黃芪石斛方對小鼠免疫功能的影響

扈覲璽 劉佳琪 邵紫萱 李麗 馮穎童 劉雙巧 賈嵐 王景霞

當代社會競爭日趨激烈,工作生活壓力增大,精神緊張,作息不規律等諸多因素,導致部分人群處于免疫力低下的亞健康狀態[1],而增強免疫力類保健食品是一種安全增強免疫力,改善亞健康狀態的有效措施。黃芪石斛方是在中醫辨證保健理論[2]指導下,基于未病先防的思想,針對免疫功能低下人群屬脾腎虧虛者而設,選擇具有健脾補腎,益氣養陰功效的黃芪、女貞子、西洋參、鐵皮石斛配伍而成。本研究按照《保健食品檢驗與評價技術規范》[3]評價黃芪石斛方增強免疫力的保健功能,探討“健脾補腎,益氣養陰法”與增強免疫力的關系,為黃芪石斛方精準應用于免疫力低下人群,降低患病風險提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

80只SPF級雄性昆明小鼠,體質量18～22 g,購自北京斯貝福生物技術有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010。動物飼養于北京中醫藥大學動物實驗室的屏障環境中,室溫為(24±2)℃,空氣相對濕度為(60±10)%,光照12小時/天,自由飲水。動物倫理審批號:BUCM-4-2019110201-4032。

1.2 實驗藥物

黃芪(批號:200602CP273)購自河北萬修藥業有限公司;女貞子(批號:201201)、西洋參(批號:201101)購自珠海市健興藥業有限公司;鐵皮石斛(批號:20201201)購自云南天泉生物科技股份有限公司。制備:由北京中醫藥大學中醫臨床藥學實驗室制備,按3∶3∶2∶3比例稱取黃芪、女貞子、西洋參、鐵皮石斛,經水提、濃縮、干燥、粉碎等工藝制得干膏粉,作為受試物。

1.3 主要試劑

刀豆蛋白A(Sigma,批號:L6397)、MTT(阿拉丁,批號:D274386)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(阿拉丁,批號:D103272)、乳酸脫氫酶(Sigma,批號:L1254)、PMS(Sigma,批號:P9625)、氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽(Sigma,批號:P9625)、Tris(阿拉丁,批號:T105289)、NH4Cl(阿拉丁,批號:A116370)、血清溶血素水平(serum hemolysin level,HC50)試劑盒(華英生物,批號:20220725)、免疫球蛋白A(華英生物,批號:20220915)、免疫球蛋白G(華英生物,批號:20220915)、免疫球蛋白M(華英生物,批號:20220915)、補體C3(華英生物,批號:20220915)、補體C4(華英生物,批號:20220915)、腫瘤壞死因子α(華英生物,批號:20220910)、γ干擾素(華英生物,批號:20220910)、白細胞介素2(interleukin 2,IL-2)(華英生物,批號:20220910)、綿羊紅細胞(華英生物,批號:20220915)、正常豚鼠血清(華英生物,批號:20220915)、都氏試劑(海標科技,批號:20220805H)。

1.4 主要儀器

電子天平(FA1004,上海力辰邦西儀器科技有限公司)、CO2培養箱(QP50,山東博科)、酶標分析儀(DR-200BS,華衛德朗)、數顯游標卡尺(精密度0.02 mm,ASOne)、微量注射器(50 μL,sigma-aldrich)、移液器(10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1000 μL ,Eppendorf)、HT7700型透射電子顯微鏡(TEM,日本日立公司)、neofuge 15R型冷凍離心機(heal force公司)。

