濃縮沼液中添加芽孢桿菌對(duì)促生和抑菌功能的強(qiáng)化效應(yīng)

劉艷麗 趙娜娜 范貝貝,2 李乃薈 董泰麗 陳 清 慕康國*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院,北京 100193;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 有機(jī)循環(huán)研究院(蘇州),江蘇 蘇州 215000;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院,哈爾濱 150038;4.山東民和生物科技股份有限公司,山東 煙臺(tái) 264000)

隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)和沼氣工程的發(fā)展,沼液的排放量與日俱增,其利用途徑也成為環(huán)保及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域新的關(guān)注熱點(diǎn)。沼液含有大量的氮磷鉀等營養(yǎng)元素,以及氨基酸、腐植酸、維生素和生長激素等活性物質(zhì),可以作為良好的液體有機(jī)肥料,同時(shí)也具有抑病功能[1]。大量研究表明,長期施用沼液可以有效改善土壤肥力,促進(jìn)農(nóng)作物生長,增加作物產(chǎn)量[2-4]。對(duì)種子而言,外源施用沼液能提高種子養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)、酶活性以及新陳代謝能力,從而促進(jìn)種子的萌發(fā)和提高種子的成秧率[5]。此外,沼液中的活性物質(zhì)對(duì)一些病原菌具有抑制性作用,可以增強(qiáng)植物對(duì)于抵抗多種病原菌侵襲的能力,減少農(nóng)藥施用,提高資源利用效率[6-7]。但沼液水分含量高,直接施用肥效不高,而且運(yùn)輸成本高,商品化利用較困難,嚴(yán)重制約了沼液肥的推廣與應(yīng)用[8]。利用膜濃縮技術(shù)對(duì)沼液進(jìn)行濃縮,可以提高沼液的營養(yǎng)物質(zhì)含量,有助于提高沼液的肥料價(jià)值。然而采用膜濃縮技術(shù)成本較高,仍需要復(fù)配其他活性物質(zhì)增強(qiáng)沼液的功能,從而實(shí)現(xiàn)沼液肥的市場化推廣[9-11]。

土傳病害每年都會(huì)給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失,常見的毀滅性土傳病害主要有枯萎病、軟腐病、紋枯病和青枯病等。生物防治因其低成本、環(huán)境友好和無藥物殘留等特點(diǎn)已成為當(dāng)前國內(nèi)外防治植物土傳病害的研究熱點(diǎn)[12]。芽孢桿菌廣泛分布于自然界中,具有抗逆性強(qiáng)、耐高溫及生防效果好等優(yōu)點(diǎn),已成為理想的土傳病害生防菌資源[13]。同時(shí),芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物可以有效提高土壤肥力、改善土壤環(huán)境、提升作物品質(zhì)以及增強(qiáng)植株抗病能力[14]。大量研究表明,芽孢桿菌通過定殖至植物根際、體表或體內(nèi),與病原菌競爭植物周圍的營養(yǎng),分泌抗菌物質(zhì)以抑制病原菌生長,同時(shí)誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)抵御病原菌入侵,從而達(dá)到生防的目的[15]。

具有多種功能的復(fù)合肥料已成為國內(nèi)外新型肥料的主要研究內(nèi)容之一。芽孢桿菌等微生物與沼液復(fù)配,兼具了有機(jī)肥和微生物肥料的優(yōu)點(diǎn),不僅含有大量有機(jī)質(zhì)和營養(yǎng)養(yǎng)分,還含有大量生防微生物及其代謝產(chǎn)物,可以有效提高土壤肥力,恢復(fù)土壤微生態(tài)平衡,提升作物品質(zhì),增強(qiáng)植株抗病能力[16]。孫天姿等[17]將巨大芽孢桿菌添加到餐廚沼液中所制備的液態(tài)菌肥顯著提高了冬小麥和水稻土壤中有效氮磷的含量。也有研究表明,施用沼液微生物菌肥可顯著提高設(shè)施蔬菜的生物量和品質(zhì)[18]。芽孢桿菌與沼液聯(lián)用不僅避免了沼液排放帶來的環(huán)境問題,還實(shí)現(xiàn)了沼液的增值化利用,具有較高的環(huán)保效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

