基于網絡藥理學與分子對接探討二至丸“異病同治”治療圍絕經期綜合征及異常子宮出血的作用機制

伍娟娟 韋美秀 劉銳

二至丸原名“女貞丸”,由等份女貞子、墨旱蓮組成,首載于《扶壽精方》,明代王三才在《醫便》中將其更名為二至丸。女貞子甘、苦、涼,功能滋補肝腎,涼血止血;墨旱蓮甘、酸、寒,有補益肝腎、明目烏發之效。兩藥同歸肝、腎經,均為臨床常用補陰藥,兩藥組方可加強補益肝腎,滋水涵木之功。《醫方集解》言其能“補腰膝,壯筋骨,強陰腎,烏髭發”,是補肝益腎,滋陰止血的經典方劑。

圍絕經期綜合征(menopausal syndrome,MPS)是指婦女絕經前后卵巢功能衰退,雌激素分泌減少或水平波動而導致的一系列自主神經功能紊亂或伴有神經心理癥狀的臨床綜合征[1-2],臨床常見圍繞月經紊亂或出現烘熱汗出、煩躁易怒、心悸失眠、精神倦怠、腰酸背痛等與絕經相關的不適癥候[3],研究表明約80 %的女性會出現不同程度的更年期癥狀[4]。現代醫學性激素替代療法通過調整體內雌激素水平能有效改善患者不適癥狀,但長期使用會增加乳腺癌、靜脈血栓、子宮內膜癌等風險[5]。異常子宮出血(abnormal uterine bleeding,AUB)是婦科常見病,臨床上常表現為非行經時陰道不規則出血,量或多或少,可引起不同程度的貧血、盆腔炎性疾病、影響女性生育等多種并發癥,對女性的生活質量及身心健康造成嚴重影響。該病多發于圍絕經期,與下丘腦—垂體—卵巢軸功能障礙導致無排卵密切相關[6]。圍絕經期女性卵巢功能衰退,卵巢內剩余卵泡對垂體促性腺激素反應性降低,雌激素分泌減少,無排卵前黃體生成素(luteinizing hormone,LH)峰的形成,引起無排卵,此時子宮內膜受到單一雌激素的影響而無孕激素對抗常導致異常子宮出血的發生[7]。

MPS屬中醫“絕經前后諸證”范疇,中醫認為腎為先天之本,婦女絕經前后腎氣漸衰,天癸近竭,腎精虧虛、陰陽失調、沖任氣血不足為本病基本病機[8],臨床上使用二至丸加味治療肝腎虧虛型MPS能有效改善患者潮熱汗出、失眠等臨床癥狀,降低卵泡雌激素(follicle-stimulating hormone,FSH)水平,同時與現代醫學雌激素補充治療相比無增加患者子宮內膜癌等風險的優勢[9-10]。AUB相當于中醫所言“崩漏”,崩漏為經亂之甚,中醫認為沖任二脈損傷不能制約經血為其基本病機,究其原因,或腎氣不固,不能調經攝血;或熱擾沖任,迫血妄行;或肝腎功能失調,血海蓄溢失常等。現代醫學在治療上常以口服性激素藥物或診斷性刮宮為主,性激素治療因胃腸道反應及肝功能損害等不良反應一般不宜長期使用[11],且停藥易復發,而手術方法患者接受度不高,使其治療存在一定局限性。臨床上將二至丸聯合西藥治療肝腎虧虛型AUB療效率高,且在月經周期的恢復上有顯著優勢[12]。

“異病同治”是指具有相同病機的不同疾病能采用同一方法治療的法則,“證同則治同,證異則治異”,中醫治病不拘泥于病的異同,而著眼于病機的異同[13]。MPS和AUB雖屬于不同疾病,但其發病均與卵巢功能衰退、內分泌失調密切相關,從中醫辨證論治角度分析,肝腎虧虛為其二者共有病機,二至丸在治療MPS和AUB方面發揮了獨特優勢,符合中醫“異病同治”的理念。網絡藥理學利用生物信息網絡,系統反應藥物對疾病的干預機制,從整體探索中藥和機體的作用關系,切合中醫整體論的思想[14]。本研究旨在運用網絡藥理學方法,從“異病同治”角度探討二至丸治療MPS和AUB的作用機制,為臨床研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 二至丸藥物活性成分及潛在作用靶點的獲取

