L-精氨酸快速定量檢測方法的研究

呂志飛 王松江 郭傳莊 隋松森 李小雙 連 戰 孫瑞成 王建彬

（諸城東曉生物科技有限公司，山東 濰坊 261000）

L-精氨酸是動物營養中一種關鍵的功能性必需氨基酸[1]，能夠促進動物機體生長、增強動物機體免疫、提高動物機體繁殖性能和生產性能，在促進動物生產綠色健康發展中發揮著重要作用[2]。L-精氨酸是新生哺乳動物和家禽維持最佳生長的必需氨基酸[3]，動物飼糧中添加適量的L-精氨酸能夠降低料重比，提高平均日增重[4-6]。Yao 等[7]研究表明，仔豬飼糧中添加1%精氨酸能夠促進小腸吸收營養及仔豬腸道的生長發育，從而使仔豬生長性能達到最佳。L-精氨酸主要通過“精氨酸酶”和“一氧化氮”兩條途徑調節動物機體免疫平衡[8]，提高免疫力與幼齡動物存活率[9]。此外，在飼糧中添加適量L-精氨酸可以有效增強哺乳動物的繁殖性能[10]，提高胚胎存活率，調節母畜生殖道內環境酸堿度，在不影響受胎率的情況下提高產母犢率[11-12]。L-精氨酸在動物生產中的廣泛應用，對提高飼料利用率和畜禽產品質量、降低養殖成本、提升效益大有裨益。

目前，L-精氨酸多通過微生物發酵法生產。該方法通過嚴格控制發酵周期防止倒酸，保證產酸水平，因此，要求L-精氨酸的含量檢測必須高效準確。高效的檢測方法有助于L-精氨酸穩定生產，從而降低飼料中添加L-精氨酸的高昂成本，助力養殖業降本增效。L-精氨酸檢測方法主要包括氨基酸分析儀法、液相色譜分析法、酶法與坂口試劑法。氨基酸分析儀維護成本高，操作要求嚴格；液相色譜法設備成本高，檢測周期長，僅4 ℃沉降就需要2～3 h[13-14]；酶法需要制備丙酮干粉，制備時間長達40 h，檢測效率較低[15]。

本研究通過對坂口試劑改良法進行檢測參數優化、準確度驗證，保證L-精氨酸檢測的準確、高效，以期通過L-精氨酸的穩產降低飼料成本，為L-精氨酸的工業化生產提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

L-精氨酸發酵液，由諸城東曉生物科技有限公司L-精氨酸生產車間提供。

1.2 試驗試劑

L-精氨酸（純度≥99%）購自合肥博美生物科技有限責任公司，雙乙酰（純度≥98%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；8-羥基喹啉、正丙醇、氫氧化鈉、分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器設備

5804R 高速離心機購自德國艾本德股份公司，PL1502E 電子天平購自梅特勒-托利多國際有限公司，ZWY-110X50 恒溫培養振蕩器購自上海智城分析儀器制造有限公司；L5S 紫外可見分光光度計購自上海儀電分析儀器有限公司；Spectronic200 可見分光光度計購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；UV-5500PC紫外可見分光光度計購自上海元析儀器有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀購自株式會社日立制作所。

1.4 試驗方法

1.4.1 顯色液

取5 g 8-羥基喹啉加1%雙乙酰水溶液2.5 mL，使用正丙醇定容至100 mL。

1.4.2 標品

稱取1 gL-精氨酸標品加去離子水定容至100 mL，得到1%L-精氨酸標準溶液。使用移液管移取1%L-精氨酸標準溶液1 mL定容至100 mL，得到0.10 g/L的L-精氨酸標準溶液，即為標品。

1.4.3 發酵液前處理

發酵液離心取上清液，用去離子水稀釋至L-精氨酸含量1%左右，準確移取1 mL定容至100 mL，即為樣品。

1.4.4L-精氨酸含量測定步驟

根據需要準備10 mL 具塞試管，做好標記。準確移取7 mL 17.1 g/L 氫氧化鈉溶液于每支試管中。分別移取標品、樣品和純水（空白）1 mL于對應的試管中，在每支試管中加入2 mL 混合顯色劑，混勻，在30 ℃左右的水浴鍋中放置20 min充分顯色，在520 nm分光光度計下測定OD520nm值。