沼液肥中芽孢桿菌的活菌數(shù)是發(fā)揮肥效至關(guān)重要的一點(diǎn),通常沼液的EC較高且pH為堿性,對(duì)芽孢桿菌的活性有一定影響[19]。因此,針對(duì)現(xiàn)有問題,本研究通過在濃縮沼液中添加甘油等保護(hù)劑來探究芽孢桿菌在濃縮沼液中的存活情況以及兩者復(fù)配后的促生抑病效果。本研究在前期試驗(yàn)中采用Salkowski比色法測定了8種芽孢桿菌生產(chǎn)生長素(IAA)的能力,其類別分別為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、側(cè)孢芽孢桿菌(B.laterosporus)、巨大芽孢桿菌(B.megatherium)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis),最終選擇IAA產(chǎn)量較高的解淀粉芽孢桿菌B3和濃縮沼液進(jìn)行復(fù)配。促生功能的探究需要大量的發(fā)芽試驗(yàn)、盆栽試驗(yàn)以及田間試驗(yàn)來驗(yàn)證。種子發(fā)芽是植物生長中最基礎(chǔ)和最重要的一步,可以有效體現(xiàn)作物的出苗質(zhì)量,而且種子整個(gè)發(fā)芽周期很短,方便大批量進(jìn)行。小麥、黃瓜和白菜在我國種植范圍廣泛,是我國重要的糧食作物和蔬菜作物[20]。皿內(nèi)抑菌試驗(yàn)可以快速驗(yàn)證肥料對(duì)于不同土傳病原菌的抑菌效果。本研究采用芽孢桿菌與沼液復(fù)配制備沼液菌肥,通過研究配制的芽孢桿菌沼液肥對(duì)小麥、白菜和黃瓜種子發(fā)芽的增強(qiáng)效果,同時(shí)探究芽孢桿菌沼液肥對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(F.oxysporumf.sp.Cucumerinum)、尖孢鐮刀菌番茄專化型(F.oxysporumf.sp.lycopersici)和茄鐮孢菌(Fusariumsolani)的抑菌效果,驗(yàn)證所配制的芽孢桿菌沼液肥的促生和抑菌效果,為沼液增值化利用和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試芽孢桿菌:解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)為水溶性工程菌粉,活菌數(shù)≥1011CFU/g。供試廠家為湖北中向生物工程有限公司。

供試濃縮沼液:雞糞濃縮沼液。將雞糞沼液進(jìn)行預(yù)處理以去除其中的大量懸浮物,然后采用孔徑為1～100 nm的無機(jī)陶瓷超濾膜進(jìn)行過濾,去除沼液中多余的水分和雜質(zhì),得到濃縮雞糞沼液。沼液外觀顏色為棕褐色或棕黑色液,pH為9.20,EC值為32.00 mS/cm,有機(jī)質(zhì)質(zhì)量濃度為4.5 g/L,腐植酸質(zhì)量濃度1.9 g/L,總氮質(zhì)量濃度5 g/L,總磷質(zhì)量濃度2.4 g/L,總鉀質(zhì)量濃度5.6 g/L,鈣質(zhì)量濃度為864 mg/L,鐵質(zhì)量濃度為104 mg/L,鎂質(zhì)量濃度為25 mg/L,錳質(zhì)量濃度為16 mg/L,鋅質(zhì)量濃度為16 mg/L,銅質(zhì)量濃度為11 mg/L。

供試種子:小麥種子(品種為‘輪選987’)、白菜種子(品種為‘綠如意’)和黃瓜種子(品種為‘津研4號(hào)’)購買于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

供試病原菌:尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄專化型和茄鐮孢菌,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供,在PDA培養(yǎng)基活化后備用。

供試培養(yǎng)基:LB(營養(yǎng)肉湯)培養(yǎng)基,配料為每升LB培養(yǎng)基含有NaCl 10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、瓊脂20.0 g,pH為7.0～7.2,121 ℃高壓滅菌30 min后備用。