1.5 實驗分組及給藥方法

80只小鼠隨機均分為A、B兩批,設小鼠遲發型變態反應、脾淋巴細胞轉化實驗、抗體生成細胞檢測實驗、血清溶血素測定實驗、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK細胞)活性測定、血清免疫球蛋白含量和補體含量測定7個試驗,A批進行遲發型變態反應、抗體生成細胞檢測實驗、血清溶血素測定實驗,B批進行脾淋巴細胞轉化、NK細胞活性測定以及血清免疫球蛋白含量和補體含量測定。兩批小鼠適應性飼養7天后,每批根據隨機數字表法分為4組即空白對照組、黃芪石斛方低(1.833 g/kg)、中(3.667 g/kg)、高劑量(5.5 g/kg)組(以生藥量計,每日灌胃劑量為人體用量10、20、30倍),每組10只?？瞻讓φ战M小鼠灌胃等體積的蒸餾水,各劑量組小鼠灌胃相應的黃芪石斛方溶液,灌胃量為0.1 mL/10g 體質量,連續給藥30天。

1.6 檢測指標與方法

1.6.1 胸腺指數與脾指數 稱取小鼠體質量、脾臟重量、胸腺重量,計算脾指數與胸腺指數。脾指數=脾臟重量/體質量;胸腺指數=胸腺重量/體質量。

1.6.2 遲發型變態反應實驗 小鼠于給藥第25天腹腔注射2%(v/v)綿羊紅細胞(sheep red blood cell,SRBC)進行免疫。免疫4天后,使用數顯游標卡尺測量左后足跖厚度并在測量部位注射20%(v/v)SRBC,于24小時后測量左后足跖部厚度,兩次測量均為同一部位測量三次,取平均值。結果以攻擊前后足跖厚度或腫脹度的差值表示。

1.6.3 抗體生成細胞檢測(Jerne改良玻片法) 小鼠于給藥第25天腹腔注射2%(v/v)SRBC進行免疫。5天后將小鼠頸椎脫臼處死,取出脾臟磨碎制成細胞懸液,調整細胞濃度為5×106/mL,與加入Hanks液的表層培養基(1 g瓊脂糖加雙蒸水至100 mL)混合均勻傾倒于刷瓊脂糖薄層的玻片上放入二氧化碳箱中孵育1～1.5小時,然后用SA緩沖液稀釋的補體(1∶8)加入到玻片架凹槽內,繼續溫育1～1.5小時后,計數溶血空斑數。

1.6.4 血清溶血素測定 小鼠于給藥第25天腹腔注射2%(v/v)SRBC進行免疫,5天后取血分離血清,設樣品孔和空白對照孔,樣品孔:取血清用SA緩沖液稀釋后依次加入SRBC,補體(用SA溶液按1∶8稀釋)?？瞻讓φ湛?除不加入血清外同樣品孔。置37°C恒溫培養箱中保溫30分鐘后,冰浴終止反應。水平離心10分鐘后分別取樣品孔和空白孔上清液加入另一個96孔板內加入都氏試劑。同時設半數溶血孔[加入10%(v/v)SRBC再加入都氏試劑]。用震蕩器充分混勻,放置10分鐘后,于540 nm處用全自動酶標儀測定各孔光密度值。溶血素的量以HC50表示,按下列公式計算。

1.6.5 ConA誘導脾淋巴細胞轉化實驗(MTT法) 小鼠于給藥第30天頸椎脫臼處死。無菌取脾,制備脾細胞懸液。將每一份脾細胞懸液分兩孔加入24孔培養板中,一孔加ConA液另一孔作為對照,置5%CO2,37℃CO2孵箱中培養72小時。培養結束前4小時,每孔吸去上清液,加入不含小牛血清的RPM1640培養液,同時每孔加入MTT繼續培養4小時。培養結束后,每孔加入酸性異丙醇,吹打混勻,使紫色結晶完全溶解。隨后分裝至96孔板中,每孔作3個平行孔,于540 nm處用全自動酶標儀測定各孔光密度值。用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細胞的增殖能力。

1.6.6 NK細胞活性實驗 小鼠于給藥第30天頸椎脫臼處死。無菌取脾,制備脾細胞懸液。取靶細胞和效應細胞加入U型96孔板中,靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養液,靶細胞最大釋放孔加2.5%Triton,上述各項均設三個平行孔于37℃、5%CO2培養箱中培養4小時,然后將96孔培養板離心并每孔吸取上清液置平底96孔培養板中,同時加入LDH基質液反應5分鐘,每孔加入1 mol/L的鹽酸溶液30 μL,在酶標儀490 nm處測定光密度值。并按照下式計算NK細胞活性。

