植物表皮蠟質合成、運輸及調控機制研究進展

李 莉 趙米賢 王建華 劉三震 王國英 SCHNABLE S.Patrick

(1.中國農業大學 農學院/種子科學與技術研究中心/北京市作物遺傳育種重點實驗室,北京 100193;2.美國堪薩斯州立大學 植物病理學院,美國 曼哈頓 66506;3.中國農業科學院 作物科學研究所,北京 100193;4.美國愛荷華州立大學 農學院,美國 埃姆斯 50011)

植物表皮角質層是所有陸生植物與空氣接觸部位的一層疏水性屏障,可以控制水在表皮細胞外的細胞壁與大氣之間的流動[1]。角質層由表皮細胞產生的角質和表皮蠟質所組成[2]。植物表皮蠟質呈灰白色、霜狀,能有效減少非氣孔性失水效率,從而提高植株的耐旱性,其突變體表現為表皮蠟質缺失,噴水后,葉片表面容易掛水珠,同等種植條件下表皮蠟質覆蓋較多的材料與蠟質缺失突變體相比,非氣孔性失水較少,耐旱性較強[3];植物表皮的角質是由ω端中鏈羥基、C16和C18脂肪酸和甘油組成的核心聚合物。植物角質層蠟質又可分為內表皮和外表皮蠟質,內表皮蠟質通常在角質層形成過程中填充在其致密的網狀結構內,而外表皮蠟質堆積在角質層最外層并且組裝成各種形態(桿、柱、管、絲、片和顆粒狀等)的蠟質晶體[2-3]。表皮蠟質是由超長鏈脂肪酸及其衍生物、三萜類化合物和一些次生代謝產物(例如,甾醇和類黃酮)共同組成的復雜混合物[4]。大多數蠟質組分為醛、烷烴、次級醇和酮,是在烷烴形成途徑中合成的;少數由酰基還原途徑形成,擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)中酰基還原途徑產生的蠟質占總蠟質質量的10%～15%[5]。蠟質的成分和含量可以根據物種、個體發育和環境的變化而變化[6]。表皮蠟質除了在控制水分散失方面發揮著重要作用,還具有提高耐旱性、減弱紫外光傷害、維持植物表面清潔、抵抗細菌和真菌病原體傷害等功能[7-8],已有研究表明蠟質在植物抵御昆蟲的相互作用中也扮演著重要角色[9]。

玉米苗期耐旱能力較好,其葉片表面角質層蠟質較豐富。而通常隨著幼苗的發育,葉片表皮毛細胞逐漸伸長,毛狀體的表皮毛細胞逐漸在植物發育成熟后,對葉片水分保持起到重要的作用[10]。而玉米植株從蠟質依賴型的幼苗期向成株期轉換過程中,Glossy15起到了重要的作用[11]。除此之外,大量研究報道植物表皮蠟質不僅具有保水防止植株體內水分散失的功能,表皮蠟質作為一種重要的脂溶性次生代謝產物,對玉米苗期抵御病蟲害、低溫脅迫及紫外線防護方面有著重要的作用[7]。因此,研究植物表皮蠟質對植物抵御逆境為害具有重要的意義。

植物表皮蠟質的合成與運輸過程十分復雜,參與這一過程的基因也有很多[5,12]。目前,對具體基因在細胞學、分子生物學以及生理生化水平的綜合分析鮮見報道。本研究通過整理1974—2022年玉米及擬南芥中蠟質合成和運輸的相關文獻,綜合分析了植物表皮蠟質生物合成和運輸的過程及調控機制,旨在闡明植物蠟質合成、轉運的分子機制及調控網絡,以期為作物抗旱育種提供參考。

1 文獻來源

依據PubMed,Web of Science和中國知網數據庫,以“表皮蠟質”(“Epicuticular wax”)及“植物”(“Plant”)為關鍵詞檢索到1974—2022年中、英文相關文文獻報道125篇。

2 植物蠟質合成途徑與機制

基于目前對擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、玉米(ZeamaysL.)、水稻(OryzasativaL.)蠟質合成的研究(表1、表2和表3),蠟質合成的基本途徑主要分為3步:脂肪酸的從頭合成、超長鏈脂肪酸的合成以及蠟質各組分的合成。蠟質成分的合成又分為脫羧和酰基還原2個途徑,其中脫羧途徑又被稱為烷烴合成途徑,而酰基合成途徑又被稱為醇合成途徑。脫羧途徑主要合成醛、烷烴、次級醇和酮等;酰基還原途徑主要合成初級醇和蠟酯。

表1 擬南芥基因組中參與蠟質合成、運輸及調控的相關基因Table 1 Genes related to wax synthesis,transport and regulation in Arabidopsis thaliana genome

表2 玉米基因組中參與蠟質合成運輸及調控的相關基因Table 2 Genes related to wax synthesis,transport and regulation in maize genome

