084 4珊塔瑪內酯木香[28] 4522.48[M＋H]+C12H14O3207.101 7207.101 41.45137.059 2, 165.090 4乙酸丁香酚酯木香[28] 4622.56[M－H]?C27H32O14579.169 8579.168 71.90271.090 1, 151.001 7蕓香柚皮苷青皮、枳殼[17]、陳皮[21] 4722.87[M＋H]+C15H22O2235.169 5235.169 21.28161.133 5木香酸木香[28] 4823.15[M＋H]+C15H18O2231.138 8231.138 22.60213.127 4, 195.116 2, 185.132 1, 180.093 2, 175.076 3, 165.069 3, 157.101 4, 143.085 2, 128.062 5去氫木香內酯*木香[27-28] 4923.54[M＋H]+C28H34O15611.173 9611.174 6?0.82449.119 2, 303.099 3, 195.096 1橙皮苷*青皮、枳殼[17]、陳皮[21] 5023.63[M－H]?C15H10O6285.040 9285.040 41.75199.040 5, 175.042 1, 151.005 3, 133.031 4木犀草素黃芩[29]

續表1

續表1

峰號tR/min準分子離子峰分子式實測值(m/z)理論值(m/z)誤差(×10?6)碎片離子化合物名稱來源植物 7833.22[M－H]?C18H30O2277.216 4277.217 2?2.89255.216 6, 248.217 3, 219.216 3, 206.216 2亞麻酸當歸[30] 7933.38[M＋H]+C16H12O5285.075 1285.075 9?2.81270.052 8千層紙素A*黃芩[18] 8034.31[M－H]?C17H14O6313.072 6313.071 14.79298.049 6, 295.228 2, 283.024 6, 255.024 7, 164.982 5二羥基-二甲氧基黃酮黃芩[29] 8134.45[M＋H]+C15H24O2237.177 1237.177 3?0.84219.172 7, 201.175 1isocorymbolone香附[21] 8235.06[M－H]?C18H34O2281.248 6281.250 2?5.69255.252 2, 164.253 1, 130.241 1十八烯酸當歸[30] 8335.22[M＋H]+C20H20O7373.121 5373.120 13.75357.128 3, 343.125 2, 329.123 8, 312.115 3甜橙黃酮青皮、枳殼、陳皮[21] 8435.43[M＋H]+C21H22O8403.119 9403.119 41.24388.105 4, 373.108 3, 355.089 0, 358.098 1, 330.006 7, 327.065 3川陳皮素青皮、枳殼[17]、陳皮[21] 8535.58[M－H]?C15H10O4253.050 8253.050 60.79209.063 3, 143.054 3, 63.039 1白楊素黃芩[29] 8636.14[M－H]?C28H34O14593.124 2593.124 10.17447.289 8, 285.082 6, 270.079 2枸橘苷*陳皮、青皮、枳殼[17] 8736.77[M＋H]+C15H24O2237.176 3237.176 4?0.42219.173 9, 201.174 6, 179.172 4cypersol B香附[21] 8836.98[M＋H]+C19H22O6343.109 7343.109 50.58327.103 3, 313.103 8, 299.105 1, 282.103 5黃芩配基甲醚青皮、枳殼、陳皮[21] 8937.35[M＋H]+C22H24O9433.141 4433.140 52.08418.142 9, 403.148 2, 385.143 63,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮青皮、枳殼、陳皮[21] 9037.35[M＋H]+C15H22O219.167 2219.167 4?0.91201.163 3, 163.167 3, 145.165 1, 135.163 4香附烯酮香附[21] 9137.76[M＋H]+C16H22O4279.159 8279.159 22.15205.085 6, 149.023 8, 57.069 3鄰苯二甲酸二丁酯白芍[20] 9237.76[M＋H]+C15H22O219.168 9219.168 42.28201.165 5, 163.168 1, 145.166 3, 135.167 2α-香附酮香附[21]

