水稻亮綠葉突變體bgl-2的表型特征與遺傳分析

林秋云　謝振宇　胡偉　周玉杰　龍開意　賀治洲

關鍵詞：水稻；葉片亮綠；突變體；bgl-2；表型；遺傳

中圖分類號：S31 文獻標識碼：A

糧食安全是“國之大者”，悠悠萬事，吃飯為大。我國是水稻生產大國，2011—2021 年種植面積穩定在3000 萬hm2 左右，以占世界9%的耕地、6%的淡水資源，養育了世界近1/5 的人口[1]。優良高產品種的推廣應用發揮了極其重要的作用。光合效率是決定作物產量的重要前提，也是育種家們的改良目標，而葉片是水稻進行光能轉化的主要組織[2]。水稻葉色突變是一種發生頻率高、易于被發現的突變現象，但多數葉色突變體對光合作用有影響，在一定程度上間接影響水稻產量，因此在早期常被認為是無意義突變體。隨著生物技術的發展，大量研究表明葉色突變體不僅是開展光合作用、光形態建成、質－核基因互作、葉綠素合成和葉綠體發育等基礎研究的理想材料，同時可作為一種明顯且易于識別的標記性狀，簡化良種繁育和雜交種生產[3-5]。此外，葉色突變體還可以作為觀賞稻，致力于打造鄉村休閑農業觀光旅游點，帶動農民增收，促進鄉村振興[6]。

水稻資源輻射誘變創制是利用60Co-γ 射線照射種子，引起種子內染色體重組、畸變，產生遺傳變異，從而形成水稻新種質、新材料，進而配制水稻新品種的一種高科技技術。60Co-γ 射線輻照誘變的頻率高，可形成自然界沒有的性狀和類型，打破性狀間的緊密連鎖，促進基因重組，有些變異性狀穩定快，可以在較短的時間內獲得罕見的種質材料和基因資源。來自西非地區尼日利亞的農家栽培品種SIPI 具有耐瘠薄、分蘗強、耐高溫等優良特性，但其稻穗較小，株型松散，限制了該品種的育種應用。本課題組在前期研究中利用60Co-γ 射線輻照處理SIPI 干種子，輻射劑量為300 Gy，隨后連續自交多代篩選，最終獲得一個穩定遺傳的水稻亮綠葉突變體bgl-2。本研究通過對突變體bgl-2 進行田間表型和細胞學結構觀察，并進行溫度敏感試驗，同時構建F2 分離遺傳群體進行BGL-2 基因遺傳模式分析，以期為后續BGL-2 基因的克隆和功能分析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

突變體bgl-2 是利用60Co-γ 射線300 Gy 輻照來自尼日利亞的秈稻品種SIPI 干種子，在M2 代，田間鑒定出亮綠葉突變表型植株，隨后對突變植株連續自交多代獲得穩定遺傳的一個水稻亮綠葉突變體材料。2020 年春季種植野生型SIPI 和突變體bgl-2，地點位于海南省儋州市中國熱帶農業科學院水稻綜合試驗基地。種植規格為20 cm×20 cm，單株插秧，田間水肥、病蟲管理參照當地常規大田管理方法。

1.2 方法

1.2.1 F₂分離群體構建 2020 年春季種植野生型SIPI 和突變體bgl-2，抽穗期以突變體bgl-2 為母本，人工去雄，授以野生型SIPI 花粉，授粉25 d后收獲雜交種F1。2020 年夏季分別種植野生型SIPI、突變體bgl-2 和F1，觀察F1 植株表型，排除雜株后自交收獲F2 種子。2021 年春季分別種植野生型SIPI、突變體bgl-2 和F2，獲得分離遺傳群體，田間調查F2 群體單株表型，計算分離比例。

1.2.2 光合色素含量測定 分別取野生型SIPI 和突變體bgl-2 分蘗期劍葉葉片，測定光合色素含量，測定方法參照LI 等[7]的方法。光合色素提取完畢，利用DU800 紫外可見分光光度計，在黑暗條件下，測定上清液的吸光值（波長為470、649、665 nm）。并根據以下公式計算光合色素含量：

葉綠素a 含量：Chla（mg/g）=13.95D₆₆₅–6.88D₆₄₉

葉綠素b 含量：Chlb（mg/g）=24.96D₆₄₉–7.32D₆₆₅

類胡蘿卜素含量：Car（mg/g）=（1000D₄₇₀–2.05Chla–114Chlb）/245

細胞色素含量（mg/g）=（葉綠素濃度×提取液體積×稀釋倍數）/樣品鮮重

1.2.3 葉綠體超微結構的透射電鏡觀察 分別取分蘗期野生型SIPI 和突變體bgl-2 劍葉，橫切成數段，每段約2 mm，置于3%的戊二醛固定液，抽氣，室溫固定12 h，4 ℃保存。將樣品送至中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所電鏡實驗中心進行樣品制備和透射電鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 水稻亮綠葉突變體bgl-2 的表型鑒定