1.4.5L-精氨酸含量的計算

L-精氨酸(%)=(樣品OD/標品OD)×稀釋倍數(1)

1.4.6L-精氨酸標準曲線

配制0.2 g/L的L-精氨酸水溶液作為母液，稀釋獲得質量濃度為0.04、0.08、0.10、0.12、0.16 g/L 的L-精氨酸水溶液，其中0.10 g/L 的L-精氨酸水溶液為標品。按照L-精氨酸含量測定步驟加樣、顯色，測定吸光度，繪制L-精氨酸標準曲線。

1.5 數據統計與分析

采用Excel 進行數據處理并計算標準偏差，采用Origin pro 2017進行數據分析及圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 檢測參數的確定

2.1.1 分光光度計的選擇

為排除儀器誤差對L-精氨酸含量測定結果的影響，分別選用3 臺不同廠家、型號的分光光度計對同一樣品進行測定。結果表明，分光光度計L5S、Spectronic200、UV-5500PC 測得的L-精氨酸含量分別為50.82、50.71、50.75 g/L。由此可知，坂口試劑改良法對分光光度計的選擇性不高，可適用于工業生產。

2.1.2 檢測波長的確定

反應液的紫外分光光度計掃描結果見圖1。

圖1 反應液的紫外分光光度計掃描結果

L-精氨酸側鏈胍基在堿性介質中與顯色液發生反應生成紅色物質，該物質的吸光度在一定范圍內與L-精氨酸濃度呈線性關系。本試驗用L5S 紫外可見分光光度計對生成的紅色反應液進行掃描。由圖1 可知，525 nm 處的吸光度最大。因此，以525 nm作為L-精氨酸檢測的最適波長。

2.1.3 顯色時間與顯色反應穩定性（見圖2、圖3）

圖2 反應液的動力學測量結果（顯色20 min）

圖3 反應液的動力學測量結果（顯色30 min）

試驗過程中發現，顯色時間對反應液的吸光度有一定影響。因此，為探究顯色反應的穩定性，將同一濃度的L-精氨酸溶液分別顯色20、30 min 后，用L5S 分光光度計對反應液進行動力學測量，觀察反應液吸光度隨時間變化的情況。

由圖2 可知，樣品水浴顯色20 min 后直接測吸光度時，此時吸光度未達到最大值，顯色不完全。

由圖3 可知，樣品水浴顯色30 min 后直接測吸光度時，吸光度達到最大值，顯色完全，且吸光度在10 min內保持不變。對比圖2、圖3可知，水浴顯色30 min后取出樣品，并在10 min 內完成吸光度的測定，更有利于保證L-精氨酸在實際測定過程中測量結果的準確性。

2.1.4L-精氨酸標準曲線（見圖4）

圖4 L-精氨酸標準曲線

在檢測波長525 nm，水浴顯色30 min 的條件下繪制L-精氨酸的標準曲線。由圖4 可知，L-精氨酸的標準曲線為y=6.456 4x，L-精氨酸在該范圍內線性關系良好，R2=0.999 8。

2.2 不同因素對L-精氨酸含量測定的影響

2.2.1L-賴氨酸的存在對L-精氨酸含量測定的影響（見表1）

表1 L-賴氨酸對L-精氨酸含量測定的影響（n=3）單位：g/L

研究表明，L-賴氨酸為L-精氨酸發酵中最主要的副產物。在L-精氨酸工業生產過程中，L-賴氨酸濃度可達10 g/L[16]。為探究L-賴氨酸的存在對L-精氨酸含量測定的影響，分別配制L-精氨酸溶液、L-賴氨酸溶液、相同濃度的L-精氨酸和L-賴氨酸的混合液，測定3種溶液的L-賴氨酸、L-精氨酸含量。結果表明，發酵液中L-賴氨酸的存在對L-精氨酸含量的測定結果無干擾。