以“女貞子”“墨旱蓮”為關鍵詞在TCMSP數據庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php/)中進行檢索,以口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%,類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18作為篩選條件,初步篩選出二至丸藥物活性成分。進一步檢索獲取藥物活性成分潛在作用靶點,利用Uniprot數據庫(http://www.uniprot.org/)將靶點名稱轉化為標準基因名。

1.2 MPS及AUB疾病靶點的獲取

分別以“perimenopausal syndrome、climacteric syndrome、Menopausal syndrome、Menopausal symptoms”及“metrorrhagia 、AUB”為關鍵詞,通過GeneCards(https://www,genecards.org/)數據庫進行檢索,獲得MPS及AUB的相關疾病靶點,分別將獲取疾病靶點整合去重后篩選,利用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html/)對疾病靶點取交集,得到MPS及AUB的共有靶點。

1.3 藥物—活性成分—靶點網絡的構建

利用Venny 2.1.0對二至丸潛在作用靶點與MPS及AUB的共有靶點取交集,并繪制韋恩圖,得到二至丸異病同治治療MPS及AUB的潛在作用靶點,根據潛在作用靶點篩選出對應的二至丸藥物活性成分,將藥物、活性成分及作用靶點等信息導入Cytoscape 3.9.0軟件,構建二至丸異病同治治療MPS及AUB的藥物-活性成分-靶點網絡圖。

1.4 蛋白相互作用網絡(protein-protein interaction,PPI)的構建及核心靶點的篩選

將二至丸異病同治治療MPS及AUB的潛在作用靶點導入STRING(https://string-db.org/)在線平臺,物種選擇“Homo sapiens”(人類),“medium confidence”(中等置信度)為0.4作為篩選條件,其余參數保持默認值,構建蛋白互作網絡(protein-protein interaction,PPI),將結果以TSV文件格式導入Cytoscape 3.9.0平臺進行拓撲分析,根據度值(Degree)篩選核心靶點。

1.5 GO和KEGG富集分析

采用Metascape平臺(https://metascape.org/)對二至丸異病同治治療MPS及AUB的潛在作用靶點進行GO和KEGG富集分析,將結果導入Excel表格,數據按Pvalue值以升序進行排序,以P<0.05為篩選標準,利用微生信在線平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)對分別對GO富集的前10個及KEGG富集的前20個條目進行可視化處理。

1.6 分子對接

從PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點的3D結構,從TCMSP下載藥物活性成分的mol2格式,Pymol軟件去水、加氫、去配體殘基,使用Autodock 4.2.6進行對接,獲取靶點與活性成分的最低結合能,并使用 Pymol 2.5.0進行可視化處理。

2 結果

2.1 二至丸藥物活性成分及潛在作用靶點的獲取

通過TCMSP共檢索到二至丸共有23種藥物活性成分,其中女貞子活性成分13個、墨旱蓮活性成分10個,刪除無對應靶點活性成分后得到女貞子、墨旱蓮有效活性成分各8個,其中共有活性成分2個,見表1。進一步利用 TCMSP對藥物活性成分進行靶標預測,分別獲得女貞子、墨旱蓮對應活性成分靶點321及264個,合并后刪除重復靶點得到195個。

表1 二至丸藥物活性成分

2.2 MPS及AUB疾病靶點的獲取

通過GeneCards數據庫分別獲得MPS及AUB相關靶點3490、485個,以相關性分數(Relevance score)大于等于中位數為條件進行篩選,最終選取得到MPS及AUB相關靶點1745及182個,利用Venny 2.1.0對疾病靶點取交集,并進行可視化,得到疾病共有靶點110個,見圖1。