*該化合物是由對照品進行指認

*This compound was identified using reference standards

3.3 黃酮類化合物

黃酮類化合物廣泛存在于自然界的植物中，是以黃酮（2-苯基色原酮）為母核而衍生的一類黃色色素，以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物，在植物體內大部分與糖結合成苷類的形式存在，也有的以游離形式存在。根據三碳鍵（C3）結構的氧化程度和B環的連接位置等特點，黃酮類化合物可分為下列幾類：黃酮和黃酮醇；黃烷酮（又稱二氫黃酮）和黃烷酮醇（又稱二氫黃酮醇）；異黃酮；異黃烷酮（又稱二氫異黃酮）；查耳酮；二氫查耳酮；橙酮；黃烷和黃烷醇。糖基多連在C8或C6位置上，以氧苷為主，連接的糖有單糖（葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等），雙糖（槐糖、龍膽二糖、蕓香糖等）、三糖（龍膽三糖、槐三糖等）與酰化糖（2-乙酰葡萄糖、嗎啡酰葡萄糖等）。加味左金丸中共鑒定出黃酮共34個，其中黃酮苷元19個、黃酮苷15個。按母核的結構不同，包括黃酮20個、二氫黃酮10個、黃酮醇3個、查耳酮1個。黃酮類化合物在質譜中的裂解方式，主要有CO、CO2等中性離子丟失、丟失側鏈基團，糖基的斷裂，C環發生RDA裂解等。以二氫黃酮苷類成分柚皮苷為例，負離子模式可見其分子離子峰/579 [M－H]?，其特征碎片離子為/433、/271、/153，其中/433為準分子離子峰脫去鼠李糖得到的碎片峰，/271為碎片峰/433脫去1分子葡萄糖產生的，/153是碎片峰/271發生逆-狄爾斯-阿爾德反應（RDA）裂解，丟失/120中性碎片得到的，經與文獻報道[35]對比，確定該化合物為柚皮苷。以黃酮類成分漢黃芩素為例，正離子模式可見其分子離子峰/285 [M＋H]+，負離子模式可見其分子離子峰/283 [M－H]?，其特征碎片離子為/268、/240、/239、/224，其中/268為準分子離子峰脫去甲基得到的碎片峰，/240為碎片峰/268脫去-CO得到的碎片峰，/240為碎片峰/268脫去-COH得到的碎片峰，/224為碎片峰/268脫去-COH得到的碎片峰，經與文獻報道[24]對比，確定該化合物為漢黃芩素，其二級質譜圖見圖2，可能的裂解途徑見圖3。

3.4 生物堿類化合物

生物堿是存在于自然界中的一類含氮的堿性有機化合物，有顯著的生物活性，是中草藥中重要的有效成分之一。加味左金丸中鑒定得到17個生物堿類成分，主要來在于黃連、吳茱萸和延胡索。生物堿的類型主要為異喹啉類生物堿和吲哚類生物堿，異喹啉類生物堿主要來自于黃連和延胡索，如表小檗堿、小檗堿、氧化小檗堿、巴馬汀等；吲哚類生物堿主要來自于吳茱萸，如吳茱萸次堿和吳茱萸堿。以異喹啉類生物堿原小檗堿型的小檗堿舉例，正離子模式下的分子離子峰為/336 [M]+，其特征碎片離子為/321、/320、/292，其中/320為準分子離子峰失去端基上的甲基并發生氫重排得到的碎片峰，/292為碎片峰/320脫去-CO產生的，經與文獻報道[35]對比，進一步對比對照品確定該化合物為小檗堿。以異喹啉類生物堿氧化小檗堿型的氧化小檗堿舉例，正離子模式下的分子離子峰為/352 [M＋H]+，其特征碎片離子為/337、/322、/308、/294，其中/337為準分子離子峰失去甲基得到的碎片峰，其中/322為/337碎片峰失去端基上的甲基并發生氫重排得到的碎片峰，/308為/337碎片峰失去-CHO得到的碎片峰，/294為/308碎片峰失去甲基得到的碎片峰，經與文獻報道[25]對比，確定該化合物為氧化小檗堿，其二級質譜圖見圖4，可能的裂解途徑見圖5。以吲哚類生物堿的吳茱萸次堿舉例，正離子模式下的分子離子峰為/288 [M＋H]+，其特征碎片離子為/273、244、217、190，其中/273為準分子離子峰失去-CH3得到的碎片峰，其中/244為/273碎片峰丟失-HCO的碎片峰，/217為/244碎片峰失去-HCN得到的碎片峰，/190為/217碎片峰失去-HCN得到的碎片峰，經與文獻報道[23]對比，進一步對比對照品確定該化合物為吳茱萸次堿，其二級質譜圖見圖6，可能的裂解途徑見圖7。