2.2.2 不同pH值對L-精氨酸含量測定的影響（見表2）在L-精氨酸的發酵與后提取過程中，L-精氨酸溶液的pH 值會因酸、堿的加入產生變化。為探究不同pH 值對L-精氨酸含量測定的影響，調節L-精氨酸溶液pH 值至設定值，測定L-精氨酸含量。由表2可知，不同pH值的L-精氨酸溶液中，L-精氨酸含量標準偏差為0.047。因此，L-精氨酸生產過程中，pH 值的變化對L-精氨酸含量的測定結果無干擾。

表2 pH值的不同對L-精氨酸含量測定的影響（n=3）

2.2.3 發酵液成分對L-精氨酸含量測定的影響（見表3）

表3 樣品加標回收結果（n=3）

L-精氨酸生產過程往往采取流加葡萄糖與硫酸銨的方式提高發酵水平，大量的葡萄糖、硫酸銨等物質對顯色反應影響尚不明確。故通過加標回收的方法驗證發酵液成分對L-精氨酸含量測定的影響。考慮不同發酵階段發酵液組分存在差異，選擇發酵初始階段（發酵12 h）和下罐（發酵59 h）兩個時間點的發酵上清液/上清稀釋液分別重復本實驗，驗證發酵液成分對L-精氨酸含量測定的影響。由表3 可知，測得樣品的加標回收率分別為99.20%、100.60%。由此可知，發酵液成分對L-精氨酸含量測定結果影響極小。

2.3 方法的可靠性

2.3.1 檢測方法的重現性（見表4）

表4 檢測方法的重現性

方法的重現性能夠很好地檢驗方法的可行性。為探究本檢測方法的重現性，重復標準曲線的制作過程。根據各批次繪制的標準曲線斜率計算出標準偏差為0.012，實驗結果表明，該方法的重現性良好，可以用于L-精氨酸的定量檢測。

2.3.2 不同化驗員操作平行性（見表5）

表5 不同化驗員操作平行性（n=3）

4位化驗員采用不同的分光光度計，分別對4個時間點的發酵液進行L-精氨酸含量的測定。由表5 可知，L-精氨酸含量測定方法的操作平行性良好。

2.3.3 檢測方法的準確性（見表6）

表6 檢測方法的準確性（n=3） 單位：g/L

取3 份樣液，分別用本研究優化后的坂口試劑改良法和全自動氨基酸分析儀進行定量檢測。由表6 可知，本文方法定量測定L-精氨酸的結果較準確。

3 討論

本研究對坂口試劑改良法進行了檢測參數的優化以及準確性的檢驗，建立了一種L-精氨酸快速定量檢測方法。與其他方法相比，本檢測方法的優勢為所用設備均為實驗室常用設備，對分光光度計的選擇性不高，檢測成本低廉、適用性強。與郝剛等[17]研究結果相比，本方法測定不依賴標準曲線，且在實際檢測過程中可通過不同規格的容量瓶進行稀釋，簡化了樣品的前處理過程，檢測效率更高；與李煒等[15]提出的檢測方法相比，本研究檢測過程顯色更完全，吸光度更穩定，在實際生產中同時檢測多個樣品時能夠最大限度地保證檢測結果的準確性。本方法操作簡便易行，化驗員可熟練掌握，不同化驗員檢測的相對標準偏差均小于0.4%，適宜推廣使用。

4 結論

本研究對坂口試劑改良法測定L-精氨酸含量的條件進行優化與驗證，結果表明，該方法在0～0.2 g/L 范圍內線性關系良好，相關系數為0.999 8。加標回收率范圍為99.20%～100.60%，標準偏差為0.012，小于0.05，滿足化學分析法的要求。本研究測定方法測得結果與全自動氨基酸分析儀測得結果差距較小，可準確測定L-精氨酸含量。該方法的優化與驗證為L-精氨酸產業提供了一種快速高效的L-精氨酸檢測方法，也為其他氨基酸的快速定量檢測方法的選擇與優化提供了參考。