圖1 MPS及AUB疾病靶點交集韋恩圖

2.3 藥物—活性成分—靶點網絡構建

將二至丸潛在作用靶點與MPS及AUB共有靶點取交集,得到28個交集靶點,即為二至丸異病同治治療MPS及AUB的潛在作用靶點,見圖2。根據潛在作用靶點反向篩選出對應的二至丸藥物活性成分,其中女貞子9個、墨旱蓮6個,其中共有活性成分2個。利用Cytoscape 3.9.0構建藥物—活性成分—靶點網絡圖,見圖3。該網絡由40個節點、72條邊構成,其中包含28個交集靶點、2個藥物及10個藥物活性成分。利用Network Analyzer插件進行網絡拓撲分析,將藥物活性成分按照Degree值進行排序,前5位的活性成分分別為槲皮素(quercetin,degree=27)、木犀草素(luteolin,degree=12)、山奈酚(kaempferol,degree=9)、金合歡素(acacetin,degree=5)及β-谷甾醇(beta-sitosterol,degree=4),以上活性成分可能為二至丸治療MPS及AUB的關鍵活性成分。

圖2 疾病共有靶點與二至丸靶點交集韋恩圖

注綠色箭頭及圓形分別代表女貞子及其活性成分,藍色箭頭及圓形分別代表墨旱蓮及其活性成分,紅色圓形為藥物共有成分,粉色菱形為藥物與疾病交集靶點。圖3 二至丸異病同治治療MPS及AUB的藥物-活性成分-靶點網絡

2.4 PPI的構建及核心靶點的篩選

將28個藥物與疾病的交集靶點導入STRING數據庫構建PPI網絡,該網絡包括28個節點、193條邊,其中孤立節點1個,以medium confidence>0.4為篩選標準,將篩選結果以TSV文件格式導入Cytoscape 3.9.0軟件,利用Network Analyzer 插件進行拓撲分析,計算出該網絡平均 Degree 值為3.6,平均接近中心性為0.431511,平均介數中心性為0.036032。根據結果進行可視化,網絡中點的大小及顏色深淺與度值的大小呈正相關,度值越大顏色越深、節點越大(見圖4)。根據Degree值大小篩選出排名前10的靶點作為二至丸異病同治治療MPS及AUB的核心靶點,包括EGFR、TP53、ESR1、VEGFA、MMP9、IL-1β、HIF-1α等,見表2。

圖4 二至丸異病同治治療MPS及AUB潛在作用靶點PPI網絡

表2 二至丸異病同治治療MPS及AUB潛在作用靶點PPI網絡前10位靶點拓撲分析

2.5 GO和KEGG富集分析

對28個交集靶點進行GO富集分析,共得到651條GO富集條目(P<0.05),其中生物過程(biological processes,BP)575條,主要涉及生殖結構發育、生殖系統發育、細胞遷移的上調、細胞對脂質的反應、腺體發育、細胞對有機環狀化合物的應答等生物過程;細胞組分(cell components,CC)18條,主要包括轉錄調控復合物、細胞外基質、囊泡腔、轉錄抑制因子復合物等;分子功能(molecular function,MF)60條,涉及轉錄調控劑結合、轉錄共激活劑結合、轉錄因子結合、核受體活性等,分別對BP、CC及MF前10個條目進行可視化,見圖5。KEGG富集分析得到96條相關通路(P<0.05),對前20條通路進行可視化展示,見圖6,可見主要涉及AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、HIF-1信號通路等。

圖5 二至丸異病同治治療MPS及AUB潛在作用靶點GO富集分析

圖6 二至丸異病同治治療MPS及AUB潛在作用靶點KEGG富集分析

2.6 分子對接

選取關鍵活性成分槲皮素、木犀草素及山奈酚為對接配體,根據文獻從核心靶點中篩選出EGFR、ESR1、HIF-1α、IL-1β、VEGFA為對接受體,進行對接并獲取最低結合能,一般認為配體與受體結合能越低,其對接能力越強,通常以結合能<-5.0 KJ/mol(約為-1.2 Kcal/mol)作為結合性良好的篩選標準[15]。結果顯示,二至丸關鍵活性成分與EGFR、ESR1、HIF-1α、IL-1β、VEGFA的對接結合能均小于-5.0 KJ/mol,其中槲皮素與HIF-1α(PDB ID:4h6j)、木犀草素與ESR1(PDB ID:1 err)、山奈酚與VEGFA(PDB ID:1 mjv)親和力最高,其結合能分別為-4.1 Kcal/mol、-4.87 Kcal/mol、-4.47 Kcal/mol,見表3。分別選取各靶點與其對接結合能最低的活性成分繪制對接模式圖,見圖7。

