貴州紅陽獼猴桃棒孢葉斑病病原菌分離鑒定及防治藥劑篩選*

黃 露，安星宇，熊 鑫，姚 令，何海永，吳石平

（1 貴州省農業科學院植物保護研究所，貴陽 550009）（2 貴州醫科大學）（3 貴州大學）

獼猴桃是一種重要的水果，目前我國是獼猴桃第一大生產國和出口國。貴州省是我國獼猴桃重要產區之一，獼猴桃種植面積居全國第3 位，已超3.33萬hm2，以貴長獼猴桃和紅陽獼猴桃為主，其中紅陽獼猴桃主要種植于六盤水地區，種植面積達0.67萬hm2。近年來，由于獼猴桃種植面積增加，病蟲害也逐漸加重，其中紅陽獼猴桃葉片上出現的病害發生危害日益嚴重，該病主要危害葉片造成褐色圓形病斑，使葉片早期脫落，嚴重影響樹體的生長發育、獼猴桃產量和品質，且目前當地對該病害防控效果不太理想。

當前已報道的獼猴桃葉部真菌病害主要有葉斑病、褐斑病、黑斑病等，其病原菌種類多樣、復雜，假尾孢菌（Pseudocercospora actinidiaevar.Huang）、鏈格孢菌（Alternariaspp.）、多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）、莖點霉（Phomasp.）、藤倉鐮刀菌（Fusarium fujikuroi）、可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）等都能引起獼猴桃葉部病害[1-12]。而對于貴州省獼猴桃葉片病害，潘慧等[13]發現六盤水獼猴桃葉片病原菌有膠孢炭疽菌、鏈格孢、稻黑孢，張國輝等[14]發現黔東南紅陽獼猴桃葉片褐斑病病原菌為交鏈格孢，Li 等[15]、冉飛等[16]發現六盤水獼猴桃葉片褐斑病菌為細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）。考慮獼猴桃葉片病害病原菌種類復雜，本研究對貴州省紅陽獼猴桃主栽地區——六盤水市水城區近年來發生嚴重的葉片病害進行了病原菌分離鑒定，并通過室內生物活性測定和田間藥效試驗，篩選了防治效果較好的防治藥劑，以期為當地紅陽獼猴桃葉片病害的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1葉斑病分離材料

2020 年7—8 月，在貴州省六盤水市水城區米籮鎮、發耳鎮紅陽獼猴桃上采集病葉。

1.1.2培養基

PDA 培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3引物

ITS、EF-1α、β-tubulin 基因引物：ITS1，5′-TCCG TAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4，5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3′；EF728，5′-CATCGAGAAGTTCGAG AAGG-3′；EF986，5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′；Bt2a，5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′；Bt2b，5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′[17-18]。

1.1.4供試藥劑

試驗所用藥劑的名稱及生產廠家如表1 所示。

表1 供試藥劑

1.2 試驗方法

1.2.1病菌的分離

參照《植病研究方法》，采用組織分離法，挑取獼猴桃葉斑病健組織塊轉接到PDA 培養基上，25 ℃培養5～7 d，然后進行純化和保存[19]。

1.2.2病菌的致病性測定

參照《植病研究方法》用柯赫氏法則對分離得到的菌株進行致病性驗證。

1.2.3病原菌的鑒定

對分離純化的病原菌進行形態特征觀察，記錄并描述病斑及病原菌的形態。采用ITS、EF-1α、β-tubulin 基因引物進行PCR 擴增，PCR 擴增體系（總體系為25 μL）：Mix 12.5 μL，Primer F（上游引物）1 μL，Primer R（下游引物）1 μL，DNA 模板1 μL，dd H2O 9.5 μL。PCR 反應程序：95 ℃3 min；95 ℃1 min，52 ℃55 s，72 ℃1 min，35 個循環；72 ℃5 min。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將有清晰條帶的樣品送北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。采用BioEide 對分離純化菌株及參考模式菌株的ITS、EF-1α、β-tubulin 基因的序列分別進行編輯，然后用MEGA6.0 軟件采用鄰接法進行系統發育樹構建和聚類分析。根據形態特征和分子系統學結果對病原菌進行分析和鑒定。