表3 水稻基因組中與蠟質合成運輸及調控的相關基因Table 3 Genes related to wax synthesis,transport and regulation in rice genome

2.1 脂肪酸的從頭合成

脂肪酸的從頭合成主要分為兩步:第一步是將脂肪酸的合成原料—乙酰輔酶A從線粒體基質轉運到細胞質中。在線粒體基質中的乙酰輔酶A和草酰乙酸結合生成檸檬酸,檸檬酸通過線粒體內膜上的載體進入細胞質中,在檸檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)的作用下,分解成乙酰輔酶A和草酰乙酸,草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶和蘋果酸酶的作用下,通過線粒體內膜上的載體回到線粒體基質,進而實現了乙酰輔酶A從線粒體基質向細胞質的轉運[99]。第二步是乙酰輔酶A在脂肪酸合成酶復合物(fatty acid synthase complex,FAS)的催化下,生成C16或C18脂肪酸,見圖1。乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶的作用下,生成丙二酸單酰輔酶A,再經過由β-酮酯酰-ACP合酶催化的縮合反應,由β-酮酯酰-ACP還原酶催化的還原反應,由β-羥酯酰-ACP脫水酶催化的脫水反應,由烯酯酰-ACP還原酶催化的還原反應,最終生成產物丁酰-ACP,由此完成一次循環,脂肪酸鏈增加了2個C原子。經過7或8個循環生成C16、C18酰基-ACP,再由酰基-ACP硫酯酶(fatty acy1-ACP thioesterases,FAT)催化形成C16、C18脂肪酸[13,99-100]。具有FAT活性的基因有FATA和FATB,FATA對18:1-ACP的底物活性較高,對飽和酰基-ACP底物的活性較低,而FATB對飽和的酰基-ACP底物活性高[99]。FATB是飽和脂肪酸合成的關鍵酶,而飽和脂肪酸對于植物表皮蠟質主要成分中超長鏈飽和脂肪酸的衍生物(烴、醛、酮、伯醇、仲醇、酯等)、萜類等的蠟質生物合成、以及調節植物生長和種子發育都具有重要作用[99-100,13-14]。

NADH+H+,還原性輔酶I;NAD+,輔酶I;ATP,三磷酸腺苷;ADP+Pi,二磷酸腺苷+游離磷酸基團;ACP,酰基載體蛋白;FatA/FatB脂肪酸ACP硫酯酶,酰基-ACP硫酯酶。NADH+H+,reduced coenzyme I;NAD+,coenzyme I;ATP,adenosine triphosphate;ADP+Pi,adenosine diphosphate+phosphate radical;ACP,acyl carrier protein;FatA/FatB,fatty acy1-ACP thioesterases A or fatty acy1-ACP thioesterases B.

2.2 超長鏈脂肪酸(VLCFAs)合成

C16、C18脂肪酸在長鏈酰基輔酶A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase,LACS)的催化下形成相應的酰基輔酶A,再轉移到內質網上,見圖2。Lv等[15]研究發現,擬南芥突變體lacs1/cer8的莖和葉表皮的蠟質總量減少,C29烷烴的含量明顯減少,C26—C30自由脂肪酸含量增加,同時發現突變體C16角質單體含量下降,C18角質單體含量增加,這說明,LACS1/CER8基因不僅與植物表皮蠟質合成有關,在角質的合成中也發揮作用。Weng等[16]發現,擬南芥突變體lacs2的角質含量顯著降低但蠟質含量無顯著變化,而在lacs1/lacs2雙突變體中烷烴、次級醇、酮等含量顯著減少,這表明了LACS2具有增強LACS1蠟質合成的功能。擬南芥LACS3也參與植物表皮蠟質的生物合成,LACS3在體內具有很高的酰基CoA合成酶活性,且在酵母中表達時能夠增加長鏈脂肪酸的含量[17]。LACS4與LACS1在蠟質合成中具有累加效應,其雙突變體中蠟質組分醛、烷烴等含量顯著低于單突變體中的含量[18]。

KCS,β/3-酮脂酰-CoA合成酶;KCR,β/3-酮脂酰-CoA還原酶;HCD,β/3-酮脂酰-CoA脫水酶;ECR,反式-2-烯酯酰-CoA還原酶;Ald,醛類;alc,醇類;1°alc,伯醇;2°alc,仲醇;alk,烷烴;ket,酮類;FAE,脂肪酸延伸酶復合體。KCS,β/3-Ketoacyl-CoA synthase;KCR,β/3-ketoacyl-CoA reductases;HCD,β/3-hydroxyacyl-CoA dehydratases;ECR,trans-2-enoyl-CoA reductases;Ald,aldehydes;alc,alcohol;1°alc,primary alcohol;2°alc,secondary alcohol;alk,alkene;ket,ketone;FAE,fatty acid extension enzyme complex.

