雙功能型纖溶酶的研究進展

嚴(yán)慧 周晶晶 林宏峻 唐明青

摘要： 綜述雙功能型纖溶酶（dFE）的物種來源，介紹雙功能型纖溶酶的純化工藝和酶活特性，為其進一步開發(fā)提供參考.結(jié)果表明：雙功能型纖溶酶是一種同時具有纖溶酶原激活功能和纖維蛋白直接降解功能的新型纖溶物質(zhì)，其來源廣泛，多為微生物來源；分離純化工藝繁瑣，以多層色譜為主；大多體現(xiàn)絲氨酸蛋白酶活性特征，受金屬離子、pH值和蛋白酶抑制劑影響較大.

關(guān)鍵詞： 纖溶酶原； 纖維蛋白； 纖溶酶； 纖溶； 血栓

中圖分類號： Q 71文獻標(biāo)志碼： A ??文章編號： 1000-5013（2023）04-0427-08

Research Progress of Dual-Functional Fibrinolytic Enzyme

YAN Hui， ZHOU Jingjing， LIN Hongjun， TANG Mingqing

（School of Medicine， Huaqiao University， Quanzhou 362021， China）

Abstract： The species origin of dual-functional fibrinolytic enzyme （dFE） was reviewed，and the purification processes and enzyme activity characteristics of dFE were introduced to provide reference for its further development. The results showed that dFE was a novel fibrinolytic agent with both the functions of plasminogen activation and direct fibrinolysis. It had a wide range of sources， mostly microorganisms sources. The separation and purification processes were complicated， mainly based on multi-layer chromatography. It mostly exhibited the enzymatic characteristics of serine proteinase，and was greatly affected by metal ions， pH value and protease inhibitors.

Keywords：

plasminogen； fibrin； fibrinolytic enzyme； fibrinolysis； thrombosis

血栓性疾病嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，其發(fā)病率高居各種疾病之首，且近年來還有漸增之勢，是當(dāng)代醫(yī)學(xué)研究的重點和熱點之一［1］.目前，用于臨床溶栓治療的溶栓制劑按其作用機制可以分為纖溶酶原激活劑（PA）和纖維蛋白溶解劑兩大類.纖溶酶原激活劑主要將體內(nèi)的纖溶酶原激活成活性的纖溶酶，再發(fā)揮溶栓效應(yīng)，如組織型纖溶酶原激活劑（tPA）、尿激酶（UK）、鏈激酶（SK）等［2-4］.纖維蛋白溶解劑則能夠直接降解纖維蛋白，溶解血栓，如各種蛇毒金屬蛋白酶（SVMP）和纖溶酶［5］.不同的溶栓分子機制決定了兩類溶栓制劑的優(yōu)缺點，如纖溶酶原激活劑具有較好的靶向性和安全性，但溶栓效果卻嚴(yán)重依賴于患者自身的纖溶酶原水平；纖維蛋白溶解劑能獨立快速溶解血栓，但卻容易被血清中的各種抑制劑抑制，靶向性也較差［6-7］.

雙功能型纖溶酶（dual-functional fibrinolytic enzyme，dFE）是一種新型纖溶物質(zhì)，同時具有纖溶酶原激活效應(yīng)和纖維蛋白直接溶解效應(yīng).由于雙功能型纖溶酶能夠很好地彌補現(xiàn)有纖溶藥物的不足.鑒于此，本文對雙功能型纖溶酶的物種來源、純化工藝及酶活特性進行較為全面的綜述.

