長期有氧運動通過上調CTRP9-AdipoR1-AMPKeNOS信號通路改善自發性高血壓大鼠心肌功能

張昆茹，杜 麗，胡 萌

目前，全球成人高血壓患者已增至約12.8 億（Greenhalgh et al.，2021）。高血壓狀態下動脈血壓升高，心肌超負荷工作，心肌結構及功能發生變化，如不及時進行干預，將會引起心律失常、心衰及心肌梗死等并發癥，甚至危及生命。高血壓性心臟病已成為當今中國十大致死疾病之一（Zhang et al.， 2019）。探索改善高血壓狀態下的心肌功能和降低高血壓性心臟病的發病率及死亡率的有效方法是一項緊迫且艱巨的任務。

近年來，研究發現一個與脂聯素（adiponectin，APN）高度同源的蛋白超家族C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白（C1q/TNF-related proteins，CTRPs）家族。其中，CTRP9 與APN 的同源性最高，在血清、脂肪和心肌組織中高表達。CTRP9 不僅可以調節代謝、改善胰島素敏感性，且對心臟和血管具有廣泛的保護作用（雷虹 等， 2015； Yang et al.，2016）。CTRP9 可通過改善內皮依賴性舒張功能（楊瑞等， 2016）、抗氧化、抗血凝等作用保護血管內皮；CTRP9 還可通過抗炎、調節內皮細胞功能及代謝紊亂等途徑減緩冠心病（coronary artery disease，CAD）的進程（Zhang et al.，2020）。Fujita 等（2017）研究認為，血漿中CTRP9 水平可以作為糖尿病腎臟血管損傷的生物學標志（姚希 等，2020）。低水平血清CTRP9 不但與冠心病具有相關性（張正偉 等，2016），而且增加了心衰的發病率及死亡率（Gao et al.，2019）。

CTRP9 主要通過CTRP9-AdipoR1-AMPK 信號途徑發揮其心血管保護作用。CTRP9 激活該途徑可改善高脂飲食大鼠血管內皮依賴性舒張功能（Zheng et al.， 2011），減輕血管內皮細胞損傷（Sun et al.， 2017），CTRP9 誘導的低氧性肺動脈高壓大鼠肺動脈血管的舒張作用（楊瑞 等，2016）、CTRP9 減輕血管的炎癥反應均與AMPK 活化有關（Jung et al.， 2016）。對心肌而言，CTRP9 可通過激活AMPK-eNOS 信號通路抑制心肌細胞的凋亡、保護缺血/再灌注心肌（Kambara et al.， 2012）。心肌CTRP9 的表達降低與糖尿病性缺血心肌損傷有關（Su et al.， 2013）。然而，在實驗性壓力負荷增加的條件下，CTRP9 在心肌的表達增加與病理性的心肌肥大、心肌纖維化及心肌功能紊亂有關（Appari et al.， 2017）。而自發性高血壓狀態下，CTRP9 與心肌功能之間的關系尚不清楚。

體力活動減少是心血管疾病的主要危險因子之一（姜迪 等， 2014），運動訓練不僅可以降低心血管疾病的危險因子，還可改善心肌功能。內源性心肌保護因子的分泌增加是運動發揮心肌保護作用的機制之一（Guo et al.，2020）。研究顯示，健康個體一次高強度的間歇運動就可以增加血清中CTRP9 的水平（Kon et al.， 2019）。高血壓狀態下，運動對血清及心肌CTRP9 的表達有何影響、其在運動改善高血壓心肌功能中的作用并不明確。據此，本研究旨在通過建立長期游泳運動模型，明確CTRP9 在運動改善自發性高血壓大鼠心肌功能中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

18 只4 周齡雄性Wistar-Kyoto（WKY）大鼠和20 只自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat， SHR）購于北京維通利華有限公司。WKY 大鼠隨機分為WKY 安靜組（WKY 組，n=9）和WKY 運動組（WE 組，n=9），SHR大鼠隨機分為SHR 安靜組（SHR 組，n=9）和SHR 運動組（SE 組，n=11）。

