敲低CASC9表達對食管鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

李倩倩,唐茂林,趙世圣,胡為民

(川北醫學院基礎醫學與法醫學院免疫學教研室,四川 南充 637000)

食管癌是一個全球的重大健康挑戰。最新的全球統計數據顯示,食管癌是導致癌癥相關死亡的第六大原因,也是全球第七大常見癌癥[1]。在我國,尤其是川東北地區發病率及死亡率居高不下。長鏈非編碼核糖核酸(long noncoding ribonucleic acid,lncRNA)是近十多年來腫瘤研究的新熱點,部分lncRNA與腫瘤的密切相關性被越來越多的認識,其可在染色體重構、轉錄、轉錄后和表觀遺傳學水平上發揮重要調控作用,影響腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、轉移、耐藥、復發等過程,在不同腫瘤中可表現出抑癌或促癌作用[2]。目前已發現癌癥易感候選蛋白9(cancer susceptibility candidate 9,CASC9)與口腔鱗癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、肺鱗癌等不同腫瘤的發生發展及耐藥、預后都存在密切相關性[3]。本研究擬探討CASC9對相關分子RAS同源家族成員A(RAS homolog family member A,RhoA)的表達調控情況,為進一步厘清食管鱗癌的病機開拓思路,亦可為臨床診斷、治療、預后判斷找到更為安全有效的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

人食管鱗癌細胞系Eca109、TE-1、Kyse150購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。RPMI 1640培養基(Gibco);胎牛血清(四季青);無脂肪酸牛血清白蛋白(FAF-BSA,Sigma);RNA提取試劑盒SV Total RNA Isolation System(Promega);逆轉錄試劑盒(Perfect Real Time)、熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司);Lipofectamine 2000(Invitrogen公司);兔抗人RhoA多克隆抗體(Proteintech公司);RIPA、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學發光試劑盒(碧云天公司)。引物由上海生工生物工程有限公司合成,其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞生物信息學分析 從TCGA數據庫中下載食管癌數據集,提取CASC9表達信息,分析數據集中CASC9在ESCC癌組織、癌旁組織和正常組織中的表達差異。使用TCGA數據進行CASC9與RhoA進行相關性分析,相關性采用Pearson系數檢驗。

1.2.2 細胞培養 Eca109、TE-1、Kyse150細胞常規培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素G和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養液中,置于37 ℃、5% CO2培養箱孵育中飽和濕度培養。

1.2.3 RT-qPCR檢測si-CASC9的沉默效率及RhoA的mRNA表達水平 si-CASC9由上海吉瑪制藥技術有限公司合成,靶序列為:5′-GCCUGUGAUAGCAGAACAATT-3′。陰性對照(negative control,NC)序列為5′-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3′。取CASC9高表達細胞株接種于6孔板(2×105個/孔),次日細胞融合度達50%時,用LipofectamineTM2000作為轉染試劑,將NC和si-CASC9瞬時轉染Eca109和Kyse150細胞,培養48 h后提取總RNA。反轉錄后采用RT-qPCR檢測CASC9表達情況和RhoA的mRNA表達水平。見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.4 CCK8檢測細胞活性 取對數生長期細胞消化并計數,接種于96孔板(10 000個/孔),次日細胞融合度達50%時,NC和si-CASC9瞬時轉染Eca109和Kyse150細胞,每孔設置4個復孔,置于培養箱中培養,分別于轉染后0、24、48、72 h按10 μL/孔加入CCK-8溶液,輕敲混勻,培養箱培養 2 h 后在酶標儀中檢測 450 nm 波長下的吸光度。連續檢測4 d后,繪制細胞生長曲線。實驗重復3次。

1.2.5 細胞劃痕實驗 接種細胞前在12孔板背面標記兩條直線。將對數生長期的Kyse150細胞以2.5×105個/孔濃度接種入12孔板。24 h后用100 μL無菌槍頭垂直于兩條記號線劃痕,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)潤洗兩次,倒置顯微鏡拍照記錄0 h的劃痕寬度。隨后將NC和si-CASC9瞬時轉染Eca109和Kyse150細胞,分別于轉染后24 h、48 h再次拍攝劃痕愈合情況,Image J軟件分析劃痕愈合百分比。實驗重復3次,根據收集圖片數據分析實驗結果。

1.2.6 細胞侵襲實驗 將NC和si-CASC9瞬時轉染Eca109和Kyse150細胞,轉染48 h后消化收集洗滌細胞,含0.1%BSA的1640培養液調整細胞密度為 1×106個/mL ,以100 μL/孔接種于鋪膠后的Traswell上室,下室為完全培養基,培養箱培養24 h,固定后用結晶紫染色后計數拍照。實驗重復3次。

1.2.7 Western blot 將si-CASC9組及NC組Eca109細胞瞬時轉染72 h后收集細胞,提取總蛋白,取上清進行BCA總蛋白濃度測定。蛋白變性處理后SDS-PAGE電泳分離(每孔40 g等體積上樣),半干轉至PVDF膜(15 V,23 min),5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,一抗(1∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜,二抗(1∶1 000)室溫孵育60 min,ECL化學發光顯色,用Image J圖像分析軟件進行數據分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 RT-qPCR檢測3種食管鱗癌細胞株中CASC9的表達水平及si-CASC9的沉默效率

