miR-372靶向E2F轉錄因子5抑制宮頸鱗狀細胞癌SiHa細胞的惡性生物學行為

王冬苗,稅明才,熊林,李賢見

(重慶市開州區人民醫院,1.腫瘤科;2.檢驗科,重慶 405400)

宮頸鱗狀細胞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)約占宮頸癌的80%～85%,發病與人乳頭瘤病毒感染有關,好發于50～55歲女性人群,呈年輕化趨勢[1-2]。我國每年死于宮頸癌的人群≥3萬,且CSCC早期癥狀不明顯,隨著病情進展至晚期,腫瘤侵犯病灶周圍組織或遠處轉移,嚴重威脅女性生命安全[3-4]。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)是具有調節功能的內源性非編碼小分子RNA,可參與宮頸癌組織細胞增殖、凋亡及侵襲、遷移等過程,是宮頸癌診斷、治療靶標以及預后和療效評估的新指標之一[5-6]。miR-372位于染色體19q13.42,參與人類多種惡性腫瘤惡性行為,在腫瘤發生、進展過程中表現出致癌或抑癌作用[7]。miR-372可通過調節細胞周期相關蛋白激酶活性,控制腫瘤細胞生長、細胞周期運行,促進胃癌和腦膠質瘤發生和進展[8]。miR-372在腎癌、乳腺癌組織及其細胞系中表達量降低,其表達量升高可促進腫瘤細胞凋亡,在不同類型腫瘤發生、進展過程中發揮關鍵作用[9],但miR-372在CSCC方面的相關研究報道較少。因此,本研究擬探討miR-372對CSCC細胞SiHa細胞系惡性生物學行為的影響及其可能作用的靶標。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2022年6月重慶市開州區人民醫院收治的63例行根治術治療并經病理學確診為CSCC患者作為研究對象。納入標準:(1)術前未進行放、化療;(2)自愿簽署知情同意書;(3)年齡42～63歲。采集手術切除的癌變組織及其癌旁組織(距離癌組織5 cm)。本研究經醫院倫理委員會通過批準。

1.2 材料及儀器

1.2.1 細胞材料 人源性SiHa細胞株(上海信裕生物科技有限公司)。

1.2.2 試劑 miR-372 mimic、NC-miR、miR-372 inhibitors、NC-anti-miR(廣州威佳科技有限公司),Lipofectamine?2000(美國Invitrogen公司),pcDNA-E2F5質粒載體和其陰性對照(上海雅吉生物科技有限公司),MTT Kit(Sigma-Aldrich),兔多抗細胞增殖相關核蛋白(nuclear associated antigen,Ki67)與鼠多抗增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體(武漢菲恩生物科技有限公司),雙熒光素酶試劑盒(武漢純度生物科技有限公司),ECL Kit(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司),RNAprep pure細胞試劑盒與Reverse Transcriptase Kit(天根生化科技北京有限公司),2×HSYBR qPCR Mix(北京莊盟國際生物基因科技有限公司),流式細胞凋亡檢測試劑盒(上海嶸崴達實業有限公司),兔多抗細胞周期蛋白A1(Cyclin A1)、細胞周期蛋白依賴性激酶2(Cyclin-dependent kinase 2,CDK2)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Caspase-9)、兔多抗Caspase-3、兔多抗B淋巴細胞瘤2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、兔多抗Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體(武漢益普生物科技有限公司)。

1.2.3 儀器 冷凍離心機(德國eppendorf公司),熒光定量PCR儀(德國Jena公司)。

1.3 方法

1.3.1 miR-372靶基因預測 TargetScan/TargertScanS在線預測顯示E2F5為miR-372的靶基因之一。

1.3.2 細胞培養和轉染 SiHa細胞株采用含有10%胎牛血清的DMEM培養基培養(37 ℃、5% CO2),第3代細胞用于后續實驗。細胞轉染前24 h,SiHa細胞接種至6孔板(3×105/孔),采取無血清培養基培養過夜,待SiHa細胞匯合度>50%,按照Lipofectamine?2000試劑盒說明將miR-372 mimic(5′-AAGCUGGAUCAGUCAGUCAGUCAGUCAGUCAGUCU U-3′)、NC-miR(5′-UCCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)、miR-372 inhibitors(5′-ACGCUCAGUCAGUCAGUCAGUCAGUCUU-3′)、NC-anti-miR(5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′)分別轉染至SiHa細胞,并分別記為miR-372組、NC-miR組、anti-miR-372組和anti-miR組,繼續培養48 h,然后收集各組細胞用RT-PCR檢測miR-372表達水平。明確各細胞系轉染成功后,參照文獻[10]將E2F5過表達質粒(pc-E2F5)、(5′-GAGGUACCCAUUCCAGAAATT-3′)及陰性對照(5′-UUAAAGUUGUAGUCAUCUGTT-3′)分別轉染miR-372 SiHa細胞系,并分別記為miR-372+E2F5組、miR-372+pc組,RT-qPCR檢測E2F5表達水平。