1.2 含芽孢桿菌沼液肥的配制及存放過程中活菌數(shù)的測定

將復(fù)配的增效物質(zhì)以及甘油等作為保護(hù)劑添加到濃縮沼液中,在溫度為60 ℃、轉(zhuǎn)速為60 r/min磁力攪拌器上加熱攪拌60 min,然后按照50 g/L加入解淀粉芽孢桿菌。混合均勻后分別將其分裝在滅菌后的離心管中,25 ℃室溫條件下避光保存。分別在存放第0、7、30、45和90天取樣測定活菌數(shù),每次取3管,采用稀釋涂布平板法測定活菌數(shù)。將濃縮沼液與芽孢桿菌的混合液按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7濃度梯度進(jìn)行稀釋。用無菌槍頭吸取100 μL液體涂布于LB培養(yǎng)基平板中,不同梯度各涂3個(gè)平板,涂布均勻,將平板放入26 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2～3 d后,計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)選擇菌落數(shù)在30～300 CFU/g的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以無菌水作為空白對(duì)照,BS為原濃縮沼液,BSF為沼液肥(添加甘油等保護(hù)劑的濃縮沼液),B3為芽孢桿菌菌液(每50 g解淀粉芽孢桿菌菌粉配制1 L菌液),FA為配制的芽孢桿菌沼液肥,FB為存放30 d的芽孢桿菌沼液肥。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 不同試驗(yàn)處理的稀釋倍數(shù)Table 1 Dilution ratio of different test treatments

1.4 含芽孢桿菌沼液肥的皿內(nèi)發(fā)芽試驗(yàn)

試驗(yàn)于2021年2～3月在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)進(jìn)行。挑選籽粒飽滿且大小基本一致的種子,在1%的NaClO溶液中浸泡消毒10 min,期間不斷攪拌;用去離子水沖洗3次后,風(fēng)干至初始含水量。在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中放入一層無菌定性濾紙,分別加入不同稀釋倍數(shù)的10 mL處理液,然后均勻放置20粒種子,加皿蓋保濕,置于溫度為25 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng),每個(gè)處理9次重復(fù)。測定根長、芽長、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢(shì)和活力指數(shù)[21]。根長和芽長用精度為1 mm米尺直接測量。

根據(jù)農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程,以胚根長超過種子長度的1/2計(jì)為發(fā)芽,每天記錄種子的萌發(fā)數(shù)。試驗(yàn)結(jié)束標(biāo)準(zhǔn)為:連續(xù)2 d發(fā)芽數(shù)不發(fā)生變化。

發(fā)芽勢(shì)(率)=供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(1)

式中:發(fā)芽勢(shì)在第2天統(tǒng)計(jì),%;發(fā)芽率在第5天統(tǒng)計(jì),%。

發(fā)芽指數(shù)(GI)=ΣGt/Dt

(2)

式中:Gt為第t日的種子萌發(fā)數(shù),粒;Dt為相應(yīng)的種子萌發(fā)天數(shù),d。

活力指數(shù)(VI)= GI×S

(3)

式中:GI為發(fā)芽指數(shù);S為平均根長,mm。

1.5 含芽孢桿菌沼液肥的平板抑菌試驗(yàn)

吸取100 μL稀釋不同倍數(shù)的處理液,均勻涂布到PDA培養(yǎng)基表面,每個(gè)處理9次重復(fù)。然后用打孔器從培養(yǎng)好的病原菌菌株中取直徑為5 mm的菌餅,倒扣于平板的中央,每個(gè)培養(yǎng)皿中放1個(gè)菌餅,將接種病原菌的平板放于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3～10 d(視菌落生長情況而定)。用十字交叉法測量菌落直徑,并計(jì)算菌絲生長的抑菌率(Antifungal index,AI)[22]。公式如下:

(4)

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用Origin 2021軟件作圖,采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 含芽孢桿菌沼液肥存放過程中活菌數(shù)的變化

