桑芪益氣養陰方對胰島素抵抗大鼠肝臟ACC1/FASN/SCD1信號通路及GLUT2的影響

李麗 劉佳琪 馮穎童 扈覲璽 姜斯佳 高晶 賈嵐 王景霞

胰島素抵抗是2型糖尿病的重要發病機制,并貫穿疾病全程。肝臟是胰島素作用的重要靶器官,其對胰島素的低敏感性是推動2型糖尿病發展的關鍵環節[1]。正常生理狀態下,胰島素能調節肝臟中糖原、脂類、蛋白質等生物大分子的合成,抑制糖異生,維持血糖穩態[2];胰島素抵抗狀態下肝臟糖異生抑制受損,而脂肪合成仍保持較高水平,表現為肝臟脂肪酸和甘油三酯水平升高[3]。肝臟內脂質積累造成肝臟氧化應激和功能受損,進一步加重胰島素抵抗,因此,緩解肝臟胰島素抵抗為防治2型糖尿病的重點。

中醫學以整體觀、辨證論治理念為指導,在糖尿病等慢性病防治方面獨具優勢。就中醫而言,2型糖尿病當以消渴論治,其病機演變常遵循“陰虛-氣陰兩虛-陰陽兩虛”這一規律,而氣陰兩虛是貫穿全病程的根本病機,也是病理轉機的關鍵,故益氣養陰法當為消渴病治療的基本大法[4]。桑芪益氣養陰方為結合中醫辨證理論及臨床經驗,由黃芪、桑葉、玉竹、葛根、蜂膠粉組合而成,用于氣陰兩虛證消渴患者。前期課題組實驗研究表明[5],該方除改善氣陰兩虛型糖尿病大鼠的證候表征外,還可使模型大鼠的空腹血糖和胰島素抵抗指數顯著降低,使空腹胰島素、胰島素敏感指數、胰島β細胞功能指數顯著升高,在改善高血糖大鼠糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗方面療效顯著。

本研究進一步探究桑芪益氣養陰方對胰島素抵抗大鼠的肝臟保護作用,并從乙酰輔酶A羧化酶1(Acetyl-coa carboxylase 1,ACC1)/脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)/硬脂酰-輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)信號通路及葡萄糖轉運蛋白2(glucose transporter2,GLUT2)表達等角度,探究其可能的作用機制,為臨床應用提供科學的實驗支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠48只,體質量(220±20)g。購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2016-0006,本研究經北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會批準(批準號:BUCM-4-2021052405-2038)。大鼠于北京中醫藥大學動物房常規飼養,飼養條件:室溫22～24℃、相對濕度60%～70%、光照節律12L:12D。由北京斯貝福生物技術有限公司提供特殊高脂飼料,配比為豬油10%、蔗糖15%、蛋黃粉15%、酪蛋白5%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、碳酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、鼠維持飼料52.6%。

1.2 實驗藥物

桑芪益氣養陰方由黃芪、桑葉、玉竹、葛根、蜂膠粉按照4∶2.5∶3∶4∶0.3配比而成,購自安徽亳州市京皖中藥飲片廠。制備方法:全方飲片分別用10倍、8倍的加水量煎煮2次,每次2小時,合并2次的濾液,加熱濃縮,真空干燥后打粉,使用前用蒸餾水配制成相應濃度的藥液。十味消渴膠囊(天津中新藥業集團股份有限公司,國藥準字號:Z19990033)。

1.3 實驗試劑

L-甲狀腺素鈉(美國BioRuler公司,批號:r5703);鏈脲佐菌素(美國Sigma公司,批號:102364684);Trizol(美國Ambion公司,批號:15596-026),HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR ,HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR,SYBR Green Master Mix購于南京諾唯贊公司,批號分別為:R223-01、R223-01、Q111-02;Taq Plus DNA Polymerase,DL2000 DNA Marker,dNTP購于北京天根生化科技有限公司,批號分別為:ET105-01、MD114-02、CD117。蛋白marker(10-250KD)(北京海利克思科技有限公司,批號:P12103-2);蛋白marker(20-120KD)(南京金斯瑞生物科技有限公司,批號:M00521);PVDF膜(0.45 μm)(美國Millipore公司,批號:IPVH00010);兔多抗GAPDH(37KD)(杭州賢至生物有限公司,批號:AB-P-R001);兔多抗ACC1(250KD)、兔多抗FASN(272KD)購于武漢三鷹生物技術有限公司,批號分別為:21923-1-AP、10624-2-AP;兔單抗SCD1(42KD)(英國Abcam公司,批號:ab236868);兔多抗GLUT2(57KD)(美國Affinity公司,批號:DF7510)。