1.6.7 血清生化指標測定 小鼠于給藥結束后,眼眶取血,室溫放置1小時,4°C 3000 r/min離心15分鐘分離血清備用。采用比色法檢測血清中免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量,免疫比濁法檢測血清中補體C3、C4含量。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 黃芪石斛方對動物臟器/體質量比值的影響

與空白對照組比較,黃芪石斛方各劑量組小鼠胸腺臟器指數與脾臟器指數差異無統計學意義(P>0.05),結果見表1。

表1 黃芪石斛方對小鼠胸腺指數和脾指數的影響

2.2 黃芪石斛方對SRBC誘導小鼠足跖厚度差值和抗體生成細胞的影響

與空白對照組比較,黃芪石斛方低、高劑量組足跖厚度差值顯著升高(P<0.05,P<0.01),低、中、高劑量組溶血空斑數均顯著升高(P<0.05,P<0.01)。見表2、3。

表2 黃芪石斛方對SRBC誘導小鼠足跖厚度的影響[M(P25,P75),mm]

表3 黃芪石斛方對SRBC誘導小鼠抗體生成細胞的影響

2.3 黃芪石斛方對SRBC免疫小鼠血清溶血素水平、脾淋巴細胞增殖、NK細胞活性的影響

與空白對照組比較,黃芪石斛方中、高劑量組血清溶血素水平均顯著升高(P<0.05,P<0.01),低、中、高劑量組脾淋巴細胞轉化值顯著升高(P<0.01),NK細胞活性顯著升高(P<0.01)。見表4。

表4 黃芪石斛方對SRBC免疫小鼠血清溶血素、淋巴細胞增殖能力、NK細胞活性的影響

2.4 黃芪石斛方對小鼠血清免疫球蛋白含量的影響

與空白對照組比較,黃芪石斛方低、中、高劑量組血清IgG、IgM、IgA含量均顯著升高(P<0.01),結果見表5。

表5 黃芪石斛方對小鼠血清免疫球蛋白含量的影響

2.5 黃芪石斛方對小鼠血清補體含量的影響

與空白對照組比較,黃芪石斛方低、中、高劑量組血清C3、C4含量均顯著升高(P<0.05,P<0.01),結果見表6。

表6 黃芪石斛方對小鼠血清補體含量的影響

3 討論

免疫力是免疫系統抵抗疾病的能力,人體具有一套完整的免疫防護系統如胸腺、脾臟、淋巴結、淋巴組織等[4],以及執行免疫功能的免疫活性細胞如T細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞等[5],這些免疫活性細胞在神經、體液及免疫系統的自身調節下,相互協調,執行自己的職能,以保證人體處于一個自身穩定的正常狀態。若免疫功能受損,機體免疫力下降,則不能正常發揮免疫功能,對細菌、病毒等病原微生物的抵抗能力降低從而容易罹患感冒、肝炎、結核等感染性疾病。

現代醫學免疫力的概念與中醫理論所述的“正氣”相似,正氣是相對邪氣的稱謂,泛指人體正常的生命物質及其功能活動,以及基于此而產生的各種維護能力,包括自我調節、適應環境、抗病祛邪和康復自愈等能力,是人體生理功能狀況的總稱[6]。中醫學認為“正氣存內,邪不可干”,正氣是人體感邪后發病與否,疾病轉歸、預后好壞的關鍵。正氣的旺盛依賴于正常的臟腑生理功能和充沛的氣血津液以及精微物質。若臟腑功能正常,氣血充盈,陰陽平衡,則外邪難以入侵,疾病就無從發生。因此,中醫主要通過調節臟腑功能,補益氣血,來維持機體內在的陰陽平衡,從而達到提高免疫力的作用。