注A:木犀草素-EGFR;B:木犀草素-ESR1;C:槲皮素- HIF-1α;D:山奈酚- IL-1β;E:木犀草素- VEGFA。圖7 藥物有效成分—靶點分子對接模式圖

表3 二至丸關鍵活性成分與關鍵靶點分子對接結合能(Kcal/mol)

3 討論

MPS及AUB為兩種不同的疾病,但其發病均與卵巢功能衰退,雌激素分泌減少密切相關,中醫病機以肝腎虧虛為多見。二至丸具有養陰清熱止血,補益肝腎之功,臨床運用該方治療肝腎虧虛型MPS及AUB療效確切[16-18]。現代研究表明,二至丸具有抗骨質疏松、抗衰老、調節免疫、護肝、雌激素樣作用等多種作用藥理學作用[19]。目前臨床上常用于MPS、AUB等婦科病,同時也應用于腎病、皮膚病及內分泌疾病等多個領域,具有“一方多用、異病同治”的特點。本研究基于“異病同治”理論,運用網絡藥理學及分子對接方法,探討二至丸異病同治治療MPS及AUB的可能作用機制。

本研究對二至丸有效成分及作用靶點進行挖掘篩選,得到二至丸潛在活性成分14個,潛在作用靶點195個,與MPS及AUB的共有靶點為28個。藥物—活性成分—靶點網絡顯示,槲皮素、木犀草素、山奈酚等為二至丸異病同治治療MPS及AUB的關鍵活性成分。研究表明槲皮素具有抗氧化、抗炎及抗細胞凋亡等作用[20-21]。Jiao W等[22]人研究顯示,槲皮素可通過上調絕經期大鼠卵巢及顆粒細胞中過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase,GSS)等氧化應激相關基因及蛋白的表達水平,以增加卵巢抗氧化能力。還可通過減弱脂質過氧化水平,保護顆粒細胞免受鎘誘導的氧化應激損傷[23]。顆粒細胞凋亡是卵泡閉鎖的重要原因,槲皮素通過抑制PERK/CHOP信號通路減輕內質網應激導致的顆粒細胞凋亡[24],發揮治療作用。相關研究發現,IL-6等促炎因子在生殖年齡較大的小鼠卵巢中表達水平升高[25],這些因子可能促進卵巢慢性炎癥及組織纖維化,破壞卵巢功能[26],提示炎癥在卵巢衰老過程中發揮重要作用,槲皮素通過抑制NF-κB炎癥信號級聯反應,降低炎癥因子水平,發揮抗炎效果[27]。槲皮素、木犀草素、山柰酚均屬天然類黃酮化合物,類黃酮化合物其結構與雌激素具有極高的相似性[28],因此具有一定的雌激素樣作用,補充槲皮素能改善卵母細胞質量及卵泡發育[29],低濃度的槲皮素能增加雌二醇的生物合成[30],另外木樨草素能促進卵巢顆粒細胞雌二醇的分泌[31],山奈酚可通過PI3K/Akt信號通路促進始基卵泡的活化及細胞增值[32]。同時山萘酚作為抗氧化劑,通過增加超氧化物歧化物(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽還原酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性促進體外培養的次級卵母細胞發育[33]。