C16、C18脂肪酸輔酶A形成的超長鏈脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFAs)是蠟質合成的直接前體物質。VLCFAs是在植物表皮細胞的內質網中由脂肪酸延伸酶(multienzyme fatty acid elongase,FAE)復合體催化形成。FAE復合體主要包含4種酶,分別為β-酮脂酰輔酶A合成酶(β-ketoacyl-CoA synthase,KCS)、β-酮酰基輔酶A還原酶(β-ketoacyl-CoA reductase,KCR)、β-羥酰基輔酶A水解酶(β-hydroxyacyl-CoA dehydratase,HCD)和烯酰輔酶A還原酶(enoyl-CoA reductase,ECR),在這4種酶的催化下,經過多個循環反應,C16或C18脂肪酸被延伸成為具有足夠碳鏈長度(20～34個C)的VLCFAs[101-103]。其中,KCS具有嚴格的底物特異性,它的類型決定了循環反應的速度和最終得到的酰基輔酶A產物的長度。除此之外,脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase,FAD)是多不飽和脂肪酸合成途徑中的關鍵酶,它控制著多不飽和脂肪酸的不飽和程度,其脫氫作用也能直接影響到植物表皮脂肪酸的合成和蠟質積累[54]。

Costaglioli等[104]通過轉錄組分析在擬南芥基因中鑒定出21個KCS基因,且已有8個KCS基因被證明可編碼能夠催化 VLCFA 形成的蛋白[19,104]。有研究表明,KCS1基因突變導致擬南芥葉片表皮蠟質C26～C30醇和醛含量顯著減少,但C29烷烴和C29酮含量無顯著變化[19]。KCS2/DAISY和KCS20的序列高度相似,主要參與脂肪酸的鏈長從C20延長至C22的過程,在缺水或滲透脅迫條件下,KCS2/DAISY的表達要高于KCS20[21]。KCS5/CER60可以利用C22作為底物,將脂肪酸鏈延長至C28[101]。KCS6/CER6編碼超長鏈脂肪酸縮合酶,是負責將VLCFA延伸至C34的關鍵酶,從而導致植株莖表皮蠟質含量極顯著減少,在相對濕度較低的條件下還表現出部分雄性不育[22-23,105]。已有報道在擬南芥中KCS5和KCS6表現為功能冗余[24-25]。此外,玉米的Glossy4和擬南芥的CUT1基因編碼蛋白同源,編碼1種縮合酶,參與VLCFA的延伸[106]。擬南芥KCS9參與C22至C24脂肪酸的延伸,這些脂肪酸是角質層蠟質生物合成的重要前體[26-27]。Hegebarth等[28]研究發現,KCS10/FDH基因編碼與KCS有關的蛋白質,該蛋白質可能與長鏈脂質分子的合成有關,表明KCS10/FDH可能參與蠟質和角質層的形成。擬南芥KCS16主要參與C34—C36(C38)的延長,其突變會造成C36脂肪酸含量顯著減少[28]。KCS18/FAE1在擬南芥發育的種子中特異表達,主要調控脂肪酸碳鏈長度從C18—C20(C22)的延伸,提高蓖麻種子中油酸的含量[31,107-108]。在玉米(Zeamays)中發現的Glossy8基因編碼β-酮酰基-CoA還原酶(KCR),Glossy8突變會導致玉米幼苗葉片上蠟質含量顯著減少[109]。Dietrich等[110]進一步發現了2個與GLOSSY8蛋白序列相似度高達97%的同源旁系蛋白GLOSSY8A和GLOSSY8B,這兩個同源基因雙突變體在胚胎發育過程中致死,其在影響蠟質合成的功能上也和Glossy8相同。在水稻中發現,WSL1編碼KCS家族蛋白,WSL1的突變體葉片和葉鞘上的蠟質顯著減少,WSL1能催化C20—C24VLCFAs的延伸,進而影響水稻幼苗期葉片及植株生長發育過程[93]。

KCR在植物形態建成過程中是非常重要的[111]。具有KCR酶活性的KCR1和KCR2,在擬南芥中能夠導致植物表皮蠟質含量減少并且影響超長鏈脂肪酸化合物的合成[32]。KCR1和KCR2在擬南芥的角果、花、莖、葉以及正在發育的胚胎中都有表達,但只有KCR1能夠在根中表達。在水稻中發現的WSL3基因編碼KCR,且與擬南芥AtKCR1基因和酵母YBR159w基因編碼蛋白相似,并通過參與VLCFA的延伸影響水稻葉片蠟質的生成[20]。擬南芥AKR2A基因的PES基序與KCS1的跨膜基序在質體內相互作用,可通過增加VLCFA的含量提高植株的耐寒性[112]。擬南芥PAS2基因具有HCD活性,PAS2突變體會導致種子中貯存的三酰甘油酯、表皮蠟質、鞘脂類化合物等含量減少[34]。Yu等[48]研究發現,擬南芥CER10編碼烯酰輔酶A還原酶(Enyl-CoA reductase,ECR),負責超長鏈脂肪酸(VLCFAs)的延伸反應,隨后衍生成角質層蠟、儲存脂質和鞘脂質等[48,113]。在CER10突變體中,總蠟含量顯著減少,其中莖表皮蠟質含量減少了60%。