1.3.3 miR-372、E2F5表達檢測 提取組織樣本和細胞總RNA并逆轉錄生成cDNA用于RT-qPCR擴增模板,PCR擴增條件為:95 ℃ 3 min,95 ℃ 12 s、40個循環,62 ℃ 1 min。miR-372,前引物5′-ACACTCCAGCTGGGAAAGTGCTGCGACATTT-3′,后引物5′-GTGCAGG GTCCGAGGTT-3′,產物157 bp;E2F5,前引物5′-CACCTTCTGGTACACAACTGG-3′,后引物5′-GGGCTTAGATGAACTCGACTC-3′,產物128 bp;U6,前引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′,后引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,產物109 bp;β-actin,前引物5′-AGCCATGTACGTACCCATCC-3′,后引物5′-ACCCTCATAGAT CCCGCACAG-3′,產物115bp;2-△△Ct計算出miR-372、E2F5相對表達量。

1.3.4 熒光素酶活性試驗 軟件預測在E2F5 3′-UTR與miR-372存在結合位點,并合成該位點及其突變體的DNA片段(E2F5 wt、E2F5 mut),克隆至雙熒光素酶啟動子載體pGL3,將miR-327 mimic共轉染至SiHa細胞,孵育48 h,依據試劑盒操作說明比較各組細胞熒光素值變化。

1.3.5 MTT檢測細胞活性 將轉染成功SiHa細胞調整密度至3×104個/mL,以200 μL/孔接種于96孔板,培養48 h后,加入MTT溶液反應4 h,于570 nm波長檢測吸光值,細胞存活率=(轉染組吸光值/陰性對照組吸光值)×100%。

1.3.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 將轉染成功的SiHa細胞調整密度至4×104個/mL,以400 μL/孔接種于6孔板,培養48 h后經離心棄上清,重懸細胞后加Annex-inV/FITC、PI混合,室溫避光孵育15 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.7 Transwell檢測細胞侵襲 將SiHa細胞以3×104個/孔接種至上室(預先用無血清Mateigel膠包裹),下室注入含血清培養基,培養24 h,棉簽擦除未穿過膜的細胞,固定、1%結晶紫染色,記錄高倍鏡觀察5個不重疊視野中細胞數取其均值。

1.3.8 蛋白質印跡法檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白,經SDS-PAGE分離、轉移至PVDF膜、室溫密封2 h,洗膜后,加兔多抗Ki67、PCNA、Cyclin A1、CDK2、N-cadherin、E-cadherin、Caspase-3、Bcl-2、Bax抗體和兔抗人Caspase-9抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜,將膜與辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)偶聯的抗小鼠/兔IgG 37 ℃孵育2 h,顯色、曝光、定影。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 CSCC癌組織及其癌旁組織中miR-372和E2F5表達水平比較

宮頸鱗狀細胞癌組織中miR-372表達水平低于其癌旁組織(P<0.05);E2F5表達水平高于其癌旁組織(P<0.05)。見圖1。

2.2 miR-372過表達對SiHa細胞增殖的影響

miR-372 SiHa細胞活性和Ki67、PCNA、cyclin A1、CDK2蛋白水平均低于NC-miR 組(P<0.05),anti-miR-372組細胞增殖率及Ki67、PCNA、cyclin A1、CDK2蛋白水平高于NC-anti-miR 組(P<0.05)。見圖2。

2.3 miR-372過表達對SiHa細胞凋亡的影響

miR-372 組細胞凋亡率和Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2/Bax蛋白水平高于NC-miR 組(P<0.05);anti-miR-372 組細胞凋亡率和Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2/Bax蛋白水平低于NC-anti-miR 組(P<0.05)。見圖3。

2.4 miR-372過表達對SiHa細胞侵襲的影響

miR-372 組細胞侵襲數目和N-cadherin蛋白水平低于NC-miR 組(P<0.05);E-cadherin蛋白水平高于NC-miR 組(P<0.05)。anti-miR-372 SiHa細胞侵襲數目和N-cadherin蛋白水平高于NC-anti-miR 組(P<0.05);E-cadherin蛋白水平低于NC-anti-miR 組(P<0.05)。見圖4。

