天南星多糖通過下調circ_0010235調控肺癌細胞s增殖、遷移和凋亡

仲川岳,吳雪元,朱紅燕

(蘇州市中西醫結合醫院腫瘤科,江蘇 蘇州 215000)

肺癌是世界上發病率和死亡率均最高的惡性腫瘤,盡管手術、放化療等治療策略等不斷進展,但肺癌患者的整體生存率和預后仍較差[1]。中藥可增強常規治療的作用,減少不良反應和毒性,減輕患者疼痛,提高生活質量,是一種潛在有效的肺癌輔助治療方法[2]。天南星是我國傳統中藥,其性味苦辛、溫,歸肺、肝經,具有燥濕化痰、消腫散結之功效[3]。天南星多糖是天南星的主要活性成分之一,已經證實其在S180荷瘤小鼠、腎癌、乳腺癌中的抗癌作用[4-6]。近期研究[7]顯示,天南星提取物通過調控miR-320/E2F1抑制肺癌細胞增殖并促進凋亡。天南星提取物是天南星主要活性成分的集合物,故本研究推測天南星多糖同樣具有抗肺癌作用,且可能與調控非編碼RNA水平相關。環狀RNA(circRNA)是一組具有閉環結構的非編碼RNA,其通過circRNA/微小RNA(miRNA)/mRNA軸參與了肺癌的發生、侵襲和轉移[8]。研究報道肺癌中circ_0010235表達增加,下調circ_0010235可抑制肺癌細胞增殖和自噬,誘導細胞凋亡,抑制腫瘤生長[9]。已有研究[10-11]表明,中藥活性成分的抗腫瘤活性可能與非編碼RNA的異常調控有關,如龍葵多糖通過調控circ_UHRF1/miR-513b-5p軸抑制肺癌A549細胞的增殖、遷移和侵襲,并誘導細胞凋亡[12];小蘗堿對子宮內膜癌生長的抑制作用與下調circ_ZNF608/miR-377-3p/COX2軸有關[13]。因此,本研究利用肺癌細胞A549研究天南星多糖的體外抗肺癌作用,并探討天南星多糖與circ_0010235的調控作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人肺癌細胞A549(美國ATCC);si-NC、si-circ_0010235、pcDNA、pcDNA-circ_0010235(南京金斯瑞生物公司);脂質體2000(美國Invitrogen公司);天南星藥材由蘇州市中西醫結合醫院中藥房提供;CCK-8試劑盒(南京凱基生物公司);Annexin V-FITC/PI雙染法凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物公司);Transwell裝置、Matrigel(美國BD公司);cDNA合成試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(大連寶生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 A549細胞在補充1%青霉素/鏈霉素混合液、10%胎牛血清的DMEM高糖培養基置于含5% CO2、37 ℃濕潤培養箱孵育,細胞80%融合消化細胞,1∶4傳代。

1.2.2 實驗分組 取1 mL 2×104個對數期A549細胞接種24孔板,細胞50%時進行脂質體轉染,即分別將si-NC、si-circ_0010235、pcDNA、pcDNA-circ_0010235轉染到A549細胞中,在轉染48 h時收集細胞,RT-qPCR檢測circ_0010235水平以評估下調或上調circ_0010235表達效果。參照唐化勇等[5]實驗方法制備天南星多糖:將洗凈的天南星根莖粉碎,加入40×體積的蒸餾水,煮沸4 h;過濾后離心,將上清液濃縮至原體積的20%,加入無水乙醇,過夜后離心,在得到的沉淀中加入蒸餾水重復上述操作,二次沉淀得到的即為天南星多糖(純度>91.5%)。實驗時用細胞培養液稀釋至實驗濃度。分別用含0、50、100、200 μg/mL天南星多糖的培養液孵育A549細胞48 h,依次記為0、50、100、200 μg/mL天南星多糖組。轉染si-NC、轉染si-circ_0010235的A549細胞依次記為si-NC組、si-circ_0010235組;用含200 μg/mL天南星多糖孵育轉染pcDNA、轉染pcDNA-circ_0010235的A549細胞48 h,依次記為天南星多糖+pcDNA組、天南星多糖+pcDNA-circ_0010235組。