在擬南芥CER2突變體中,所有蠟質組分都減少,特別表現為超過28個碳原子的蠟質組分含量顯著減少。Haslam等[43]進一步研究發現CER2屬于乙酰輔酶A依賴型酰基轉移酶BAHD超家族成員(BAHD superfamily of acyl-CoA-dependent acyltransferases),參與不同底物的酰基化反應,產生多種次生代謝產物。后來發現的CER2同源基因CER2-like1表明CER2是參與C28—C30VLCFA酰基鏈的延伸,而CER2-like1則是參與C30—C32VLCFA酰基鏈的延伸反應[52-53]。此后,在擬南芥中發現的CER26基因,與CER2具有較高的相似性,主要負責C30及以上脂肪酸鏈的延伸,其在葉片蠟質合成上與CER2具有同樣的功能[44]。Alexander等[87]在玉米中也發現了CER2的同源基因Glossy2和Glossy2-like基因,他們都是BAHD超家族的酰基轉移酶的成員,與擬南芥CER2基因的序列非常相似,Glossy2和Glossy2-like在功能上可與擬南芥CER2突變互補,對植物的表皮脂質和脂質組成有不同的影響,主要影響C32的烷基鏈酰基脂質,但Glossy2和Glossy2-like基因在影響表皮脂質的功能上具有功能冗余現象。

2.3 酰基還原途徑

VLCFAs酰基輔酶A在依賴于NADH的酰基輔酶A還原酶(fatty acyl-CoA reductase,FAR)的作用下將脂肪酸催化合成初級醇(伯醇),每次循環由丙二酰輔酶A提供2個碳原子。初級醇與飽和脂肪酸在蠟質合成酶(wax synthesis,WS)的催化下,縮合生成蠟酯,該途徑合成的蠟質占整個總蠟的20%左右,見圖3。目前在擬南芥中發現了1個編碼FAR的基因FAR3/CER4,其編碼1種催化醇形成過程中的脂肪酰基輔酶A還原酶(FAR)。據報道該酶負責在表皮和根中初級醇的合成,說明該基因在超長鏈初級醇的形成中具有非常重要的作用[4]。進一步分析擬南芥CER4突變體的莖稈蠟成分,發現蠟質的脂肪酸鏈為C16,C16是擬南芥莖表皮蠟質中蠟酯(wax ester)合成的酰基底物[47]。Li等[49]研究表明,WSD1(wax ester synthase/acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase)是蠟質合成酶/甘油二酯酰基轉移酶(wax ester synthase/Glyceryl diester acyltransferase,WS/DGAT)雙功能基因家族成員,在擬南芥莖稈的蠟酯合成中起了非常重要的作用。WSD1的突變體中,莖表皮蠟質中蠟酯含量顯著減少,并且在大腸桿菌與酵母中表達WSD1基因,蠟酯含量顯著增加,表明WSD1主要參與蠟酯的合成。