1.2 運動方案

運動組大鼠進行9 周的無負重游泳運動。第1 周時，第1 天游泳15 min，以后每天遞增15 min，直至游泳時間遞增至60 min。隨后每周運動6 天，每天進行1 次60 min的游泳運動，持續8 周。最后1 次運動結束后24 h 進行檢測，心動超聲檢測心功能的變化，透射電鏡觀察大鼠心肌細 胞 的 結 構，Western blot 檢 測 心 肌CTRP9、AdipoR1、AMPK、eNOS 的蛋白表達水平的變化，Elisa 試劑盒檢測血清中CTRP9 和心肌NO 的濃度。

1.3 心動超聲檢查

用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于板上，采用 ⅤINNO 6ⅤET 小動物超聲儀進行心臟超聲檢查。大鼠胸前脫毛后涂抹超聲耦合劑，超聲探頭置于胸骨左側，與胸骨中線成10°～30°，顯示胸骨左室長軸切面。在左室短軸切面，于左心室乳頭肌短軸切面使用解剖M 型超聲，取樣線穿過前間隔和后側壁。由二維圖像引導，取M 型曲線記錄左心室運動曲線并進行測量，測量左心室射血分數（ejection fraction，EF）、左心室短軸縮短率（fractional shortening，FS）、左心室舒張末期內徑（left ventricular internal diastolic dimension，LⅤIDd）和左心室收縮末期內徑（left ventricular internal dimension systole，LⅤIDs），以期評價心肌功能。

1.4 透射電鏡切片制備

取心肌組織，立即放入4%戊二醛中，5 min 后修塊并進行定向切割，將樣品剪切成1 mm×1 mm×2 mm 小塊，再放入4%戊二醛中固定1～2 h，后用1%鋨酸后固定0.5～1.0 h；樣品經丙酮系列脫水后，環氧樹脂包埋；超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛進行雙染色后，采用日立HT 7700 型透射電鏡觀察。

1.5 Western blotting檢測

取大鼠心肌組織提取蛋白，BCA 法測蛋白濃度，根據蛋白定量結果調整上樣量。蛋白經SDS-PAGE 凝膠電泳分離后轉移到PⅤDF 膜上，滴加50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST 洗膜后依次加入1∶1 000 兔抗大鼠CTRP9（Abcam）、AdipoR1（Abcam）、AMPK（Abcam）、eNOS 抗體（Abcam）4 ℃孵育過夜。次日洗膜后，加入1∶1 000 的HRP 標記的羊抗兔IgG 室溫孵育1 h。免疫印跡化學發光法檢測，AZURE C300 凝膠成像系統進行半定量分析。

1.6 ELISA檢測

腹主動脈取血，離心提取血清組織，CTRP9 試劑盒（Abcam）檢測血清CTRP9 的濃度。嚴格按照CTRP9 試劑盒說明書操作。

取大鼠心肌組織提取蛋白，NO 試劑盒（Abcam）檢測心肌NO 的濃度。嚴格按照NO 試劑盒說明書操作。

1.7 數據處理

實驗數據均以M±SD表示，采用GraphPad Prism 6.0統計程序進行統計學分析。多組間數據比較采用ANOⅤA方差分析，若總體差異顯著，再以post-hoc 事后檢驗分析相應2 組間顯著性差別。以P＜0.05 為具有顯著性差異，P＜0.01 為具有極顯著性差異。

2 結果

2.1 運動對自發性高血壓大鼠心肌超微結構的影響

透射電鏡檢測結果顯示，與WKY 組相比，SHR 組大鼠心肌肌原纖維排列紊亂，肌小節結構破壞，Z 線斷裂，部分區域的肌絲溶解消失，線粒體形態異常，排布無規律，細胞核不完整；與SHR 組相比，SE 組大鼠心肌肌節明暗帶比較清晰，線粒體多數排列有序、緊湊，細胞核較完整，細胞的超微結構明顯改善（圖1）。本研究表明，SHR 組大鼠心肌纖維超微結構受損，運動對其有改善作用。

圖1 各組大鼠心肌超微結構比較（2 000×）Figure 1. Comparison of Myocardial Ultrastructure of Rats in Each Group （2 000×）