1.2.3 CCK-8和克隆形成實驗檢測細胞增殖 (1)CCK-8實驗:取100 μL(5×103個/孔)未轉染細胞、轉染細胞接種96孔板,貼壁后根據實驗分組給予對應劑量的天南星多糖孵育48 h。每孔加入10 μL CCK-8試劑于37 ℃培養箱孵育2 h。酶標儀測定450 nm各孔細胞光密度(OD)值。增殖抑制率=(1-OD實驗組/OD對照組)×100%。(2)克隆形成實驗:每組取8×102個細胞(40 μL)接種6孔,旋動平板使細胞均勻分散。置于37 ℃培養箱孵育兩周后用4%多聚甲醛固定細胞集落,用0.1%結晶紫溶液染色并拍照。顯微鏡下進行細胞集落計數(>50個細胞)。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞遷移 將0、50、100、200 μg/mL天南星多糖組、si-NC組、si-circ_0010235組、天南星多糖+pcDNA組、天南星多糖+pcDNA-circ_0010235組細胞懸浮于不含血清的培養基中,細胞密度為1×106個/mL,取100 μL接種頂部腔室。在底部腔室中加入500 μL完全培養基。37 ℃培養箱孵育48 h后,用棉簽擦去上室內的細胞,4%多聚甲醛固定,結晶紫染色,顯微鏡下觀察染色細胞數,即為遷移細胞數。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 將A549細胞接種到6孔板中,按照1.2.2的分組處理細胞,48 h后收集細胞,在結合緩沖液中重新懸浮,細胞密度為5×104個/mL。取5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI試劑分別加入到500 μL細胞懸液中,避光孵育15 min。流式細胞儀檢測凋亡細胞比例。右上(早凋)和右下(晚凋)象限的細胞百分率之和為凋亡率。

1.2.6 RT-qPCR檢測circ_0010235表達 用TRIzol試劑從經過處理的0、50、100、200 μg/mL天南星多糖組、si-NC組、si-circ_0010235組、天南星多糖+pcDNA組、天南星多糖+pcDNA-circ_0010235組A549細胞分離總RNA,用cDNA合成試劑盒進行逆轉錄反應,用SYBR?Premix Ex TaqTM進行RT-qPCR。反應體系包括10 μL (2×)SYBR?Premix Ex TaqTM,2 μL PCR引物,0.4 μL ROX Reference Dye,1 μL 逆轉錄反應產物,補加ddH2O至20 μL。反應條件95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環。circ_0010235上游引物5′-ACG TCT ACC CGG ATG ACA AG-3′,下游引物5′-CTG CGT GAA GGC TAA GAC G-3′;GAPDH上游引物5′-GGG AAG GTG AAG GTC G-3′,下游引物5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT-3′。GAPDH為內參,2-ΔΔCt法計算circ_0010235表達水平。circ_0010235相對表達水平=2-實驗組(Ctcirc_0010235-CtGAPDH)-對照組(Ctcirc_0010235-CtGAPDH)。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 天南星多糖對A549細胞增殖、遷移的影響

與0 μg/mL組比較,50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL組天南星多糖處理后A549細胞抑制率升高(P<0.05),克隆形成數、遷移數均減少(P<0.05)。見表1。

表1 天南星多糖抑制A549細胞增殖和遷移

2.2 天南星多糖對A549細胞凋亡的影響

與0 μg/mL組比較,50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL組天南星多糖處理后A549細胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖2及表2。

表2 天南星多糖誘導A549細胞凋亡率

2.3 天南星多糖對A549細胞中circ_0010235表達的影響

與0 μg/mL組比較,50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL組天南星多糖處理后A549細胞circ_0010235表達水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 天南星多糖對A549細胞中circ_0010235表達的檢測