圖3 表皮蠟質主要成分合成途徑Fig.3 Synthesis pathway of main components of epidermal wax

2.4 脫羧途徑

VLCFAs在酯酰輔酶還原酶(FAR)的催化下生成醛類物質,后在醛脫羧酶(aldehyde decarboxylase,AD)的作用下直接脫羧生成奇數碳原子的烷烴,并釋放一氧化碳。烷烴是擬南芥中莖稈蠟的主要組成成分。烷烴在中鏈烷烴羥化酶(mid-chain alkane hydroxylase,MAH)的作用下羥化生成次級醇(仲醇),次級醇經過醇氧化酶催化生成酮,通過此途徑合成的蠟質占植株總蠟的80%左右[55]。目前,有關調控植物蠟質中烷烴合成的基因研究較多。CER1是在擬南芥中發現的第一個蠟質合成基因,其編碼醛脫羧酶(AD),負責把超長鏈醛轉化為超長鏈烷烴[36]。CER1突變體的莖表皮蠟質成分中的烷烴、次級醇和酮含量下降,而醛含量上升。在相對濕度較低的情況下表現出雄性不育;過表達CER1的轉基因植株中奇數碳原子烷烴(主要是C29和C31)的含量顯著增加,可顯著提高植物的抗逆性[37]。后又有研究發現了負責角質超長鏈烷烴復合體形成的CER1-LIKE1[40]。從擬南芥中克隆出的WAX2基因編碼1個約632個氨基酸的膜蛋白,同時影響角質層和表皮蠟質的結構和組成。WAX2突變會導致醛、烷烴、次級醇、酮的比例減少,初級醇和蠟酯的含量增加以及花器官的融合,在相對濕度較低的條件下育性降低,表皮滲透性增加[51]。擬南芥CER3基因是WAX2/YRE/FLP1的等位基因,也參與蠟質和角質的生物合成[45]。Bernard等[38]研究發現擬南芥CYTB5s(cytochrome b5 isoforms)是CER1特殊的輔酶因子,可以提高CER1的活性,從而增加烷烴的生成。CER1與CER3和CYTB5s互作催化超長鏈酰基輔酶A合成超長鏈烷烴,CER1與CER3是VLCFAs合成烷烴的核心組件,CER3編碼一個超家族脂肪酸羥化酶蛋白,起還原酶作用,而CER1則具有醛脫羧酶活性[38]。玉米Glossy1(gl1)和擬南芥CER3/WAX2編碼蛋白同源,它不僅影響角質層蠟質的合成而且對植物表皮發育有多重效應,會改變毛狀體的大小以及影響角質的結構[52]。水稻中也克隆出1個與擬南芥CER3/WAX2和玉米GL1同源的基因WSL2,水稻WSL2突變體能夠顯著減少C22～C32脂肪酸的含量[53]。在玉米的蠟質合成突變體Glossy11中,超長鏈醛合成過程完全受阻,烷基酯的含量明顯增加,尤其是鏈長為C40～C48的分子。此外,該突變體蠟質成分中的正丁醇(C32烷醇)含量降低,此成分在表皮蠟形成中起重要作用[47,114]。從擬南芥中鑒定出的MAH1基因編碼中鏈烷烴羥化酶,定位在內質網上,催化由烷烴轉化為次級醇和酮的反應,MAH1突變體與野生型相比次級醇和酮的含量減少,烷烴的含量增加,說明MAH1在次級醇和酮的合成過程中具有重要作用[55]。在番茄中鑒定出1個與CER1同源的基因SlCER1-1也參與催化烷烴的合成[39]。最新研究發現,在擬南芥莖蠟質生物合成中脂肪醇氧化酶3(FAO3)和FAO4b在醇和烷烴的形成途徑中的均起作用[115]。

3 蠟質運輸、分泌及調控機制

目前,已發現的催化蠟質合成前體VLCFAs的酶都定位在內質網上[116-117],這表明蠟質產物都是在內質網內合成的,蠟質產物最終在表皮層發揮作用。因此,在內質網中產生的蠟質、醛、烷烴、醇、酮等蠟質成分,需要從內質網中運輸到植物的表皮層發揮作用。此過程需要穿過內質網膜、質膜、穿過細胞壁,最終在植物表皮上堆積組裝成蠟質晶體[58]。

3.1 從內質網運輸到質膜

目前對于蠟質成分從內質網到質膜的運輸途徑,存在著兩種假說,一種是囊泡分泌假說,認為蠟質成分以小囊泡的形式,從內質網運輸到高爾基體,再運輸到質膜[5](圖4)。第二種假說認為蠟質成分通過與質膜原生質緊密并置的內質網區域直接轉運進入質膜,但是這些區域并不發生膜的融合,內質網膜和質膜之間距離大約10 nm。已有研究證明脂質可以從質膜轉移到內質網膜,而無需囊泡的介導[58],因此推測,蠟質成分可通過內質網膜和質膜的緊密并置區直接進入質膜,但目前這2種假說都沒有直接的試驗證據,有待進一步驗證。

圖4 表皮蠟質運輸機制Fig.4 Mechanism of epidermal wax transport

3.2 從質膜運輸到細胞壁

到達質膜中的蠟質成分要轉移到疏水性的質外體中,從質膜的疏水中心轉移超長鏈脂肪酸的衍生物需要消耗能量[58]。ABC轉運蛋白,即ATP結合盒式蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC),是一類利用水解ATP的能量,由2個跨膜結構域及2個胞質ATP結合域組成的轉運蛋白,可以將細胞質膜上的糖、氨基酸、磷脂和肽、親脂性藥物、膽固醇和其他小分子轉運到細胞外。ABC轉運蛋白的一個亞基定位在質膜上,能夠水解ATP提供能量,是植物中發現的能夠運輸脂類的依賴于ATP供能的親脂蛋白,并直接影響了植物表皮蠟質的積累[57-59,118]。第一個從擬南芥中克隆的ABC轉運蛋白由CER5編碼,命名為ABCG12,定位于細胞質膜,參與植物表皮蠟質的運輸[58]。CER5突變體的莖和葉表皮蠟質含量減少,在蠟質分泌細胞的細胞質中堆積了一些片狀的油脂夾雜物[58]。Bird等[57]研究表明,ABCG11突變體與CER5突變體表型相似,其莖和葉片表皮總蠟質含量減少,并且ABCG11蛋白也定位于質膜。ABCG11還與營養器官中角質單體的輸出有關。ABCG11可以與ABCG12結合形成同源二聚體,ABCG12運輸蠟質成分到質膜需要依賴ABCG11,ABCG11能夠與多種蛋白互作轉運脂質化合物[57,59]。玉米Glossy13基因與擬南芥ABCG32家族基因編碼蛋白高度同源,參與了蠟質向表皮細胞運輸的過程[61]。Li等[91]研究發現,玉米基因Glossy6可能不僅參與蠟質在內質網中的合成,可能也在細胞蠟質運輸過程中起作用,亞細胞定位發現Glossy6在高爾基體、囊泡膜、細胞質等細胞器均有表達,通過透射電鏡觀察發現Glossy6突變體葉片表皮細胞內積累了大量的類似CER5擬南芥突變體中的針狀蠟質晶體,不能運出細胞膜外,由此推測,Glossy6是在蠟質合成、胞內運輸等過程起作用。在擬南芥中,WBC11參與表皮脂質和蠟質的運輸,敲除WBC11導致植株生長發育遲緩,花粉粒形狀不規則以及植物表面角質和蠟質含量減少[58]。此外,植物花粉雄性不育也直接和花藥蠟質積累量減少有關,蠟質轉運蛋白功能的異常直接導致花藥保水能力下降,導致花粉干癟敗育,花器官發育也和蠟質轉運和分泌直接相關[56,60,95-97,119]。