2.2 運動對自發性高血壓大鼠心肌功能的影響

心臟超聲結果顯示（圖2），與WKY 組比較，WE 組大鼠的EF、FS 及LⅤIDd 均升高，且具有顯著性差異（91.51±1.22 vs 85.50±1.09，P＜0.05；62.36±1.40 vs 52.68±2.07，P＜0.05；5.02±0.19 vs 3.73±0.09，P＜0.01）；SHR 組大鼠LⅤIDs明顯增加（2.17±0.03 vs 1.77±0.09，P＜0.05），EF、FS 均明顯下 降（78.97±1.03 vs 85.50±1.09，P＜0.05；42.75±1.12 vs 52.68±2.07，P＜0.05），說明自發性高血壓大鼠心肌功能下降。與SHR 組大鼠相比，SE 組大鼠的心肌功能有所改善，表現為EF、FS、LⅤIDd 均有明顯上升（87.53±0.95 vs 78.97±1.03，P＜0.01；51.24±1.23 vs 42.75±1.12，P＜0.01；4.80±0.06 vs 3.67±0.15，P＜0.01）。本研究結果表明，有氧運動可明顯改善WKY 和SHR 大鼠的心肌功能。

圖2 各組大鼠心動超聲結果比較Figure 2. Comparison of Echocardiography of Rats in Each Group

2.3 運動對自發性高血壓大鼠血清CTRP9水平的影響

同WKY 組相比，WE 組大鼠血清CTRP9 蛋白表達水平明顯增高（3.14±0.08 vs 2.83±0.10，P＜0.05；圖3），SHR組大鼠CTRP9 表達水平明顯降低（2.56±0.06 vs 2.83±0.10，P＜0.05；圖3）。同SHR 組相比，SE 組大鼠血清中CTRP9 蛋白水平明顯增加，且有極顯著性差異（3.15±0.08 vs 2.56±0.06，P＜0.01；圖3）。本研究結果表明，運動可以增加自發性高血壓大鼠血清中CTRP9的水平。

圖3 各組大鼠血清CTRP9的水平比較Figure 3. Comparison of CTRP9 Concentration in Serum of Rats in Each Group

2.4 運動對自發性高血壓大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK及eNOS表達的影響

與WKY 組相比，WE 組大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK、eNOS 蛋白表達均升高，且有顯著性差異（1.26±0.03 vs 1.18±0.03，P＜0.05；0.89±0.04 vs 0.83±0.03，P＜0.05；0.96±0.02 vs 0.89±0.03，P＜0.05；1.21±0.02 vs 1.13±0.02，P＜0.01；圖4）；SHR 組大鼠心肌4 種蛋白表達均呈明顯下降趨勢，且有顯著差異（1.18±0.03 vs 1.06±0.04，P＜0.05；0.78±0.05 vs 0.83±0.03，P＜0.05；0.76±0.04 vs 0.89±0.03，P＜0.01；1.07±0.01 vs 1.13±0.02，P＜0.05；圖4）。與SHR 組相比，SE 組大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK、eNOS 蛋白表達均明顯增加，且有顯著性差異（1.12±0.03 vs 1.06±0.04，P＜0.05；0.90±0.06 vs 0.78±0.05，P＜0.01；0.92±0.02 vs 0.76±0.04，P＜0.01；1.16±0.03 vs 1.07±0.01，P＜0.05；圖4）。本研究結果表明，有氧運動可明顯增加自發性高血壓大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK、eNOS 的表達水平，上調心肌CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS 信號系統。

圖4 各組大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK、eNOS蛋白表達比較Figure 4. Comparison of Protein Expression of CTRP9， AdipoR1， AMPK， and eNOS in Myocardium of Rats in Each Group

2.5 運動對自發性高血壓大鼠心肌NO濃度的影響

為了進一步探討運動對自發性高血壓大鼠CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS 信號系統的影響，對該信號系統的下游底物NO 濃度進行檢測（圖5）。實驗結果顯示，與WKY 組相比，WE 組大鼠心肌NO 濃度明顯增高，且有極顯著性差異（35.18±0.82 vs 32.11±0.44，P＜0.01）；SHR組大鼠心肌NO 水平明顯降低，且有顯著性差異（30.09±0.55 vs 32.11±0.44，P＜0.05）。同SHR 組相比，SE 組大鼠心肌NO 濃度明顯增高，有極顯著性差異（34.24±0.98 vs 30.09±0.55，P＜0.01）。本研究結果顯示，運動可以增加自發性高血壓大鼠心肌NO 的濃度，與運動對心肌CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS 的表達影響一致，說明運動可以上調自發性高血壓大鼠心肌CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS信號系統，促進NO 釋放，從而發揮對心肌的保護作用。