圖2 漢黃芩素的MS/MS圖

圖3 漢黃芩素可能的裂解途徑

圖4 氧化小檗堿的MS/MS圖

圖5 氧化小檗堿可能的裂解途徑

3.5 萜類化合物

萜類化合物是由甲戊二羥酸衍生、且分子骨架以異戊二烯單元（C5單元）為基本結構單元的化合物及其衍生物，在自然界中，萜類化合物分布很廣，有些具有生理活性。根據分子中包括異戊二烯單位的數目將萜類可分為單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜、多萜。加味左金丸中鑒定得到21個萜類成分，有倍半萜類、倍半萜內酯類、單萜類和三萜類。倍半萜類化合物有α-香附酮、香附烯酮、石竹烯氧化物、isocorymbolone、cypersol B；倍半萜內酯類化合物有去氫木香烴內酯、木香烴內酯、珊塔瑪內酯、木香酸；單萜類化合物主要來自于白芍，有氧化芍藥苷亞硫酸酯、氧化芍藥苷、芍藥苷亞硫酸酯、芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥內酯C；三萜類化合物主要來自于柴胡，有柴胡皂苷 D、柴胡皂苷 A、柴胡皂苷C、4″--乙酰基柴胡皂苷D、柴胡皂苷G、長梗冬青苷。以倍半萜內酯類化合物去氫木香烴內酯舉例，正離子模式下的分子離子峰為/231 [M＋H]+，其特征碎片離子為/213、195、185、180、175、165、157、143、128，其中/213為準分子離子峰失去1分子H2O得到的碎片峰，其中/195為準分子離子峰失去2分子H2O得到的碎片峰，其中/185為/213碎片峰失去CO得到的碎片峰，經與文獻報道[28]對比，確定該化合物為去氫木香烴內酯。以三萜皂苷類化合物柴胡皂苷G舉例，負離子模式下的分子離子峰為/779 [M－H]?，根據精確相對分子質量可確定其分子式為C42H68O13，其特征碎片離子為/617、471，其中/617為母離子峰失去1分子半乳糖得到的碎片峰，其中/471為/617碎片峰失去1分子的葡萄糖得到的碎片峰，經與文獻報道[29]對比，確定該化合物為柴胡皂苷G。

圖6 吳茱萸次堿的MS/MS圖

圖7 吳茱萸次堿可能的裂解途徑

3.6 指紋圖譜的建立

3.6.1 色譜條件 指紋圖譜的色譜條件為：色譜柱為Atlantis T3 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為乙腈，流動相B為0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，5% A；5～40 min，5%～40% A；40～60 min，40%～60% A；60～90 min，60%～80% A；90～94 min，80%～5% A；94～104 min，5% A；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長220 nm；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。液相色譜圖見圖8。

3.6.2 精密度試驗 取同一批次（1903226）的樣品，按“2.3.1”項方法制備成供試品溶液，作為精密度試驗溶液，按“3.6.1”項下的色譜條件，供試品溶液連續進樣6次測定。由于12號峰（橙皮苷）面積最大，同時分離度符合要求，因此選擇此峰為參照峰。以12號峰為參照峰，計算13個共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于4.0%，表明方法的精密度良好。