對二至丸異病同治治療MPS及AUB的共有靶點PPI網絡進行篩選,得到EGFR、TP53、ESR1、VEGFA、MMP9、IL-1β、HIF-1α、MMP2、CCND1、MYC共10個核心靶點。其中ESR1是雌激素受體ERα亞型的編碼基因,ERα主要表達于卵泡膜細胞上,調節雌激素的促增生作用,ESR1水平上調可影響其編碼蛋白ERα的表達,進而影響血清雌二醇的水平的變化,從而對卵泡的發育、成熟及排出產生影響。VEGFA是血管內皮生長因子家族的一員,其血管形成及血管重塑作用能為卵泡的發育提供充足營養及氧氣支持,并促進類固醇激素的釋放。實驗研究發現卵巢注射VEGF能促進卵巢卵泡發育,使排卵前卵泡數量增加[34],并且具有抑制卵巢顆粒細胞凋亡的作用[35]。研究認為生理情況下,IL-1β在FSH及LH的介導下通過誘導卵泡成熟、調節卵巢類固醇生成等方面,參與卵泡生長發育過程,IL-1β具有較強的抗促性腺激素作用,可通過抑制顆粒細胞孕酮分泌及雌激素、雄激素、LH受體的形成發揮阻止卵泡閉鎖的作用[36]。馬小紅等[37]研究報道,卵巢早衰患者血清IL-1β水平低于正常婦女,IL-1β可能是引起自身免疫性卵巢早衰的重要因素。HIF-1α是細胞在缺氧環境中產生的調節因子,在卵巢內,HIF-1α可通過誘導顆粒細胞自噬、凋亡等細胞死亡途徑,導致卵泡閉鎖,引發POI[38],通過調節HIF-1α功能,阻斷或減少其促凋亡及自噬作用可發揮卵巢保護功能。VEGF為HIF-1α下游靶基因,研究證實[39],在缺氧條件下HIF-1α調節VEGF基因的轉錄激活,促進血管生成。由此推斷二至丸主要通過調節雌激素水平、促進卵泡發育、抑制顆粒細胞凋亡、阻止卵泡閉鎖等途徑改善卵巢功能,從而對圍絕經期綜合征及異常子宮出血發揮治療作用。

GO功能顯示,二至丸異病同治治療MPS及AUB主要涉及生殖結構發育、生殖系統發育、細胞遷移的上調、細胞對脂質的反應、腺體發育等生物過程。KEGG富集分析結果提示,AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、HIF-1信號通路等是二至丸治療治療MPS及AUB的重要通路。AGEs 是非酶糖基化反應的終末產物,其在卵巢中積累可通過促蛋白損傷、氧化應激及炎癥導致卵母細胞損傷[40]。AGEs與RAGE形成結合AGE-RAGE 信號通路,介導NADPH氧化酶(oxidase,Nox)和NF-κB激活,促進細胞中OS和炎癥的惡性循環,導致卵巢衰老[41]。PI3K/Akt信號通路在調控卵巢顆粒細胞的增殖與凋亡中起重要作用,實驗研究顯示補腎活血中藥可上調大鼠卵巢顆粒細胞中PI3K/Akt信號通路相關分子PI3K、p-Akt及上游細胞因子IGF-1、IRS-1的表達,加快顆粒細胞有絲分裂信號傳遞,促進顆粒細胞增值,從而促進卵泡生長,改善卵巢功能[42]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是PI3K/Akt信號通路下游重要蛋白,mTOR參與卵母細胞減數分裂成熟、卵巢顆粒細胞增殖、子宮內膜基質細胞的凋亡等過程[43]。MAPK信號通路包括JNK、p38和ERK三個途徑,參與卵母細胞成熟分裂等過程,促進卵泡成熟。

綜上所述,二至丸可能通過槲皮素、木犀草素、山奈酚等有效成分,作用于EGFR、ESR1、VEGFA、IL-1β、HIF-1α等靶點,介導AGE-RAGE、PI3K-Akt、MAPK、HIF-1等信號通路發揮抗氧化、抗炎、抑制顆粒細胞凋亡、調節激素水平、促進卵泡發育等作用,改善卵巢功能,發揮“異病同治”治療肝腎陰虛型MPS及AUB的作用,本研究通過網絡藥理學方法對二至丸的治療作用進行初步驗證,并經過分子對接進一步證實,以期為臨床應用提供理論支持。