3.3 從細胞壁到角質層

穿過質膜進入質外體的疏水蠟質成分,需要經過親水的細胞壁基質到達植物角質層,該過程主要有2個路徑,第一種路徑是脂轉運蛋白(lipid transfer proteins,LTPs)發揮作用,植物蠟質中最豐富的蛋白是非特異性脂轉移蛋白,該蛋白對底物的結合有廣泛的特異性[56,62],見圖4。當疏水性的蠟質成分到達質體外后,其外分布的大量脂轉運蛋白迅速與其結合,將其運輸出細胞壁到達表皮外側。關于LTPs將蠟質輸送到角質層的功能已被證實[56]。在LTPG1突變體中,莖和角果表皮的C29烷烴含量減少,而葉表皮中的含量變化較小[63],另發現LTPG2與LTPG1功能相似,作用于擬南芥角質層蠟質的轉運[64]。Sun等[65]研究發現,在擬南芥中超表達鹽芥非特異性脂轉運蛋白TsnsLTP4會增加外表皮蠟質沉積,特別是超過C27的蠟質組分,TsnsLTP4蛋白亞細胞定位于細胞壁,在轉基因擬南芥中敲除TsnsLTP4,表皮蠟質沉積的數量顯著減少。第二種路徑是蠟質成分通過和細胞壁基質相互作用穿過細胞壁。雖然細胞壁是親水性的,但細胞壁上的蛋白和多糖在細胞壁上形成了一個相對疏水的區域[120],蠟質等疏水性成分可以通過此區域運出細胞壁,從而在表皮積累,當蠟質積累到一定量,就可以在角質中不定形蠟質的基礎上形成表皮蠟質晶體[121]。

4 蠟質合成的調控機制

植物表面蠟質的合成受到各種環境因子的影響,例如干旱等脅迫能夠促進蠟質的合成等[70,72,122]。另外,在植物發育過程中,蠟質合成也具有一定的時空特異性,主要表現在不同植物種類、組織及器官表面蠟質的分布都有所不同,如:擬南芥莖稈表面的蠟質含量高于葉表面且主要由烷烴(占比38%)、酮(30%)、脂肪醇(12%)、仲醇(10%)、醛(6%)、游離脂肪酸(3%)和蠟酯(1%)組成,葉片中蠟酯含量相對較少[90]。目前對蠟質合成調控的研究主要集中在3個方面:轉錄水平、轉錄后水平及翻譯后水平調控,見表4。