3.6.3 重復性試驗 取同一批次（1903226）的樣品，精密稱取6份，按“2.3.1”項方法制備成供試品溶液，作為重復性試驗溶液，按“3.6.1”項下的色譜條件，進樣測定。以12號峰為參照峰，計算13個共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于4.0%，表明該檢測方法重復性良好。

3.6.4 穩定性試驗 按“2.3.1”項方法制備成供試品溶液，作為穩定性試驗溶液，按“3.6.1”項下的色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、16、18、24、36、48 h進行測定。以12號峰為參照峰，計算13個共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于2.0%，相對峰面積的RSD均小于4.0%，表明48 h內供試品溶液的穩定性良好。

3.6.5 指紋圖譜的建立及相似度評價 將15批加味左金丸按“2.3.1”項方法制成供試品溶液，按“3.6.1”項指紋圖譜的色譜條件對其進行檢測，記錄色譜圖，數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，以S1號樣品的色譜圖為參照圖譜進行全譜峰匹配，經過與對照品比對，指認了13個共有峰，1號峰為黃芩苷、2號峰為山柰酚-3--葡萄糖苷、3號峰為槲皮素、4號峰為漢黃芩素、5號峰為甘草素、6號峰為千層紙素A、7號峰為芍藥苷、8號峰為吳茱萸次堿、9號峰為小檗堿、10號峰為巴馬汀、11號峰為枸橘苷、12號峰為橙皮苷、13號峰為柴胡皂苷d。15批加味左金丸樣品的指紋疊加圖譜，見圖9，各批樣品與對照圖譜的相似度分別為0.972、0.977、0.979、0.981、0.991、0.984、0.992、0.991、0.992、0.985、0.982、0.984、0.990、0.979、0.988。結果顯示，15批加味左金丸與對照譜圖的相似度均在0.95以上，這表明15批次加味左金丸質量的穩定性和均一性良好。

1-黃芩苷 2-山柰酚-3-O-葡萄糖苷 3-槲皮素 4-漢黃芩素 5-甘草素 6-千層紙素 A 7-芍藥苷 8-吳茱萸次堿 9-小檗堿 10-巴馬汀 11-枸橘苷 12-橙皮苷 13-柴胡皂苷d

4 討論

為了對加味左金丸的物質基礎進行深入的研究，本研究采用具有強大分離鑒定能力的高分辨質譜技術對于加味左金丸的化學成分進行系統分析。實驗中供試品的提取方式采用藥典中的方法，但是本研究對于提取溶劑和提取時間也進一步進行了確認，因為處理過程中溶劑會有變化和時間也會產生誤差，因此分別考察了該樣品處理方式的耐用性范圍。本研究主要對于色譜條件和質譜條件進行了較為系統、全面的優化，以便提高質譜的分離鑒定能力。首先對于色譜條件進行了優化，在流動相考察中，分別考察了乙腈水溶液、甲醇水溶液、甲醇乙腈水溶液、乙腈甲酸水溶液、甲醇甲酸水溶液、乙腈乙酸銨水溶液，甲醇乙酸水溶液，綜合分離度和分離的峰個數確定了乙腈甲醇甲酸水溶液體系。在色譜柱考察中，不僅僅對于不同廠家的C18柱進行了考察，而且對于其他類型的填料也進行了考察，由于是UPLC體系，體積流量不能太高，樣品必須進行濾過，進樣量也要進行優化，以免超載進樣。其次對于質譜條件進行了優化，由于中成藥中成分較為復雜，有些酸性成分在負離子模式的響應更好，因此采用了正、負離子模式同時進行采樣，同時對于二級質譜的碰撞能量進行了優化，以便得到更多的碎片峰信息，有利于質譜數據解析。