1.2.4藥劑室內毒力測定

其中，βh為截面高度影響系數，當h800 mm時，取βh=1.0，當h≥2 000 mm 時，取βh=0.9，中間值按線性內插法取；βs為荷載或反力作用面為矩形時長邊與短邊的比；um為板的臨界截面周長；h0為板的截面有效高度；η為影響系數，該值按式(9)、式(10)計算，并取最小值：

參照《農藥室內生物測定試驗準則 殺菌劑第2 部分：抑制病原菌真菌菌絲生長試驗 平皿法》（NY/T 1156.2—2006）[20]，配制不同梯度濃度的藥劑，以1∶9 的比例與PDA 培養基混合，并倒于培養皿中冷卻凝固。挑取5 mm 直徑的菌絲于平皿中央，以不加藥劑的PDA 平板為對照，于25 ℃恒溫培養箱中暗培養7 d，測量各處理的菌落直徑，計算平均值和抑菌率。

所得結果用DPS 7.5 數據處理系統軟件計算，求出各藥劑的毒力回歸式和EC50、EC90。

1.2.5田間防效試驗

試驗地點在貴州省六盤水市水城區發耳鎮獼猴桃種植基地，品種為紅陽，樹齡7 年。采用AGROLEX SPRAYER JACTO HD-400 利農16 升背負式噴霧器進行莖葉噴霧施藥，選取EC50較好的6 種藥劑，藥劑濃度參照登記在其他作物上的推薦濃度，45%咪鮮胺微乳劑1 500 倍液、250 g/L 丙環唑乳油1 000倍液、50%唑醚·喹啉銅水分散粒劑1 500 倍液、30%吡唑醚菌酯懸浮劑2 250 倍液、10%苯醚甲環唑水分散粒劑750 倍液、20%咪鮮·嘧菌酯懸浮劑800倍液進行田間藥效試驗。

試驗共設計7 個處理（以上6 種藥劑及清水對照），每個處理4 次重復，每個小區4 株獼猴桃。于7 月中旬開始施藥，施藥時葉片已發病，共施藥3 次，間隔7～10 d[8]。參照《農藥田間藥效試驗準則（二）第122 部分：殺菌劑防治葡萄霜霉病》（GB/T 17980.122—2004）[21]的調查方法，每小區隨機調查10 個蔓，自上而下調查全部葉片。參照白偉等[22]的方法，施藥結束后10 d 左右按以下分級標準記錄各級病葉數及總葉數，計算防效。

病害分級標準：0 級，無病；1 級，病斑面積占整個葉片面積的10%以下；3 級，病斑面積占整個葉片面積的11%～25%；5 級，病斑面積占整個葉片面積的26%～40%；7 級，病斑面積占整個葉片面積的41%～65%；9 級，病斑面積占整個葉片面積的66%以上。

病情指數＝［∑（各級病葉數×相應級數值）/（調查總葉數×9）］×100

防治效果（%）＝［1－（空白對照區施藥前病情指數×藥劑處理區施藥后病情指數）/（空白對照區施藥后病情指數×藥劑處理區施藥前病情指數）］×100

2 結果與分析

2.1 紅陽獼猴桃葉斑病病菌分離和鑒定

2.2 病菌分子鑒定

使用真菌ITS、EF-1α、β-tubulin 基因進行序列擴增、比對，然后將3 個基因進行組合，用MEGA6.0軟件鄰接法進行系統發育樹構建和聚類分析。通過構建系統發育樹發現所有菌株均與Corynespora cassiicola聚在一支，支持率為100%，鑒定6 株病菌均為多主棒孢霉Corynespora cassiicola（Berk.&M.A.Curtis）C.T.Wei（圖1）。

圖1 基于ITS、EF-1α和β-tubulin 序列構建的菌株系統發育樹

2.3 10 種殺菌劑對獼猴桃棒孢葉斑病菌的毒力測定

如表2 所示，10 種供試殺菌劑中，45%咪鮮胺微乳劑、20%咪鮮·嘧菌酯懸浮劑、30%吡唑醚菌酯懸浮劑、250 g/L 丙環唑乳油、50%唑醚·喹啉銅水分散粒劑、10%苯醚甲環唑水分散粒劑的抑菌效果較好，EC50分別為0.52、0.88、2.56、2.94、4.80、4.90 mg/L，為高度敏感。