與野生型SIPI 比較，突變體bgl-2 在田間分蘗期表現為明顯的葉片亮綠色（圖1），此外還伴隨著株高變矮，突變體bgl-2 株高為（91.10±3.13）cm，而野生型SIPI 的株高為（107.30±3.93）cm，二者之間存在顯著差異（表1）。調查葉片形態發現，突變體bgl-2 的劍葉和倒二葉的葉尖處均表現出彎折，分別測定野生型和突變體bgl-2 的劍葉長度，結果發現野生型SIPI 的劍葉長度為（25.70±0.87）cm，而突變體bgl-2 的劍葉長度為（20.90±0.53）cm，顯著短于野生型。拷種發現，突變體bgl-2的千粒重、粒長和粒寬均顯著小于野生型SIPI，但長寬比在二者之間無顯著差異（表1）。這些結果表明BGL-2 基因可能存在一因多效的效應。

2.2 突變體bgl-2 的光合色素含量測定

大多數造成葉色突變的基因直接或間接影響葉綠素的代謝過程，從而致使葉片葉綠素含量發生變化。為了了解突變體bgl-2 的葉綠素含量是否發生變化，在田間分蘗期分別取野生型SIPI 和突變體bgl-2 劍葉葉片，測定光合色素含量，結果如圖2所示，二者之間無顯著差異，說明突變體bgl-2 的葉色亮綠表型不是因為光合色素含量變化導致的，可能是BGL-2 基因突變引起其他機制變化導致的。

2.3 突變體bgl-2 的葉綠體超微結構觀察

為了了解BGL-2 基因的突變是否影響到葉綠體的發育，本研究通過透射電鏡觀察分蘗期野生型SIPI 和突變體bgl-2 劍葉葉綠體的超微結構。如圖3A 與圖3D 所示，突變體bgl-2 的葉綠體數目與野生型SIPI 相比無顯著差異。然而突變體bgl-2 的細胞結構出現異常。野生型SIPI 細胞壁厚度為（222.20±6.26）mm，而突變體bgl-2 的胞壁厚度增厚至（280.20±14.20）mm，但其細胞外膜厚度顯著減小至（31.30±5.29）mm，且內膜幾乎退化，而野生型SIPI 的細胞外膜厚度為（102.80±5.94）mm（表2）。此外突變體bgl-2 的類囊體片層結構顯著減少（圖3B、圖3C、圖3E 和圖3F），說明突變體bgl-2 的細胞結構不正常，BGL-2 基因的突變影響其細胞結構和葉綠體的正常發育。

2.4 突變體bgl-2 的遺傳模式分析

突變體bgl-2 與野生型SIPI 雜交獲得的F1 代植株葉片表現正常綠色，劍葉和倒二葉形態正常，而自交后的F₂代群體分離出葉色差異明顯的正常綠葉苗和亮綠葉苗。卡方測驗結果表明，F₂ 代群體中正常苗與亮綠葉苗的分離比例符合3∶1（表3），說明該突變性狀受1 對隱性單基因控制。

3 討論

水稻葉色突變體是一種出現頻率較高的突變體類型，常見的有黃綠、淺綠、條紋、黃化、白化、白化轉綠、黃化轉綠等類型[8-12]。然而水稻葉片亮綠突變體比較少見，已報道的只有2 個[4]。水稻葉色表型多由一對隱性單基因控制，遺傳行為簡單。目前已報道的與葉綠素含量相關的基因有150 多個，其中已被克隆的葉色基因至少有30 個，這些基因主要分為葉綠素合成和降解途徑的基因、葉綠體發育途徑的基因以及其他途徑相關基因等[13-16].

YOO 等[17]最先報道的突變體bgl 由于近軸和遠軸葉表面均無乳頭狀結構的小角質乳突（smallpapillae， SP）導致綠光更多的直接反射而減少擴散，所以葉片呈現出亮綠色。但突變體bgl 的葉綠素含量和葉綠體結構與野生型相比，并無顯著差異。圖位克隆結果表明，bgl 位點是一個編碼由11 個成員組成的水稻OsRopGEFs 家族之一OsRopGEF10。與SP 在葉表皮上啟動的時間一致，OsRopGEF10 在葉鞘出苗前的新發育葉片中表達最強。隨后WANG 等[18]報道另外一個新的水稻亮綠突變體bgl11，不同于突變體bgl1，其葉綠素含量顯著低于野生型，且在成熟期，其單株有效穗數和結實率也顯著低于野生型，但其他主要農藝性狀與野生型相比無差異。基因圖位克隆和測序結果表明，BGL11 是一個位于水稻第11 號染色體長臂上的基因LOC_Os11g38040。突變體bgl11 在該基因的編碼區存在9 個bp 片段缺失。將LOC_Os11g38040 基因轉到突變體bgl11 中，其葉片顏色恢復正常綠色。本研究的bgl-2 是一個輻射誘變獲得的水稻亮綠葉突變體，但表型不同于bgl和bgl11，其不僅在葉片顏色上呈亮綠色，葉片形態也發生了變化，劍葉和倒二葉葉尖處均表現出彎折。此外在細胞結構上也發生了變化，細胞壁增厚，細胞膜變薄甚至退化，說明BGL-2 位點有可能不同于OsRopGEF10 和BGL11，是一個新的葉色亮綠基因。遺傳模式分析表明突變體bgl-2由一對隱性單基因控制，下一步試驗將進一步對BGL-2 進行基因定位及功能分析。