圖5 各組大鼠心肌NO濃度比較Figure 5. Comparison of NO Concentration in Myocardium of Rats in Each Group

3 討論

CTRP9 是一個具有廣泛心血管保護作用的細胞因子，在心肌和血清中高表達。血清CTRP9 水平降低可作為糖尿病、冠心病、冠心病合并糖尿病等疾病的獨立危險因素（楊和運 等，2020）。原發性高血壓隨著分級的提升，血清CTRP9 水平隨之降低（郭靚 等，2019；李麗賢 等，2019）。血清CTRP9 濃度降低與心衰的發病率及死亡率增高有關（Gao et al.，2019）。2 型糖尿病患者、2 型糖尿病合并動脈粥樣硬化患者血清CTRP9 的水平均降低，而且動脈的順應性較差（Asada et al.， 2016； Jung et al.， 2014）。高脂飲食大鼠同樣存在血清CTRP9 水平降低的現象。去除CTRP9 基因的小鼠在老年表現為肥胖合并胰島素抵抗，而CTRP9 轉基因小鼠飲食誘導的肥胖及代謝紊亂癥狀得到改善（Peterson et al.， 2013）。血清CTRP9 水平的降低與心血管的損傷及功能紊亂有關，CTRP9 水平增加可以改善代謝紊亂及胰島素抵抗，改善心血管功能。本研究發現，與WKY 組相比，SHR 組大鼠的心肌超微結構破壞，心肌功能紊亂，血清CTRP9 水平降低；與SHR 組相比，SE 組大鼠心肌細胞的超微結構和心肌功能明顯改善，血清CTRP9 水平增加。據此，本研究推測，SHR 大鼠血清CTRP9 水平的降低可能與心肌結構受損和心肌功能紊亂有關，運動對SHR 大鼠心肌結構和功能的改善作用可能與血清CTRP9 水平上調有關。

本研究顯示，8周的有氧運動可明顯增加SHR大鼠血清及心肌CTRP9這一內源性心肌保護因子的水平。本研究推測，血清中CTRP9 的增加可能與運動引起的心肌CTRP9 的增加有關。Kon 等（2019）研究發現，一次大強度的間歇運動可增加健康個體血清中CTRP9 的水平，改善胰島素的敏感性，這與本研究結果一致。Choi 等（2013）研究顯示，3 個月的有氧及阻力訓練可以增加血漿中CTRP5 的水平，說明運動對血清中CTRP 家族分子的影響與運動方案有關。

CTRP9 可通過激活AdipoR1-AMPK 信號途徑發揮對心血管的保護作用。本研究中，自發性高血壓大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK 的蛋白表達明顯下降，CTRP9-AdipoR1-AMPK 信號系統下調，CTRP9 對心肌的保護作用減弱，心肌功能下降；而經過8 周有氧運動后，自發性高血壓大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK 的表達明顯提高，CTRP9-AdipoR1-AMPK 信號系統上調，CTRP9 的心肌保護作用增加，心肌功能明顯改善。本研究結果表明，運動對自發性高血壓大鼠的心肌保護作用與心肌CTRP9-AdipoR1-AMPK 信號系統的上調有關。

eNOS 作為CTRP9-AdipoR1-AMPK 信號途徑的下游底物之一被激活后，促使NO 的生成，發揮對心血管的保護作用。本研究發現，自發性高血壓大鼠心肌eNOS 和NO 的水平明顯下降，而運動可顯著提高心肌eNOS 和NO的水平。本研究結果表明，運動可能通過激活CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS 通路增加NO 的水平，發揮對心肌的保護作用。此外，CTRP9 還可激活AdipoR1-AMPKNFκB 途徑，增強免疫功能、減輕心梗大鼠心肌損傷（Liu et al.， 2019），而CTRP9 抗動脈粥樣硬化的作用與CTRP9激活AdipoR1-AMPK 途徑抑制mTOR 的磷酸化有關（Huang et al.， 2019）。下游底物NFκB、mTOR 與CTRP9 對高血壓大鼠心肌的保護作用是否有關及其確切機制，還有待深入探究。

4 結論

1）自發性高血壓大鼠心肌結構受損及心肌功能下降與心肌CTRP9 水平下降有關。

2）長期有氧運動可通過促進心肌CTRP9 的表達，上調CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS 信號通路改善自發性高血壓大鼠的心肌功能。