通過稀釋涂布平板法測定芽孢桿菌沼液肥隨存放時(shí)間活菌數(shù)的變化(圖1),沼液肥中芽孢桿菌的數(shù)量隨存放時(shí)間的增加而減少。其中,存放時(shí)間為0～30 d減少趨勢(shì)最明顯,在第30天時(shí),芽孢桿菌沼液肥中活菌數(shù)為3×109CFU/mL,存活率為48.4%;存放時(shí)間為30～90 d時(shí)活菌數(shù)基本保持穩(wěn)定,無顯著差異。存放90 d時(shí)芽孢桿菌活菌數(shù)的數(shù)量為2.8×109CFU/mL,滿足中華人民共和國農(nóng)業(yè)部NY/T 798—2015《復(fù)合微生物肥料執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》[22]中對(duì)于復(fù)合微生物肥料中活菌數(shù)量的規(guī)定(5×107CFU/mL)。

圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Small letters in the figure indicate significant differences (P<0.05).

2.2 芽孢桿菌沼液肥對(duì)種子發(fā)芽的影響

2.2.1對(duì)黃瓜種子發(fā)芽的影響

通過發(fā)芽試驗(yàn)測定了芽孢桿菌沼液肥等物質(zhì)對(duì)黃瓜種子發(fā)芽的影響,如圖2(a)～(e)所示。與對(duì)照相比,稀釋250和500倍的含芽孢桿菌沼液肥處理(FA和FB)降低了黃瓜種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù),對(duì)黃瓜種子的萌發(fā)具有抑制作用。但稀釋1 000倍的含芽孢桿菌沼液肥處理提高了黃瓜種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)。其中,稀釋1 000倍的FA和FB處理的黃瓜種子發(fā)芽勢(shì)分別為87.8%和87.2%,比對(duì)照分別提高15.3%和14.6%。稀釋1 000倍的FB顯著促進(jìn)了黃瓜種子的發(fā)芽率(圖2(b))。

圖中小寫字母表示同一濃度的不同處理之間差異顯著(P<0.05)。圖中序號(hào)代表的具體處理詳見表2。下同。Small letters in the figure indicate significant differences among different treatments at the same concentration (P<0.05).See Table 2 for specific treatments represented by serial numbers in the figure.The same below.

所有處理均不同程度增加了黃瓜種子的芽長、根長和活力指數(shù)(圖2(c)、(d)和(f)),稀釋1 000倍的含芽孢桿菌沼液肥對(duì)黃瓜種子的芽長和根長的促進(jìn)作用顯著高于稀釋1 000倍的沼液肥和芽孢桿菌菌液處理。與對(duì)照相比,稀釋1 000倍的FA和FB能顯著增加黃瓜種子的芽長和根長,芽長分別為48.9和47.0 mm,分別增加了56.3%和50.1%;根長分別為52.7和53.0 mm,分別增加了72.3%和73.3%。與BSF的1 000倍稀釋液處理相比,FA和FB的1 000倍稀釋液處理使根長分別增加了2.1%和12.8%,與芽孢桿菌菌液的1 000倍稀釋液相比,根長分別增加了18.8%和18.2%。

2.2.2對(duì)小麥種子發(fā)芽的影響

芽孢桿菌沼液肥等物質(zhì)對(duì)于小麥種子發(fā)芽的影響如圖3所示。芽孢桿菌沼液肥(FA和FB)的250和500倍稀釋液處理的小麥種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)顯著低于其他處理,但FA和FB的1 000倍稀釋液處理顯著提高了小麥種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)。FA和FB的1 000倍稀釋液的發(fā)芽勢(shì)分別為87.2%和86.4%,與對(duì)照相比,分別提高22.7%和21.6%(圖3(a)和(e))。FA和FB處理對(duì)小麥種子的發(fā)芽率沒有顯著影響(圖3(b))。所有處理對(duì)小麥種子的芽長、根長和活力指數(shù)均有不同程度的促進(jìn)作用。芽孢桿菌沼液肥(FA和FB)對(duì)小麥種子的根部促進(jìn)作用較明顯,1 000倍稀釋液處理的小麥種子根長分別可達(dá)118.9和117.1 mm,與對(duì)照相比,分別提高47.5%和45.2%;與沼液肥的1 000倍稀釋液相比,根長分別提高了7.1%和5.4%;與芽孢桿菌菌液的1 000倍稀釋液相比,分別提高了27.3%和25.3%(圖3(c)、(d)和(f))。