表2 10 種殺菌劑的室內毒力測定

2.4 6 種殺菌劑對獼猴桃棒孢葉斑病的田間防效

如表3 所示，6 種殺菌劑中，20%咪鮮·嘧菌酯懸浮劑800 倍液、10%苯醚甲環唑水分散粒劑750倍液、50%唑醚·喹啉銅水分散粒劑1 500 倍液、45%咪鮮胺微乳劑1 500 倍液防效較好，防效分別為80.86%、79.54%、76.86%、76.17%。

表3 6 種殺菌劑的田間防效

3 討論與結論

獼猴桃葉片病害近年來已成為貴州省紅陽獼猴桃的主要病害之一，嚴重影響紅陽獼猴桃的樹勢及產量。獼猴桃葉片病害主要有葉斑病、褐斑病、黑斑病、炭疽病等，病原菌主要有假尾孢菌（Pseudocercospora actinidiae）、鏈格孢菌（Alternariasp.）、多主棒孢霉（C.cassiicola）、莖點霉（Phomaspp.）、藤倉鐮刀菌（Fusarium fujikuroi）、可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）、炭疽菌（Collectotrichumspp.）等[1-16,23]。但存在相同病原菌不同病名、同一病害不同病原的現象，如交鏈格孢（Alternaria alternata）引起的病害，Karakaya 等[4]命名為葉斑病，趙金梅等[3]稱為褐斑病；再如葉斑病，Kwon 等[9]認為病原菌是莖點霉（Phomasp.），Li 等[15]、冉飛等[16]認為病原菌是細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）。其中，棒孢霉（C.cassiicola）引起的獼猴桃葉部病害，Yuan 等[5]、郭睿文等[11]稱為葉斑病，崔永亮[6]稱為褐斑病。本研究分離得到的病原菌為多主棒孢霉C.cassiicola，與之前貴州省獼猴桃葉片病害報道的病菌不同[13-16]，與崔永亮[6]鑒定的四川獼猴桃褐斑病、Yuan 等[5]鑒定的廣西葉斑病及秦雙林等[8]鑒定的江西葉斑病的病原菌相同，癥狀基本一致。目前，多主棒孢霉（C.cassiicola）引起的獼猴桃葉部病害名稱不統一，建議參考李寶聚等[24]對“多主棒孢引起的蔬菜病害的命名建議”，在獼猴桃上也采用“寄主＋病原菌簡稱＋發病部位”的形式，將多主棒孢（C.cassiicola）引起的獼猴桃葉片病害命名為獼猴桃棒孢葉斑病，英文名為Corynesporaleaf spot of kiwifruit。

多主棒孢霉（C.cassiicola）可侵染多種經濟作物，如橡膠、黃瓜、西葫蘆、番茄等[11,25]，目前針對多主棒孢霉的防控主要依靠化學防治，研究發現多菌靈、甲基硫菌靈、丙環唑、苯醚甲環唑、嘧菌環胺、四氟醚唑、咪鮮胺錳鹽、戊唑醇等對其有較好的抑制能力[6,11,26-27]，但對于多主棒孢霉引起獼猴桃葉斑病害的研究較少，僅崔永亮[6]、郭睿文等[11]進行了相關室內測定及田間試驗。本研究對咪鮮·嘧菌酯、咪鮮胺、丙環唑、唑醚·喹啉銅、吡唑醚菌酯、喹啉銅、嘧菌酯、苯醚甲環唑、呻嗪霉素、啶氧菌酯等10 種藥劑進行了室內毒力測定和田間藥效試驗，發現20%咪鮮·嘧菌酯懸浮劑、10%苯醚甲環唑水分散粒劑、50%唑醚·喹啉銅水分散粒劑、45%咪鮮胺微乳劑對多主棒孢（C.cassiicola）引起的紅陽獼猴桃葉斑病均具有較好的防治效果，可用于病害的防控。但目前貴州省及全國獼猴桃葉片病害已發現具有多種病原菌，可能在獼猴桃生長階段受到多種葉斑病菌侵染，因此在葉斑病防控中應考慮多種病菌的因素，選擇合適的防治藥劑，同時加強對多種病菌的發生規律及致病機制的研究，多方面地進行綜合防控。