1 雙功能型纖溶酶的物種來源

作為中國傳統(tǒng)中藥，地龍（earthworm）又稱蚯蚓、土龍等，是目前已知最早的具有醫(yī)書記載的抗血栓藥材之一.最新版《中國藥典》中明確顯示地龍具有通絡(luò)功效，可用于治療中風(fēng)半身不遂［8］，這正是地龍抗栓溶栓的最直接體現(xiàn).目前，已有多種以地龍為主藥的復(fù)方或中成藥用于血栓的臨床治療，如各種（復(fù)方）地龍（溶栓）膠囊［9-10］.雖然地龍的抗栓溶栓功效已得到廣泛的印證，但具體效應(yīng)物質(zhì)卻尚未明確.直到1991年，Hisashi等［11］才從粉正蚓（Lumbricus rubellus）中分離得到一種同時在含纖溶酶原的纖維平板和不含纖溶酶原的纖維平板中顯示纖溶效應(yīng)的物質(zhì).進一步的劃段純化表明，這類物質(zhì)是由類糜蛋白酶（chymotrypsin-like enzyme）、類胰蛋白酶（trypsin-like enzyme）和未知類型蛋白酶組成的混合物，并將此類混合物質(zhì)命名為蚓激酶（lumbrokinase）.除粉正蚓外，后續(xù)研究表明，不同的蚯蚓品系均存在此類雙功能型纖溶酶，但不同品系之間的酶的氨基酸組成、分子質(zhì)量和酶活特性存在明顯差異［12-14］.

方格星蟲（Sippunculus nudus），又名土筍、沙蟲、海蚯蚓，是閩南名小吃“土筍凍”中的主要原材料.除形態(tài)結(jié)構(gòu)的高度相似性外，星蟲與蚯蚓在分類學(xué)中也具有高度的相似性，同屬于螺旋卵裂動物（Spiralia）、冠輪動物總門（Lophotrochozoa）、環(huán)節(jié)動物門（Annelida）.目前，課題組已在方格星蟲中分離鑒定出多種雙功能型纖溶酶（申請?zhí)?專利號：202310108470.9）.通過多層色譜、親和純化和蛋白結(jié)晶，課題組首次獲得2個方格星蟲纖溶酶（SFE）的蛋白晶體（PDB：8HZO，8HZP），通過晶體結(jié)構(gòu)分析，獲得SFE的關(guān)鍵三聯(lián)體催化位點信息，同時完成了首個方格星蟲的全基因測序（CNGB：CNP0003708），成功預(yù)測出17個纖溶酶基因.除方格星蟲外，在可口革囊星蟲（Phascolosoma esculenta）中也發(fā)現(xiàn)了大量的雙功能型纖溶酶，但其含量比方格星蟲略低.

目前，在微生物、藻類、蛭類、昆蟲、蘑菇和植物中都已經(jīng)分離出大量的雙功能型纖溶酶.其中，微生物來源占據(jù)了絕大部分，這可能與微生物特殊代謝通路有關(guān)，也可能與龐大的微生物種群有關(guān).在這些已報道的微生物中，又以細(xì)菌尤其是桿菌（Bacillus）為主.微生物來源的雙功能型纖溶酶，如表1所示.

2 雙功能型纖溶酶的分離純化

與傳統(tǒng)天然蛋白的分離純化相似，天然雙功能型纖溶酶的純化也主要根據(jù)蛋白的極性、電荷、溶解性、分子質(zhì)量、等電點等特性進行分離純化，都需要經(jīng)過原液制備、蛋白粗制、蛋白精制、產(chǎn)品鑒定4個階段.雙功能型纖溶酶的純化工藝，如表2所示.表2中：z為產(chǎn)品活性.

蛋白粗制主要實現(xiàn)將原液中的蛋白進行初步的濃縮，同時去除部分溶解性差的或者分子結(jié)構(gòu)差異巨大的蛋白類、脂質(zhì)、糖類及小分子.目前，最常用的是采用飽和硫酸銨沉淀或乙醇沉淀或丙酮沉淀，再經(jīng)過透析或揮發(fā)去除殘余沉淀劑.如果知道目的蛋白的等電點的話，可以進一步結(jié)合等電點沉淀，進一步提高沉淀效率和純度.以SFE為例，課題組在進行SFE粗制時發(fā)現(xiàn)，硫酸銨對SFE的沉淀效率比乙醇高，而且沉淀物極易溶于緩沖液，而乙醇沉淀物不易溶于緩沖液，纖溶酶活性損失大，而且體積分?jǐn)?shù)為20%的飽和硫酸銨初級沉淀能有效去除大量的雜蛋白.因此，在實際操作中，根據(jù)目標(biāo)SFE蛋白的等電點為4，建立SFE粗制工藝：體積分?jǐn)?shù)為20%的飽和硫酸銨沉淀8 h（pH=7），10 000g×30 min離心取上清，磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，體積分?jǐn)?shù)為70%的飽和硫酸銨沉淀3 h（pH=4），10 000g×30 min離心去上清，PBS重懸，10 000g×30 min離心取上清.