圖3 不同處理肥料對(duì)小麥種子發(fā)芽勢(shì)(a)、發(fā)芽率(b)、芽長(c)、根長(d)、發(fā)芽指數(shù)(e)和活力指數(shù)(f)的影響Fig.3 Effects of different fertilizer treatments on germination potential (a),germination rate (b),bud length (c),root length (d),germination index (e) and vigor index (f) of wheat seeds

2.2.3對(duì)白菜種子發(fā)芽的影響

芽孢桿菌沼液肥等物質(zhì)對(duì)白菜種子發(fā)芽的影響見圖4。芽孢桿菌沼液肥(FA和FB)的250和500倍稀釋液處理顯著降低了白菜種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)。但FA和FB的1 000倍稀釋液處理提高了白菜種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù),與對(duì)照相比,分別提高14.3%和13.7%(圖4(a)和(e))。所有處理均顯著提高了白菜種子的活力指數(shù)(圖4(f))。FA和FB的1 000倍稀釋液處理的白菜種子的根長分別可達(dá)78.3和78.9 mm,與對(duì)照相比,分別提高50.6%和51.7%。此外,與沼液肥1 000倍稀釋液相比,FA和FB的1 000倍稀釋液處理使根長分別提高了6.2%和7.1%;與芽孢桿菌菌液的1 000倍稀釋液相比,根長分別提高了50.6%和51.7%(圖4(b)和(c))。

圖4 不同處理肥料對(duì)白菜種子發(fā)芽勢(shì)(a)、發(fā)芽率(b)、芽長(c)、根長(d)、發(fā)芽指數(shù)(e)和活力指數(shù)(f)的影響Fig.4 Effects of different fertilizer treatments on germination potential (a),germination rate (b),bud length (c),root length (d),germination index (e) and vitality index (f) of Chinese cabbage seeds

2.3 含芽孢桿菌沼液肥的平板抑菌效果

在本研究中,隨著稀釋倍數(shù)的增加,所有處理的病原菌的菌落直徑增加(圖5和6)。與無菌水處理相比,稀釋1 000、5 000和10 000倍的原濃縮沼液、沼液肥、芽孢桿菌溶液、含芽孢桿菌沼液肥(現(xiàn)配現(xiàn)用)和含芽孢桿菌沼液肥(存放30 d)對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄專化型和茄鐮孢菌均表現(xiàn)出顯著的抑制效果。與沼液肥相比,含芽孢桿菌的沼液肥對(duì)病原菌具有顯著的抑制作用。原濃縮沼液的1 000倍稀釋液對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄專化型和茄鐮孢菌的抑菌率分別為62.1%、63.5%和62.1%,10 000倍稀釋液對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄專化型和茄鐮孢菌困的抑菌率分別為47.7%、47.7%和49.2%。芽孢桿菌菌液(B3)和芽孢桿菌沼液肥(FA和FB)的1 000倍稀釋液對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜專化型的抑菌率分別為87.5%、87.9%和83.2%,對(duì)尖孢鐮刀菌番茄專化型的抑菌率分別為71.3%、75.8%和72.6%,對(duì)茄鐮孢菌的抑菌率分別為87.5%、88.8%和86.5%。稀釋10 000倍的B3、FA和FB對(duì)3種病原菌依舊有很高的抑菌率,對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜專化型的抑菌率分別為65.3%、68.5%和65.3%,對(duì)尖孢鐮刀菌番茄專化型的抑菌率分別為71.3%、75.8%和72.6%,對(duì)茄鐮孢菌的抑菌率分別為78.0%、84.5%和79.5%。隨著稀釋倍數(shù)的增加,芽孢桿菌沼液肥對(duì)病原菌生長抑制效果減弱,其原因可能是稀釋后有益微生物數(shù)量減少,對(duì)病原菌的競爭作用減弱。