1.4 實驗儀器

臺式高速冷凍離心機(德國Centrifuge公司,TY2017005846),水浴鍋(姜堰市天力醫療器械廠有限公司,TL-420D),全自動研磨儀(武漢塞維爾生物科技有限公司,KH-III),酶標檢測儀(美國Biotek公司,Epoch2C),全自動生化分析儀(深圳雷杜生命科技有限公司,Chemray 240),冰凍切片機(美國Thermo公司,Cryotome E),切片刀(上海徠卡儀器有限公司,Leica819),成像系統(日本尼康株式會社,Nikon DS-U3),電泳儀(DYY-7C)、垂直電泳槽(DYCZ-24DN)、電轉儀(DYCZ-40)購于北京六一儀器廠。

1.5 實驗方法

1.5.1 動物分組及給藥 雄性SD大鼠48只,適應性喂養5天后,禁食不禁水12小時,測定給葡萄糖前(即0小時)大鼠血糖值、給予2.5 g/kg 葡萄糖后大鼠0.5小時和2小時血糖值為基礎值,以0、0.5小時基礎血糖水平將48只大鼠平均分為6個組,即空白組、模型組、陽性藥組(十味消渴膠囊)、桑芪益氣養陰方低、中、高劑量組,每組8只。連續30天進行大鼠灌胃給藥,給藥體積為1 mL/100 g,陽性藥組給藥劑量為十味消渴膠囊1.32 g/kg、桑芪益氣養陰方低、中、高劑量組灌胃藥物劑量分別為1.25、2.5、7.5 g/kg,空白組、模型組灌胃同等體積生理鹽水。

1.5.2 造模方法 建立由高脂飼料喂養、甲狀腺素(tetraiodothyronine,T4)皮下注射、聯合鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)注射造成胰島素抵抗糖脂代謝紊亂大鼠模型[6]。適應性喂養5天后開始造模,造模周期維持30天,空白組給予維持料飼養,其余各組均給予高熱能飼料;除空白組外,其余各組在實驗第21～27天下午14﹕00進行上頸部皮下注射T4混懸液(0.2 mg/kg);在實驗第28天除空白組外,各組禁食24小時(不禁水),在實驗第29天以1 mL/100 g體質量的劑量一次性腹腔注射2%STZ溶液(30 mg/kg),注射后繼續給予高熱能飼料飼養5天,實驗結束后取材。

1.5.3 血液及肝臟樣本制備 在實驗第35天,各組大鼠禁食不禁水16小時,第36天早晨,采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.5 mL/100 g)麻醉大鼠,腹主動脈取血,室溫靜置2小時后4℃ 3 500 r/min,10分鐘離心,取上層血清,-80℃保存。取肝大葉分裝凍存管轉移至液氮凍存,-80℃冰箱存放。

1.6 指標檢測

1.6.1 血清生化分析及肝臟中游離脂肪酸(free fat acid,FFA)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、肝糖原、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的測定 采用比色法在全自動生化儀上測各組大鼠血清中谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)的濃度變化;采用比色法測各組大鼠肝臟中肝糖原、FFA、MDA、SOD、GSH-Px含量。

1.6.2 RT-qPCR檢測大鼠肝臟組織ACC1、FASN、SCD1、GLUT2的mRNA表達 從-80 ℃超低溫冰箱取大鼠肝臟組織,每組隨機選取3個大鼠肝臟樣本,Trizol法提取總RNA,將干燥后的RNA溶解于20 μL DEPC水中,取2 μL定量測試OD260、OD280,余量留待逆轉錄。以總RNA為模板合成cDNA,進行聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)反應。擴增條件:95°C 10分鐘;95°C 15秒,60°C 60秒,循環40次;95°C 15秒,60°C 1分鐘,95°C 15秒。在PCR擴增結束后,以2-ΔΔCt表示mRNA相對表達量。引物序列見表1。

1.6.3 Western Blot檢測大鼠肝臟組織ACC1、FASN、SCD1、GLUT2蛋白表達 每組隨機選取3個大鼠肝臟樣本,按試劑盒法提取細胞總蛋白,蛋白定量法(Bicinchoninic acid,BCA)測定蛋白濃度。取蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳,轉膜,封閉。用ACC1(1∶1 000、FASN(1∶1 000)、SCD1(1∶1 000)、GLUT2(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗,4 ℃孵育過夜,PBST洗膜5次,二抗(1∶10 000),室溫孵育2小時,PBST洗膜5次,顯色曝光,image-pro plus分析膠片條帶灰度值。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 桑芪益氣養陰方對胰島素抵抗大鼠血清ALT、AST的影響