利用來自TCGA食管鱗癌數據集中CASC9表達量繪制箱型圖,結果顯示ESCA和ESCC組織中SAA1的表達高于正常組織。以2-△△Ct比較3種食管鱗癌細胞株中CASC9表達量,Kyse150表達量最高,TE-1中的表達量最低。3種細胞株間CASC9表達水平有統計學差異(P<0.05)。故選擇Kyse150和Eca109兩株細胞系進行后續實驗。瞬時轉染Kyse150和Eca109兩株細胞后,熒光定量PCR檢測NC組和si-CASC9組中CASC9的相對表達量。與NC組比較,si-CASC9組中CASC9表達量下降,兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 沉默CASC9對Eca109和Kyse150遷移能力的影響

Kyse150和Eca109細胞系si-CASC9組劃痕愈合百分比在24及48 h均小于NC組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 沉默CASC9對Eca109和Kyse150細胞體外增殖活力和侵襲能力的影響

si-CASC9組的Kyse150和Eca109細胞體外增殖活力低于NC組,差異有統計學意義(P<0.05)。si-CASC9組穿膜細胞數低于NC組,差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 沉默CASC9后RhoA的mRNA和蛋白的表達情況

來自TCGA食管鱗癌數據集相關性分析顯示CASC9與RhoA表達量呈負相關,差異有統計學意義(P<0.05)。RT-qPCR檢測顯示,與NC相比,si-CASC9 組中 RhoA mRNA及蛋白表達水平均上調,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

lncRNA占據人類基因組的90%,雖然不具有蛋白質編碼潛力,但可通過調節轉錄和表觀遺傳等過程,在個體生長發育、細胞增殖分化、腫瘤的發生發展等生理病理過程中均發揮重要的調控作用,是細胞功能的重要參與者[4],尤其是lncRNA與食管癌的相關研究頗受關注[5-8]。CASC9在肝癌、肺鱗癌、口腔鱗癌、胃癌、卵巢癌等不同腫瘤中均存在顯著過表達,并且參與調控多種腫瘤惡性生物學行為、癌癥復發、化療耐藥等過程[9-11]。Wu等[5]研究顯示,CASC9 在食管鱗癌組織中的表達水平是癌旁組織的355倍,且CASC9表達量與腫瘤大小、TNM分期正相關,干擾CASC9表達可抑制癌細胞的侵襲和轉移能力;Pan等[6]也提示,ESCC中CASC9的表達情況與腫瘤細胞分化程度相關,并通過下調CASC9的表達發現其可降低腫瘤細胞的轉移能力;Liang等[7]也證實了CACS9在食管鱗癌中促進了腫瘤細胞的轉移。

本研究顯示,在3種不同食管鱗癌細胞株中CASC9表達水平存在差異,分化程度最低的Kyse150表達水平遠高于另外兩種高分化細胞株,表明CASC9的高表達與ESCC的低分化有關。而一般認為腫瘤細胞的分化程度與其增殖和轉移能力呈負相關,而腫瘤轉移潛能與腫瘤細胞在體內或體外的遷移能力呈正相關。本研究通過合成特異性siRNA成功干擾CASC9在Eca109和Kyse150中的表達后發現,腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力受到明顯抑制,說明CASC9對腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲發揮重要的調控作用,可促進腫瘤細胞的惡性生物學行為,與Pan等[6]研究結果一致。Gramantieri等[10]在肝細胞癌的體外研究中同樣采用干擾CASC9表達的方法,但腫瘤細胞的增殖率并沒有出現明顯差異;同時,干擾CASC9的表達反而促進了腫瘤細胞的遷移。究其原因可能是由于非編碼RNA在不同的腫瘤和不同腫瘤亞型中表達情況不一致,調節模式亦存在不同。因此,CASC9在不同的腫瘤類型中發揮致癌或抑癌功能需要具體討論,而lncRNA的這種調節特點在同為非編碼RNA的microRNAs中已得到了廣泛的證實。

Rho GTPases家族在細胞的遷移中發揮重要作用,RhoA是Rho GTPases家族中研究較多的分子之一。近年研究[12-14]顯示,RhoA可能是一種抑癌基因。Lawson等[12]在小鼠乳腺癌模型的相關研究中發現RhoA基因敲減后增加了乳腺癌淋巴結和肺轉移,提示RhoA在乳腺癌中具有潛在的腫瘤轉移抑制能力;Alkasalias等[13]研究結果也發現敲除RhoA的成纖維細胞在體外失去了正常的抑制能力,在體內誘導腫瘤生長,在體外誘導腫瘤細胞遷移和增殖;Rodrigues等[14]指出RhoA失活導致腫瘤細胞遷移顯著增加,且R8hoA蛋白水平降低與腫瘤分化不良相關。本研究發現,CASC9沉默表達后,通過上調RhoA的表達顯著抑制Kyse150細胞的增殖和遷移能力,與上述研究[14]結果相似。CASC9的表達與食管鱗癌Eca109和Kyse150細胞的增殖、遷移和侵襲能力密切相關,且可能通過調節RhoA的表達來實現。

綜上,CASC9是一種重要的致癌因子,沉默CASC9在Eca109和Kyse150中的表達能明顯抑制腫瘤細胞的增殖和遷移和侵襲能力,可能與調節RhoA的表達相關。