蛋白精制過程主要是利用目標(biāo)蛋白與其他雜蛋白的疏水性、親水性、分子質(zhì)量、親和性、分子間作用力等差異性特征進一步去除雜蛋白，這也是雙功能型纖溶酶純化過程中最為關(guān)鍵和復(fù)雜的一個環(huán)節(jié).目前，已報到的雙功能型纖溶酶精制工藝基本都是多重色譜純化技術(shù)，即綜合使用陽離子色譜、陰離子色譜、凝膠色譜、親和色譜、分子篩和高效液相色譜等柱層析工藝進行分離純化.以SFE為例，課題組在進行SFE精制過程中則逐步采用了Sephadex G-25柱層析、DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析、Superdex 75柱層析和Resource Q柱層析進行目標(biāo)蛋白的分離純化，最終獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的高純度SFE，為接下來的蛋白結(jié)晶奠定了基礎(chǔ).同時，為了簡化蛋白精制工藝，課題組還根據(jù)所得的SFE蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB：8HZO，8HZP）開發(fā)了首個SFE的親和純化工藝.將原來的多重色譜精制工藝簡化成Lysine-Sephrose 4B和Arginine-Sephrose 4B的一步親和純化法（申請?zhí)?專利號：202310108470.9），大大簡化了蛋白精制過程，降低制備成本.

最后的產(chǎn)品鑒定主要完成對純化所得蛋白的純度及活性鑒定.純度鑒定主要通過SDS-PAGE，Native-PAGE和高效液相等手段完成.活性鑒定則包括纖溶酶原激酶活性鑒定和纖維蛋白降解活性鑒定兩個層面.由于目前市售的纖維蛋白原普遍含有微量的纖溶酶原污染，因此，常規(guī)的做法是通過加熱纖維平板來降低潛在的纖溶酶原影響，如采用加熱平板來測定目標(biāo)蛋白的纖維蛋白降解活性，再通過比較非加熱平板和加熱平板之間的纖溶圈大小來判斷是否具有纖溶酶原激活活性.但加熱卻會使纖維蛋白變性，導(dǎo)致兩者之間的纖維蛋白不處于同一狀態(tài)，降低比較的準(zhǔn)確性.課題組在進行SFE活性鑒定時則采用了完全無纖溶酶原的纖維蛋白原進行纖維平板制備，從根源上解除了加熱平板的潛在問題.同時，采用目標(biāo)蛋白與纖溶酶原先孵育1 h（37 ℃），采用Native-PAGE分離反應(yīng)物，再用無纖溶酶原的纖維蛋白平板原位埋膠法直接測定SFE的纖溶酶原激酶活性及所激活產(chǎn)生的效應(yīng)片段大小.

3 雙功能型纖溶酶的酶活特性

通過系統(tǒng)比較已知雙功能型纖溶酶的酶學(xué)活性類型、分子質(zhì)量、最適溫度與最適pH值、激活劑與抑制劑、對底物的選擇性等基本生化特征.

雙功能型纖溶酶的酶活特性，如表3所示.

表3中：PMSF為苯甲基磺酰氟；EDTA為乙二胺四乙酸；EGTA為乙二醇四乙酸；CTAB為十六烷基三甲基溴化銨；SBTI為大豆胰蛋白酶抑制劑；APMSF為4-脒苯基-甲磺酰氟鹽酸鹽；PCMB為對氯汞苯甲酸酯；DTT為二硫蘇糖醇；IAA為吲哚-3-乙酸；TPCK為甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮.