與空白組相比,模型組大鼠ALT顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,陽性藥組大鼠ALT、AST顯著升高(P<0.01),桑芪益氣養陰方各劑量組ALT均顯著降低(P<0.01),桑芪益氣養陰方中、高劑量組AST顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 桑芪益氣養陰方對胰島素抵抗大鼠ALT、AST的影響

2.2 桑芪益氣養陰方對胰島素抵抗大鼠肝臟肝糖原和FFA的影響

與空白組相比,模型組大鼠肝臟肝糖原顯著降低(P<0.01),FFA顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,陽性藥組和桑芪益氣養陰方各劑量組大鼠肝臟肝糖原均顯著升高(P<0.05,P<0.01),桑芪益氣養陰方中、高劑量組大鼠肝臟FFA顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表3 桑芪益氣養陰方對胰島素抵抗大鼠肝臟肝糖原和FFA的影響

2.3 桑芪益氣養陰方對胰島素抵抗大鼠肝臟MDA、SOD、GSH-Px的影響

與空白組相比,模型組大鼠肝臟SOD、GSH-PX顯著降低,MDA顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,陽性藥組大鼠肝臟MDA顯著降低,SOD、GSH-PX顯著升高(P<0.01)。桑芪益氣養陰方各劑量組大鼠肝臟SOD、GSH-PX顯著升高,MDA顯著降低(P<0.01)。見表4。

表4 桑芪益氣養陰方對胰島素抵抗大鼠MDA、SOD、GSH-Px的影響

2.4 桑芪益氣養陰方對胰島素抵抗大鼠肝臟ACC1、FASN、SCD1、GLUT2 mRNA表達的影響

與空白組比較,模型組大鼠ACC1、FASN、SCD1 mRNA表達顯著升高(P<0.01),GLUT2 mRNA表達顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,陽性藥組和桑芪益氣養陰方低、中劑量組大鼠ACC1、FASN、SCD1 mRNA表達顯著降低(P<0.01),GLUT2 mRNA表達顯著升高(P<0.01)。見表5。

表5 桑芪益氣養陰方對胰島素抵抗大鼠ACC1、FASN、SCD1、GLUT2基因表達的影響

2.5 桑芪益氣養陰方對胰島素抵抗大鼠肝臟ACC1、FASN、SCD1、GLUT2蛋白表達的影響

與空白組比較,模型組大鼠ACC1、FASN、SCD1蛋白表達顯著升高(P<0.01),GLUT2蛋白表達顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,陽性藥組大鼠ACC1、FASN、SCD1蛋白表達顯著降低(P<0.01),GLUT2蛋白表達顯著升高(P<0.01);桑芪益氣養陰方各劑量組大鼠FASN、SCD1蛋白表達均顯著降低(P<0.01),桑芪益氣養陰方中、高劑量組大鼠ACC1蛋白表達顯著降低,GLUT2蛋白表達顯著升高(P<0.01)。見表6,圖1。

注A空白組;B模型組;C陽性藥組;D桑芪益氣養陰方低劑量組;E桑芪益氣養陰方中劑量組;F桑芪益氣養陰方高劑量組。圖1 各組胰島素抵抗大鼠肝臟ACC1、FASN、SCD1、GLUT2蛋白條帶表達情況圖

表6 桑芪益氣養陰方對胰島素抵抗大鼠ACC1、FASN、SCD1、GLUT2蛋白表達的影響

3 討論

胰島素抵抗是導致2型糖尿病的重要病理機制之一,同時也是非酒精性脂肪肝、高脂血癥、動脈粥樣硬化等疾病的共同危險因素。胰島素抵抗的分子機制主要有糖毒性、脂毒性、氧化應激等,導致胰島素受體信號轉導異常。肝臟作為胰島素作用的主要靶器官及糖脂代謝的重要器官,肝臟胰島素抵抗在2型糖尿病的發生發展中起著舉足輕重的作用[7]。GLUT2是一種跨膜載體蛋白,是肝臟和血液之間葡萄糖轉移的主要轉運體,可調節葡萄糖跨細胞膜運動,維持血糖穩定。胰島素抵抗情況下,GLUT2蛋白表達減少,肝細胞葡萄糖攝取減少,可導致血糖升高[8];反之,肝臟GLUT2表達水平上調可促進肝組織對血液中葡萄糖的攝取,降低血糖水平[9]。前期研究顯示,桑芪益氣養陰方能顯著降低氣陰兩虛型糖尿病大鼠的胰島素抵抗指數,本研究結果顯示桑芪益氣養陰方還能顯著抑制胰島素抵抗環境下肝臟GLUT2蛋白的減少,增加肝糖原合成,從而降低血糖水平。