表4 植物表皮蠟質調控機制Table 4 Regulation mechanism of plant epidermal wax

4.1 蠟質合成轉錄水平調控

已有大量的證據表明,植物表皮蠟質合成可以在轉錄水平上被調控。WIN1/SHN1及其相似基因SHN2和SHN3,屬于AP2-EREBP類型轉錄因子,是最早被發現與表皮蠟質合成有關的轉錄因子。在擬南芥中發現,WIN1/SHN1能顯著上調KCS1、CER1和CER2基因的表達,它們都是編碼蠟質生物合成途徑的酶[68]。后來Kannangara等[123]研究發現,WIN1可以直接調控蠟質合成中編碼長鏈酰基輔酶A合成酶的LACS2基因。在水稻中報道了擬南芥WIN1/SHN基因的直系同源基因OsWR1,OsWR1與蠟質合成基因OsLACS2和OsFAE1的啟動子上的DRE和GCC元件發生相互作用從而調控其表達,是水稻中蠟質合成相關基因的正向調節因子,有助于減少植物的水分流失和增強抗旱性[70]。在番茄(Solanumlycopersicum)中發現SlSHN1基因是蠟質合成的轉錄激活子,過表達該基因會使GDSL脂肪酶、酰基輔酶合成酶基因的表達顯著上調,進而增加番茄果皮的蠟質含量[68]。在擬南芥中過表達大豆(Glycinemax)的GmSHN1和GmSHN9基因發現,參與脂肪酸延伸過程的AtKCS1、AtKCS2、AtCER6/CUT1、AtKCS10/FDH、AtKCR1、AtPAS2、AtCER10和AtCER2基因的表達均上調,從而致使葉片表皮蠟質含量增加[29]。擬南芥中AP2/ERF型轉錄因子WRINKLED4(WRI4)正調控擬南芥莖稈蠟質的積累,且其他已知的2個WRI1-like 蛋白WRI1和WRI3也在擬南芥脂肪酸合成中起正調控作用。WRI4直接與LACS1,KCR1,PAS2,ECR和WSD1的啟動子區域相互作用,同時還可以直接參與到蠟質前體的脂肪酸延長和蠟酯合成的調控[76-78]。Zhang等[71]在紫花苜蓿中也發現了包含AP2結構域的WXP1轉錄因子正調控角質層蠟質的積累,并導致紫花苜蓿的抗旱性提升,WXP1和WXP2屬于AP2/EREB型轉錄因子,能夠調控CER6和LACS2基因,在苜蓿中過表達WXP1基因,C30初級醇含量顯著增加,其葉片上表皮蠟質含量也顯著增加。Cheng等[69]在莎草屬(Cyperusesculentus)中分離的AP2/ERF型轉錄因子WRI4-like轉入擬南芥中也發現了同樣蠟質增加的表型,莎草CeWRI4通過促進表皮蠟的生物合成和沉積,從而提高其耐旱性和干旱脅迫下的水分利用效率。這些研究表明,WIN1/SHN1在調控蠟質及角質的生物合成或積累中發揮重要作用。Suh等[79-80]報道,MYB轉錄因子家族成員對陸生及藻類植物蠟質的合成起著重要的調控作用。已經發現的正調控蠟質積累的轉錄因子占比較大[35,124];MYB16通過與WIN1/SHN1部分協同從而調控角質的生物合成和蠟的積累[66];MYB106可以正調控WIN1/SHN1的表達[66];MYB30能夠通過調控KCS1/2、PAS2/HCD、CER3和LTPG1等基因的表達,參與到蠟質生物合成及VLCFAs延伸途徑中,誘導VLCFAs的積累[35];MYB96轉錄因子表達升高,能作用于靶基因KCS1、KCS2、KCS6、KCR1和CER3,上調這些參與蠟質合成通路基因的表達[33];MYB96的同源基因MYB94具有類似的功能,通過上調WSD1、KCS2/DAISY、CER2、FAR3和ECR基因促進蠟質合成[33],MYB94和MYB96通過與蠟質生物合成基因啟動子中相同的MYB共有基序結合來激活表皮蠟質的生物合成[33];過表達MYB41基因,會使其植株細胞體積變小,角質層不連續,并增加角質及蠟質生物合成相關基因轉錄的數量。這些結果表明,MYB41可以調控角質和蠟質的合成[67]。玉米中最早發現的調控蠟質合成的Glossy3基因,其編碼1個MYB轉錄因子并正調控蠟質的合成[88]。Zheng等[89]曾利用玉米中已發現的蠟質突變體進行了轉錄組分析,以挖掘受Glossy3調控的更多的蠟質合成相關基因。

轉錄組學分析數據表明一些參與蠟質合成基因的表達受晝夜節律調控,蠟質的合成和積累也呈現相應的節律性變化,這種變化與AP2/ERF型轉錄因子DEWAX調控有關[72]。DEWAX的表達受黑暗誘導,呈現出與蠟質合成相關基因相反的表達模式。據報道,擬南芥DEWAX能夠負調控LACS,如果抑制該轉錄因子的表達,會增加LACS的活性,從而使葉片和莖稈蠟質顯著增加;若過表達該基因則會降低LACS的活性,進而減少葉蠟和莖蠟的總量。由此表明,DEWAX轉錄因子是蠟質合成的負調控因子[73-75]。蠟質除了具有反射光線和保水功能外,也會影響細胞的分化過程及器官分化的形態建成。Wu等[30]研究擬南芥卷葉突變體curlyflagleaf1(cfl1)時發現1個具有WW結構域(蛋白-蛋白作用模式;A Module for Protein-protein Interaction)的CFL1蛋白,過量表達該基因會導致葉片表皮蠟質合成量減少,伴隨著葉片卷曲器官融合,CFL1可以直接與HDG1互作進一步正調控蠟質合成關鍵基因FDH/KCS10。AP2/DREB型轉錄因子RAP2.4與WXP1具有高度序列相似性,在干旱脅迫下,能夠轉錄激活蠟質合成過程中的KCS2和CER1的表達,這表明RAP2.4是在干旱脅迫條件下激活擬南芥葉片中表皮蠟質生物合成的轉錄因子[81]。目前已有研究發現,在擬南芥和亞麻薺(Camelinasativa(L.) Crantz)中過表達WSD1可以改善擬南芥和亞麻薺的滲透脅迫耐受性,從而增強對干旱脅迫的耐受性[50]。