2.5 miR-372與E2F5靶向關系確定

miR-372 組細胞的E2F5相對表達水平低于NC-miR 組(P<0.05),而anti-miR-372 組細胞的E2F5相對表達水平高于NC-anti-miR 組(P<0.05)。TargetScan/TargertScanS在線預測篩選結果顯示E2F5 3′-UTR存在與miR-372結合位點,雙色熒光素酶活性E2F5 wt/miR-327 mimic SiHa細胞的熒光素酶活性信號降低(P<0.05)。見圖5。

在miR-372 組細胞基礎上過表達E2F5并檢測細胞生物學行為,發現miR-372+E2F5 SiHa細胞增殖率、細胞侵襲數目和cyclin A1、CDK2、N-cadherin蛋白水平均高于miR-372+pc 組(P<0.05);細胞凋亡率和Caspase-3、E-cadherin蛋白水平均低于miR-372+pc 組(P<0.05)。見圖6。

3 討論

miRNA可通過與靶基因的mRNA的3′-UTR進行不完全互補配對結合,在轉錄水平調節其相關靶基因翻譯水平,參與細胞生長、凋亡、侵襲等生理活動[11]。既往研究[12]發現已有195種miRNA在宮頸癌中高表達,呈低表達趨勢則有96種。miR-372在卵巢癌組織中的表達水平明顯低于正常卵巢組織和良性腫瘤組織,在抑制卵巢癌組織細胞生長過程中占據重要作用[13]。本研究顯示,宮頸鱗狀癌組織miR-372表達下調,而E2F5表達呈上升趨勢,因此miR-372可能在宮頸鱗狀癌生長過程中發揮調節作用。

宮頸鱗狀癌細胞生長過程與細胞增殖密切相關,PCNA本質為DNA聚合酶δ輔助蛋白,對細胞增殖過程中的DNA復制有促進作用[14],還參與DNA復制所需的聚合酶合成,調節細胞分裂周期從G1期進入S期,其表達水平高低直接影響細胞的增殖速度[15]。Ki-67表達水平異常與惡性腫瘤細胞增殖、分化和轉移關系密切[16]。Cyclin A1能與CDK2組成復合體促進細胞周期S期、G2/M期運轉通暢,整合參與細胞生長過程中的多個信號通路。本研究通過構建轉染細胞系發現miR-372過表達可降低細胞增殖和Ki67、PCNA、Cyclin A1、CDK2蛋白表達,miR-372低表達細胞呈相反趨勢,說明miR-372過表達可以抑制SiHa細胞增殖,可能與影響細胞周期相關蛋白水平表達有關。

腫瘤細胞的惡性行為除細胞增殖失控外,還伴有惡性細胞侵襲病灶周圍組織和細胞凋亡情況減弱。細胞凋亡信號刺激可促使Caspase家族成員活化狀態與非活化狀態發生改變,經Caspase-3蛋白誘導細胞凋亡。Bcl-2和Bax可以通過改變線粒體膜的通透性,調節細胞凋亡情況[17]。E-Cadherin、N-Cadherin是上皮-間質轉化過程的標志物,上皮-間質轉化可促進腫瘤細胞發生轉移、浸潤。本研究中,miR-372過表達可提高SiHa細胞系的細胞凋亡率和Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2/Bax、E-cadherin蛋白水平,降低細胞侵襲數目和N-cadherin蛋白表達,miR-372低表達對SiHa細胞系的上述指標的作用趨勢完全相反,表明miR-372過表達可抑制SiHa細胞侵襲和促進細胞凋亡。

E2F轉錄因子可通過調節DNA合成和增殖相關基因表達水平參與細胞周期運轉,已有研究[18]表明miR-372-3p通過靶向作用E2F9調節肺鱗癌細胞的增殖和侵襲能力。本研究通過生物信息軟件對miR-372預測分析發現miR-372可以與E2F5的3′-UTR的某些位點結合,證實E2F5是miR-372的靶基因,并且通過雙色熒光素酶活性試驗得到證實。本研究還顯示,在miR-372過表達SiHa細胞系基礎上提高E2F5表達量可以減弱miR-372過表達對SiHa細胞增殖和侵襲的抑制效果,降低SiHa細胞凋亡情況,并且還會影響miR-372過表達對SiHa細胞系中cyclin A1、CDK2、N-cadherin、Caspase-3、E-cadherin蛋白表達,說明miR-372可能通過靶向作用E2F5抑制SiHa細胞的惡性生物學行為。

綜上,miR-372過表達可抑制SiHa細胞增殖和侵襲、促進細胞凋亡,可能與靶向作用抑制E2F5表達有關,但關于其中具體作用機制還需要進一步研究。