圖5 不同處理肥料對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(a)、尖孢鐮刀菌番茄專化型(b)和茄鐮孢菌(c)生長的影響Fig.5 Effects of different fertilizers on the growth of F. oxysporum f.sp.Cucumerinum (a)、F. oxysporum f. sp. lycopersici (b) and F. solani (c)

圖6 不同處理肥料對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(a)、尖孢鐮刀菌番茄專化型(b)和茄鐮孢菌(c)生長的抑制效果Fig.6 Inhibitory effect of different fertilizers on the growth of F. oxysporum f.sp.Cucumerinum (a)、F.oxysporum f. sp.lycopersici (b) and F. solani (c)

此外,含芽孢桿菌的沼液肥存放1個(gè)月后活菌數(shù)減少,與現(xiàn)配現(xiàn)用的含芽孢桿菌沼液肥相比對(duì)病原菌的生長抑制作用降低,但依舊具有較高的抑菌率。存放1個(gè)月的含芽孢桿菌的沼液肥對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄專化型和茄鐮孢菌的抑菌率與現(xiàn)配現(xiàn)用的沼液肥相比分別僅下降4.8%、4.2%和6.0%。因此添加芽孢桿菌可以顯著提高沼液肥的抑菌效果。

3 討 論

沼液中含有的赤霉素和有機(jī)酸等活性物質(zhì)可以促進(jìn)種子的發(fā)芽[23],以肥料形式施入土壤后,能促進(jìn)植物的生長。王遠(yuǎn)遠(yuǎn)等[24]發(fā)現(xiàn)施用沼液能增加小白菜的葉寬和葉片數(shù),產(chǎn)量增加97.74%,Yu等[25]發(fā)現(xiàn)沼液澆灌果樹可以促進(jìn)葉子生長提高果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量,這與本試驗(yàn)中1 000倍稀釋液芽孢桿菌沼液肥的促生結(jié)果相符合。本研究通過種子發(fā)芽試驗(yàn)快速驗(yàn)證了含芽孢桿菌沼液肥的促生效果,發(fā)現(xiàn)稀釋250和500倍的芽孢桿菌沼液肥對(duì)黃瓜、小麥和白菜種子的萌發(fā)和生長具有抑制效果,而稀釋1 000倍的含芽孢桿菌沼液肥則具有協(xié)同增效作用,可以顯著促進(jìn)種子的萌發(fā)和生長。沼液濃度過高可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的重要原因,沼液中銨態(tài)氮過量會(huì)對(duì)作物造成銨毒害,抑制作物的生長[26]。此外,芽孢桿菌的產(chǎn)IAA能力是衡量其促生功能的重要指標(biāo),本研究采用的枯草芽孢桿菌的產(chǎn)IAA能力通過Salkowski比色法測定為38.8 mg/L,因此添加了芽孢桿菌的濃縮沼液對(duì)種子的促生效果顯著提升。含芽孢桿菌沼液肥存放30 d后活菌數(shù)減少,但在本研究中,其對(duì)種子萌發(fā)和生長與現(xiàn)配現(xiàn)用的含芽孢桿菌沼液肥沒有顯著差異。