5 蠟質合成轉錄后水平調控

蠟質合成的轉錄因子除了在轉錄水平調控以外,還存在轉錄后水平調控。擬南芥CER7對蠟質的調控就屬于轉錄后水平調控,CER7編碼外泌體(exosome)的核心亞基,通過控制CER3的轉錄水平來調節擬南芥莖稈蠟質水平[83]。Lv等[84]進一步研究發現,CER7編碼的蛋白具有3′→5′外切核糖核酸酶活性,能介導CER3轉錄物3′→5′的衰變,其衰變會引發siRNA(small interfering RNAs)的大量產生和CER3/WAX2高效的轉錄后基因表達沉默,表明CER7是在轉錄后通過RNA加工來調控蠟質合成。另外,tasiRNAs(trans-acting small interfering RNAs)能夠直接作為效應分子調控CER3/WAX2水平來調控蠟質合成。在植物中存在著大量非編碼小RNA,它們通過對靶標mRNA直接切割或在轉錄后抑制其翻譯對基因表達起調控作用[124]。這些研究說明植物中非編碼小RNA在蠟質合成的轉錄后調控過程中起著重要作用。此外,CER16通過抑制轉錄后CER3基因的沉默從而調節烷烴的生物合成[46]。

6 蠟質合成翻譯后水平調控

蠟質生物合成調控還發生在翻譯水平上,但是目前在這方面的研究較少。CER9編碼一個帶有RING結構域的E3泛素連接酶,可通過降解泛素-26S蛋白酶體系統從而使表皮脂質合成受損,該基因功能缺失會致使C24、C26超長鏈脂肪酸合成量顯著增加,而醛、初級醇及烷烴等成分減少[84]。Ménard等[86]研究表明,2個編碼RINGE3泛素連接酶(HUB1和HUB2)基因通過H2B組蛋白的泛素化,通過上調LACS2和CER1基因的表達,進而調控表皮蠟質的生物合成。2019年,Kim等[85]研究發現,擬南芥SAGL1介導泛素連接酶復合物在細胞質中靶向降解長鏈烷烴合成酶CER3,從而負調節表皮蠟的生物合成,SAGL1突變將導致嚴重的植株生長遲緩,耐旱性增強以及莖、葉和根中蠟的積累,SAGL1-CER3調節模式,可在不同濕度條件下維持陸生植物中表皮蠟生物合成的穩態。

7 蠟質的其他調控途徑

植物表皮蠟質的生物合成及運輸調控機制較為復雜,除了以上脂肪酸合成、延伸、脂肪酸之間的轉換,以及蠟質在胞內的運輸、轉運等較為穩定的生物途徑外,還有一些潛在的調控模式目前還未被挖掘。Wang等[125]發現,組蛋白乙酰化酶GCN5通過調控CER3的轉錄水平,從而正向調控擬南芥莖稈蠟質的合成。而Guo等[82]也發現,水稻OsCHR4基因編碼1個CHD3家族染色體重組蛋白,其突變后導致水稻葉片變窄卷曲,且蠟質積累。此外,植物生長環境也直接影響到表皮蠟質的積累,且蠟質含量的多少也會影響到植物體內激素水平的變化,以及植物的生長發育。如在干旱和鹽脅迫下向日葵葉片蠟質積累受到影響[98]。Takasugi等[94]發現,水稻脂肪酸延伸酶的突變體oni1中不僅蠟質含量減少,其植物生長素相關基因的表達也受到了影響。

8 結 語

已報道的植物表皮蠟質的合成途徑表明,內質網中的乙酰輔酶A經過TCA循環后,經過脂肪酸的從頭合成,生成C16、C18脂肪酸,在酰基還原酶的催化下,延伸生成蠟質合成前體VLCFAs,再經過酰基還原途徑和脫羧途徑生成蠟質主要成分。已有研究在這個過程中挖掘到了很多相關基因,如長鏈酰基輔酶A合成酶(LACS)類基因、酰基轉移酶BAHD家族成員CER2基因、烷烴羥化酶MAH1基因等各類合成基因保證了蠟質的合成。

除了目前已知的蠟質生物合成、轉運及調控相關基因外,環境條件包括光照、溫度等環境因素對植物表皮蠟質的調控機理還尚待挖掘;表觀遺傳學水平的調控機制也有待深入研究。今后,應挖掘更多的蠟質基因,通過超表達或者基因編輯技術對蠟質進行富集,從而提高植物的耐旱、耐熱、耐輻射及病蟲害抵御能力。其次,蠟質也是果蔬保鮮的“秘密武器”,可延長果蔬的貨架期;也可以通過提純、合成相關產物,用于蔬果保鮮。