胰島素抵抗加速脂肪組織分解并刺激肝臟脂肪合成,引起脂質代謝紊亂。脂肪組織加速分解,血液中大量游離脂肪酸流入肝臟,肝臟游離脂肪酸含量增加[10];另外,胰島素抵抗過度刺激脂質的從頭合成(de novo lipogenesis,DNL)并使肝臟脂質合成長期亢進[11]。DNL是肝臟脂質合成的重要途徑,在維持血清甘油三酯穩態方面發揮重要作用[12]。ACC1、FASN和SCD1是DNL的三個關鍵酶。葡萄糖經糖酵解,在三羧酸循環中產生檸檬酸鹽,CoA在ATP檸檬酸裂解酶的作用下釋放,后經ACC1催化并轉化生成丙二酰輔酶A,FASN以丙二酰輔酶A為底物合成棕櫚酸酯,SCD1催化棕櫚酸酯發生去飽和反應并延長,產生復雜脂肪酸[13],造成肝臟內甘油三酯過度沉積。本研究顯示,桑芪益氣養陰方可減少肝臟游離脂肪酸含量,并通過下調胰島素抵抗大鼠肝臟組織的ACC1、FASN、SCD1mRNA和蛋白表達,抑制DNL的過度激活,減少肝臟脂質沉積,改善脂代謝紊亂。

氧化應激為肝臟糖脂代謝紊亂與肝臟胰島素抵抗、肝功能受損中間環節。高血糖狀態下氧化應激,一方面葡萄糖自身氧化作用增加,產生大量自由基;另一方面長期高血糖使多種蛋白質發生糖基化,形成糖基化終產物,過程中有大量自由基產生,其中SOD、GSH-Px等抗氧化酶的糖基化及活性下降加劇了氧化與抗氧化作用的失衡[14]。此外,過量游離脂肪酸在肝細胞線粒體內發生β氧化,影響線粒體的活性,使脂肪酸轉化為甘油三酯沉積在肝細胞中,肝臟脂質過量沉積加劇肝細胞氧化應激反應,產生過多的自由基與活性氧,導致脂質過氧化反應[15],并在反應末端產生MDA,并消耗SOD、GSH-Px等多種抗氧化酶,從而引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合,使細胞喪失功能,引起肝臟細胞凋亡,從而導致肝臟功能紊亂[16]。本研究結果顯示桑芪益氣養陰方可緩解肝臟氧化應激,從而改善胰島素抵抗并保護肝功能。

從中醫角度看,在2型糖尿病的發展過程中,脾虛氣少,津不上承則氣陰兩虛,脾失健運,不能轉谷為精,則濕濁內停,這與現代醫學中促進胰島素抵抗“糖毒”“濁毒”“氧化應激產物”等相似[17]。中醫在健脾益氣養陰的同時,必注重激濁揚清,化濕還津。桑芪益氣養陰方中黃芪健脾補氣,益氣養陰;桑葉清熱潤燥養陰,生津止渴;葛根健脾益氣,升舉清陽;玉竹甘寒質潤,益胃生津;蜂膠補虛弱,化濁脂,止消渴。諸藥合用,中州得健,納運有常,清陽得升,濁陰得降,濕濁得化,津液得復,則消渴得愈。現代藥理研究顯示,黃芪[18]、桑葉[19]、葛根[20]、玉竹[21]、蜂膠[22]均有確切的降糖作用。

本實驗研究顯示,桑芪益氣養陰方能通過增加肝糖原合成,降低血糖水平,減少糖毒;還能減少肝臟游離脂肪酸含量,減少肝臟脂質沉積,改善脂代謝紊亂,從而降低脂毒;尚能緩解肝臟氧化應激,從而改善肝臟胰島素抵抗并保護肝功能,其作用機制可能與調節ACC1/FASN/SCD1通路和GLUT2基因和蛋白表達有關。桑芪益氣養陰方既能減少糖毒、又能降低脂毒,還能保護肝臟,體現了中醫辨證論治,標本兼治的特點,為高糖高脂人群的疾病防治提供了方向。