《金匱要略》提出扶正祛邪以調補脾腎為主,五臟中首重脾腎。腎為先天之本[7],正氣之根,所以腎為免疫的生化之源,腎氣足,腎精充,方可正氣旺,免疫強,不僅少受邪氣侵襲,還可祛邪于外。脾胃為后天之本[8],氣血生化之源,所以脾為免疫的物質基礎。脾氣健旺,運化有度,免疫活性物質正常產生,機體免疫功能運作正常,反之脾氣虛則導致免疫功能低下[9]。脾腎相互資生,相互促進,即“先天促后天,后天滋先天”,健脾補腎對于調節免疫功能平衡至關重要。在現代醫學中根據免疫器官功能不同,分為中樞免疫器官和外周免疫器官,兩者通過血液循環和淋巴循環互相聯系。其中中樞免疫器官包括骨髓和胸腺,外周免疫器官包括淋巴結與脾臟[10]?！饵S帝內經》中指出“腎主骨生髓”[11],中醫理論認為骨髓功能的正常與否和腎精氣充盛與否相關聯,所以中醫理論中的補腎健脾與現代醫學中增強中樞和外周免疫器官功能思路相得益彰。

黃芪石斛方由黃芪、西洋參、鐵皮石斛、女貞子四味中藥組成,其中黃芪甘微溫,入脾經,能補氣健脾,生津養血,滋養后天之本,使氣血生化有源以不斷充養先天;西洋參甘苦涼,歸腎經,能大補元氣,補氣養陰,清熱生津;石斛甘寒,歸胃、腎經,能益胃生津,滋陰清熱;女貞子甘苦涼,歸肝、腎經,藥性和緩而持久,功善滋補肝腎,清退虛熱,補中有清,為一味清補之品。諸品合用,共奏健脾補腎,益氣養陰之功,且補中有清,滋而不膩,無溫燥上火之弊端?，F代研究顯示,黃芪[12-13]、西洋參[14-15]、鐵皮石斛[16]、女貞子[17-18]均具有增強機體免疫力的作用。且黃芪和女貞子配伍可以顯著提高環磷酰胺造成的免疫低下小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能,同時可以提高小鼠血清溶血素抗體水平及增強二硝基氯苯所致遲發型超敏反應[19]。國家市場監督管理總局查詢數據顯示,截至2023年2月,153項已批含鐵皮石斛的保健食品中有62項包含鐵皮石斛和西洋參配伍,徐建華[20]通過對小鼠和家兔的研究證明鐵皮石斛與西洋參單用及合用均具有養陰生津的功效,同時發現兩藥合用時有協同作用。楊明晶[21]研究發現鐵皮石斛和西洋參配伍可有效促進小鼠淋巴細胞增殖能力,提高產生抗體細胞和血清溶血素的功能,增強其NK細胞活性、腹腔巨噬細胞吞噬能力。這些研究也為黃芪石斛方用于增強機體的免疫力提供了理論依據。

B淋巴細胞受到抗原刺激后會增殖分化出大量漿細胞,漿細胞可合成和分泌多種免疫球蛋白,免疫球蛋白是機體體液免疫重要組成部分。IgG、IgM、IgA屬于免疫球蛋白中最重要的幾種類型。其量的變化可以一定程度反映B淋巴細胞功能進而反映機體體液免疫功能[22]。補體C3是補體系統的核心[23]為補體系統經典激活與替代激活途徑過程的關鍵成分。補體C4是經典途徑中第二個被激活的補體分子,其被活化后裂解成的C4b片段主要參與經典途徑中C3轉化酶和C5轉化酶的形成,介導補體后續成分的級聯反應[24],在30多種補體蛋白中,補體C3、C4與補體總水平趨勢一致,可反映補體系統的狀態,繼而反映機體免疫功能狀態[25]。本實驗中IgG、IgM、IgA、C3、C4水平均有不同程度的升高,說明黃芪石斛方可能通過調節B淋巴細胞分泌和補體系統來增強機體免疫功能。