2.4 下調circ_0010235對A549細胞增殖、凋亡和遷移的影響

與si-NC組比較,si-circ_0010235組A549細胞抑制率、凋亡率均升高(P<0.05),circ_0010235表達水平、克隆形成數、遷移數均減少(P<0.05)。見圖3及表4。

表4 下調circ_0010235對A549細胞增殖遷移及凋亡的影響

2.5 上調circ_0010235表達部分逆轉天南星多對A549細胞增殖、凋亡、遷移的影響

與天南星多糖+pcDNA組比較,天南星多糖+ pcDNA-circ_0010235組A549細胞circ_0010235表達水平、克隆形成數、遷移數均增加(P<0.05),抑制率、凋亡率均降低(P<0.05)。見圖4及表5。

表5 circ_0010235可逆轉天南星多糖對A549細胞增殖凋亡遷移的作用

3 討論

中藥化合物可誘導腫瘤凋亡,阻滯細胞周期,抑制腫瘤轉移,影響免疫反應,是腫瘤治療潛在候選藥物[14-16]。研究[4]報道天南星多糖可抑制S180荷瘤小鼠腫瘤形成,促進抗腫瘤免疫因子合成,從而增強機制的抗腫瘤免疫能力。天南星多糖通過抑制Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)通路對腎癌細胞增殖具有一定抑制作用,并可誘導細胞G0/G1期阻滯和凋亡[5]。天南星多糖還通過抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路激活來抑制乳腺癌細胞增殖和上皮間質轉化,誘導細胞凋亡,其與順鉑合用可提供協同作用,這些證據提示天南星多糖在癌癥治療中的重要性[6]。本研究結果顯示,天南星多糖以劑量依賴方式降低A549細胞增殖能力,減少克隆形成和遷移數量,增加細胞凋亡率,提示天南星多糖可通過抑制肺癌細胞增殖和轉移從而抑制肺癌進展。

circRNA是非編碼RNA的重要組分,具有吸附miRNA功能,circRNA異常表達在肺癌的癌變和發展中發揮重要調控作用[17]。此外,circRNA還可能是中藥化合物抗肺癌的潛在靶點,Yu等[18]研究發現染料木素通過調控circ_0031250/miR-873-5p/叉頭框轉錄因子M1(FOXM1)軸來抑制非小細胞肺癌的進展。肉桂醛對肺癌細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用與上調circ_0043256表達有關[19]。既往研究[20]顯示,circ_0010235在肺癌組織和細胞中過表達,其缺失可通過不同途徑限制肺癌細胞系的增殖和轉移,并促進肺癌細胞凋亡。故本研究推測天南星多糖可能通過調控circ_0010235表達發揮抗肺癌作用。本研究結果顯示,天南星多糖以劑量依賴方式下調A549細胞中circ_0010235表達水平,提示circ_0010235低表達可能介導天南星多糖的抗肺癌作用。下調circ_0010235表達可抑制降低A549細胞增殖能力,減少克隆形成和遷移數量,增加細胞凋亡率,與Zhu等[21]報道下調circ_0010235表達在肺癌中的抑癌作用一致。為證實天南星多糖的抗肺癌作用依賴于circ_0010235表達下調,本研究將pcDNA-circ_0010235轉染至A549細胞,結果顯示上調circ_0010235表達減弱天南星多糖對A549細胞的抗增殖、促凋亡和抗遷移作用,進一步證實天南星多糖可能通過下調circ_0010235表達來抑制肺癌進展。

綜上,天南星多糖通過抑制細胞增殖、遷移及誘導細胞凋亡來發揮抗肺癌活性,其機制可能與下調circ_0010235表達有關,這為天南星多糖的抗腫瘤活性提供新的見解,為開發天南星多糖防治肺癌提供重要依據。