圖9 15批加味左金丸指紋圖譜

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技術共鑒定了92個化學成分，主要包括16個有機酸類成分、34個黃酮類成分、17個生物堿類成分、21個萜類成分與4個其他類成分。加味左金丸具有平肝降逆、疏郁止痛的功效，研究證明復方中君藥黃連中的生物堿具有抗氧化和消炎的作用[36-37]，復方中君藥吳茱萸中的生物堿具有鎮痛、鎮靜安神的作用[38]，臣藥黃芩中的黃酮具有抗菌、抗炎、免疫調節、鎮靜和解熱的作用[39]。加味左金丸中多個成分共同發揮作用，使其臨床廣泛用于胃炎、食管炎與慢性結腸炎等疾病的治療。基于化學成分的研究，為了更好地控制該中成藥的質量，本實驗建立了該中成藥的液相指紋圖譜，對于多批次的樣品進行了測定，也通過數據表明樣品質量的穩定性。

本研究首次對加味左金丸中多種化學成分進行了系統的分離和鑒定，基本闡明了該中成藥中的化學成分的種類，并對各個成分進行了藥材來源的歸屬，為加味左金丸的藥效的基礎研究提供參考。當然，在整個研究過程中，有一些化學成分還未鑒定，需要后續做進一步的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical components and chromatographic fingerprints of Jiawei Zuojin Pill based on UPLC-Q-TOF/MS

CHEN Hui-peng1, WANG Yin1, YU Hui-min2, ZHOU Hong-zu3

1. Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Shenzhen 518116, China 2. School of Medicine, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China 3. Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, China

To qualitatively analyze the main chemical constituents of traditional Chinese medicine compound Jiawei Zuojin Pill (加味左金丸) by using UPLC-Q-TOF/MS technology.The separation was performed on ACQUITY Premier BEH C18column (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm), and the gradient elution of acetonitrile-methanol-0.1% formic acid was used as mobile phase at a flow rate of 0.3 mL/min. The data was collected by the positive and negative ion modes using Q-TOF/MS and ESI source. The main chemical constituents of Jiawei Zuojin Pill were identified according to the exact molecular mass, the cleavage fragments of MS/MS, the literature data, and the reference control. And chromatographic fingerprints of different batches of Jiawei Zuojin Pill were established.A total of 92 chemical components were identified in Jiawei Zuojin Pill, including 16 organic acids, 34 flavonoids, 17 alkaloids, 21 terpenoid and four other components. The HPLC fingerprint of Jiawei Zuojin Pill was established with 13 common peaks, which were baicalin, astragalin, quercetin, wogonin, liquiritigenin, oroxylin A, paeoniflorin, rutecarpine, berberine, palmatine, poncirin, hesperidin, saikosaponin d. And the precision, stability and reproducibility of the HPLC fingerprint were acceptable. The components in different batches of Jiawei Zuojin Pill were basically similar.This study showed that UPLC-Q-TOF/MS technology provided a rapid and accurate method for the identification of chemical constituents in Jiawei Zuojin Pill. The HPLC fingerprint could provide an important basis for the quality control and pharmacodynamic material basis study of Jiawei Zuojin Pill.

HPLC-MS; Jiawei Zuojin Pill; fragmentation patterns; fingerprint; baicalin; astragalin; wogonin; liquiritigenin; oroxylin A; paeoniflorin; rutecarpine; berberine;saikosaponin d

R284.1

A

0253 - 2670(2023)14 - 4442 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.005

2023-01-19

深圳市基礎研究專項（自然科學基金）基礎研究面上項目（JCYJ20220531102208019）；2022年深圳市藥學會醫院藥學研究基金（恒瑞基金）（SZ2022A25）；深圳大學聚徒＋創研項目（2022年度）

陳會朋（1988—），男，主管中藥師，研究方向為中藥復方研究。Tel: 13410898605 E-mail: 372677278@qq.com

余惠旻，男，博士，副研究員，主要從事中藥及其復方的現代藥理研究。E-mail: yuhuimin@szu.edu.cn

周紅祖，女，主任中藥師，中藥特色技術傳承人（粵中醫辦函[2016]54號），主要從事中藥學基礎及中藥藥理、鑒定研究。E-mail: zhouhzu@163.com

[責任編輯 王文倩]