由表3可得以下9點結(jié)論：

1） 大部分雙功能型纖溶酶屬于絲氨酸蛋白酶類，少量為金屬蛋白酶類，極少數(shù)為絲氨酸金屬蛋白酶類；

2） 分子質(zhì)量分布較廣泛，從13.6～51.0 ku都有報道，但主要集中在20～35 ku；

3） 最適工作溫度以溫?zé)釣橹鳎瑴囟确秶鸀?0～60 ℃，以30～50 ℃居多；

4） 最適酸堿度以中性及弱堿性（pH值為7.0～8.0）為主，但也有少數(shù)為強酸性或堿性條件，如從Pleurotus ferulae分離得到3種不同的雙功能纖溶酶，最適pH值分別為4.0，5.0，8.0；

5） 能被絲氨酸蛋白酶抑制劑如苯甲基磺酰氟或金屬蛋白酶抑制劑如乙二胺四乙酸所抑制；

6） 對金屬離子的適應(yīng)性差異巨大，以Ca2+， Mg2+促進劑居多.這里值得注意的是從Aspergillus versicolor中分離的ZHL-1，十二烷基硫酸鈉（SDS）能顯著提升其活性，打破了SDS能抑制大部分蛋白活性的通識；

7） 都能將纖溶酶原激活成活性的纖溶酶，但激活機制不盡相同；

8） 都能直接降解纖維蛋白及纖維蛋白原，但對3條鏈的降解順序有所差異.絕大多數(shù)的降解順序為α→β→γ，少數(shù)為β→α→γ，但從Bacillus sp. nov.SK006分離的雙功能纖溶酶只降解β鏈與γ鏈，不能降解α鏈.從Aspergillus versicolor分離的ZHL-1只降解α鏈與γ鏈，不能降解β鏈；

9） 可根據(jù)酶對人工合成的顯色底物的降解速率來初步判斷酶的類型.常用的顯色底物主要有纖溶酶顯色底物（D-Val-Leu-Lys-pNA）、血漿促肽酶、卷曲蛋白酶和胰蛋白酶的顯色底物（N-Benzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA）、纖溶酶底物（H-D-Val-Leu-Lys-pNA）、糜蛋白酶的顯色底物（MeO-Succinyl-Arg-Pro-Tyr-pNA）、組織蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶的顯色底物（N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA）、激肽釋放酶的顯色底物（D-Val-leu-Arg-pNA）、尿激酶的顯色底物（pyro-Glu-Gly-Arg-pNA）、凝血酶的顯色底物（H-D-Phe-Pip-Arg-pNA）、凝血酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的顯色底物（N-Benzoyl-Phe-Val-Arg-pNA）、凝血酶的顯色底物（Tos-Gly-Pro-Arg-pNA）.

與上述基本生化特性類似的是，課題組從星蟲中分離得到的3種SFE也都是屬于絲氨酸蛋白酶，分子質(zhì)量為12.3～29.6 ku，最適pH值為4.0，7.0，8.0，最適溫度為30～40 ℃，活性受PMSF的強烈抑制，能將纖溶酶原激活成一種非纖溶酶的活性分子，能夠在20 min內(nèi)完全降解纖維蛋白及纖維蛋白原的α鏈，但需要2 h才能完全降解β鏈，需要6 h才能完全降解γ鏈.

4 問題與展望

眾所周知，現(xiàn)有激活劑類溶栓藥物必須依賴患者自身的纖溶酶原物質(zhì)才能發(fā)揮溶栓效應(yīng)，但血栓患者體內(nèi)的纖溶酶原物質(zhì)普遍呈低表達(dá)或突變狀態(tài)，嚴(yán)重限制了此類藥物的溶栓效果.纖溶酶類溶栓藥物雖然可以直接溶解纖維蛋白，但卻容易被血液中的多種抑制因子所抑制，而且對血栓栓體的靶向性也不高.雙功能型纖溶酶的纖溶酶原激酶活性和纖維蛋白降解活性賦予其同時具有纖溶酶原激活劑和活性纖溶酶的雙重功效，理論上能夠彌補現(xiàn)有溶栓藥物的不足.在這一導(dǎo)向下，雙功能型纖溶酶的發(fā)現(xiàn)、鑒定、活性研究正成為抗血栓研究的一大熱點.對此，在結(jié)合課題組前期大量的星蟲纖溶酶研究基礎(chǔ)上，對雙功能型纖溶酶的物種來源、分離純化和酶活特性3個關(guān)鍵問題進行系統(tǒng)綜述.