沼液中所包含的有機(jī)酸成分,植物激素中的赤霉素、乙酸和維生素B12等對(duì)病原菌有顯著的抑制效應(yīng)。關(guān)于沼液抑菌的相關(guān)研究表明,沼液可以顯著抑制植物病原菌的孢子在體內(nèi)萌發(fā)、菌絲在體外的生長以及分生孢子的形成等[27]。馮自立等[28]研究發(fā)現(xiàn),采用濃縮沼液對(duì)棉花進(jìn)行灌根處理,可以誘導(dǎo)棉花葉片活性氧爆發(fā),增強(qiáng)過氧化物酶、幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶、杜松烯合酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶基因的表達(dá),從而抑制棉花黃萎病菌在植物體內(nèi)的存活和擴(kuò)展。本研究中,單獨(dú)施用稀釋后的濃縮沼液,對(duì)病原菌的抑菌率為50.0%～65.0%,抑菌率隨著沼液稀釋倍數(shù)的增加而降低。此外,相關(guān)研究也表明沼液中的銨和腐植酸可能是其主要的抑菌因子[7]。腐植酸有利于土壤中有益微生物的生長繁殖,對(duì)病原微生物有抑制作用,從而降低作物土傳病害的發(fā)生[29];含氮量高的有機(jī)物料施入土壤后,因氨化作用會(huì)使土壤pH暫時(shí)性升高,導(dǎo)致土壤中NH3的濃度快速升高,因此可以有效殺滅病原菌[30]。

芽孢桿菌是一種具有廣泛抑菌作用的生防菌。Gowtham等[31]研究發(fā)現(xiàn),解淀粉芽孢桿菌顯著增強(qiáng)了辣椒植株對(duì)炭疽病的防御作用,并且有效促進(jìn)了辣椒生長。Cao等[32]研究表明,芽孢桿菌所產(chǎn)生的伊枯草菌素(Iturin)能夠有效抑制尖孢鐮刀菌的生長。張德珍等[33]發(fā)現(xiàn)淀粉芽孢桿菌JF-1對(duì)多種植物病原真菌產(chǎn)生明顯的抑菌作用,能有效降低苗期黃瓜枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)。郭珺等[34]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌Pb-4菌株對(duì)番茄枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、青椒枯萎病菌、辣椒疫霉病菌和蘋果腐爛病菌均有抑制作用,其抑菌活性具有廣譜性。本研究中所采用的解淀粉芽孢桿菌的1 000倍稀釋液對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄轉(zhuǎn)化型和茄鐮孢菌的抑制作用均在80.0%以上,具有較高的抑菌率,與前人的研究結(jié)果相一致。

本研究將濃縮沼液與芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)配后,對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄專化型和茄鐮孢菌的抑制效果均高于單獨(dú)施用芽孢桿菌菌液或濃縮沼液,顯著提高了對(duì)病原菌的抑菌率。含芽孢桿菌沼液肥的10 000倍稀釋液仍具有很高的抑菌作用,對(duì)3種病原菌的抑菌率均高于80.0%。隨著稀釋倍數(shù)的增大,對(duì)3種病原菌的抑菌率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。但由于菌液稀釋后仍含有大量的芽孢桿菌,對(duì)病原菌依舊具有60.0%以上的抑菌率。此外,本研究僅采用種子發(fā)芽試驗(yàn)和皿內(nèi)抑菌試驗(yàn)探究了芽孢桿菌沼液肥的促生抑病功能,還需在大田環(huán)境下對(duì)其作用效果、用量和作用機(jī)理進(jìn)行深入探究和論證。

4 結(jié) 論

本研究將芽孢桿菌添加到濃縮沼液中,明確了芽孢桿菌活菌數(shù)隨著存放時(shí)間的增加而減少,存放90 d后活菌數(shù)仍滿足國家對(duì)于復(fù)合微生物肥料中活菌數(shù)量的規(guī)定(5×107CFU/mL)。與對(duì)照或單獨(dú)施用沼液相比,含芽孢桿菌沼液肥的1 000倍稀釋液能不同程度的提高種子的6項(xiàng)發(fā)芽特征指標(biāo),顯著促進(jìn)了黃瓜、小麥和白菜種子的萌發(fā)和生長;含芽孢桿菌沼液肥可顯著提高對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄專化型和茄鐮孢菌的抑制作用。存放30 d的芽孢桿菌沼液肥的10 000倍稀釋液對(duì)本試驗(yàn)中的3種病原菌的抑菌率仍在65.0%以上。因此,芽孢桿菌和濃縮沼液復(fù)配后對(duì)種子萌發(fā)的促進(jìn)和對(duì)病原菌的抑制具有協(xié)同增效作用。