鑒于雙功能型纖溶酶的獨特優(yōu)勢，大量的精力已投入到雙功能型纖溶酶的挖掘工作中.到目前為止，除了病毒和古細(xì)菌外，其余物種如細(xì)菌、真菌、植物和動物都有雙功能型纖溶酶的報道.其中又以細(xì)菌和真菌居多，尤其是桿菌和霉菌.然而，由于絕大部分實驗仍然借助加熱平板與非加熱平板活性差異數(shù)值來衡量是否具有激酶活性和直接纖溶活性，忽略了加熱平板中的纖維蛋白已經(jīng)變性，有可能導(dǎo)致纖維蛋白更容易被纖溶酶降解，從而造成具有激酶活性的假陽性結(jié)果.因此，對所報道的雙功能型纖溶酶應(yīng)持謹(jǐn)慎態(tài)度.在纖溶酶的雙功能鑒定方面，為了準(zhǔn)確鑒定其是否具有雙功能效應(yīng)，課題組經(jīng)過長期摸索提出一種“六重鑒定法”：

1） 在加熱纖維平板與非加熱纖維平板中都顯示活性，但非加熱平板活性大；

2） 在含纖溶酶原的纖維平板與無纖溶酶原的纖維平板中都顯示活性，但含纖溶酶原的纖維平板活性大；

3） 與單純待測樣品相比，待測樣品與纖溶酶原的反應(yīng)物在纖維蛋白-Native-PAGE上顯示新的活性條帶或更亮的活性條帶；

4） 與單純待測樣品相比，待測樣品與纖溶酶原的反應(yīng)物在明膠-Native-PAGE上顯示新的活性條帶或更亮的活性條帶；

5） 與單純待測樣品相比，待測樣品與纖溶酶原的反應(yīng)物在經(jīng)Native-PAGE后膠條貼在新的纖維蛋白平板中顯示新的活性條帶或更亮的活性條帶；

6） 與單純待測樣品及纖溶酶原樣品相比，待測樣品與纖溶酶原的反應(yīng)物在SDS-PAGE上顯示新的條帶.

只有同時滿足以上6個鑒定條件才能證明該物質(zhì)具有雙功能效應(yīng)，同時，可以初步判定出雙功能型纖溶酶對纖溶酶原的大概激活位點，為后續(xù)的纖溶酶原激活機制和纖維蛋白降解機制提供參考.

在今后的研究中，除了不斷挖掘新的雙功能型纖溶酶之外，更應(yīng)該重視其分子機制的研究.只有從機制上掌握了其整個作用過程，才能更好地為將來的升級改造提供參考.由于目前雙功能型纖溶酶的研究仍處于新酶種類的發(fā)現(xiàn)與活性鑒定階段，尚未有其結(jié)構(gòu)解析與機制研究的報道.根據(jù)課題組對雙功能型纖溶酶SFE的蛋白晶體（PDB：8HZO，8HZP）的結(jié)構(gòu)分析及分子模擬，可知SFE與人纖溶酶原激活劑及人纖溶酶的活性口袋非常相似，均由絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸3個氨基酸組成三聯(lián)體催化中心，但在關(guān)鍵的S1/S2口袋區(qū)域則替換了更多的小的氨基酸，這也許就是導(dǎo)致其雙功能、多靶點的一些關(guān)鍵因素.相信隨著更多的蛋白晶體的解析，其分子機制會得到更為深入系統(tǒng)的闡明.

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（責(zé)任編輯：? 錢筠 ?英文審校： 劉源崗）

收稿日期： 2023-06-15

通信作者： 唐明青（1982-），男，副教授，博士，主要從事血栓纖溶系統(tǒng)及基因治療的研究.E-mail：Tmq@hqu.edu.cn.

基金項目： 福建省科技計劃項目（2019J01070）； 福建省泉州市科技計劃項目（2018Z012）； 福建省廈門市科技計劃項目（3502Z20227197）； 福建省中青年教師教育科研項目（JA14020）； 華僑大學(xué)人才引進項目（14BS111）

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