飼用五環(huán)三萜提取物的致突變試驗

張 媛 肖宜容 陳怡夢 陳 新，2 張雨梅，2

（1．揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009；2．江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009）

細菌耐藥性的產生是醫(yī)學界面臨的重要問題，減少及禁止抗生素在畜禽養(yǎng)殖中的使用已經成為必然趨勢。尋找天然動植物、海洋生物或利用生物技術發(fā)現(xiàn)抗菌藥物替代品，增強機體免疫功能迫在眉睫[1]。中草藥具有良好的藥用價值，可部分替代抗生素，因此受到廣泛關注[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在植物中廣泛存在的萜類化合物具有多樣的藥理作用[3]。三萜類物質具有不易揮發(fā)、性質穩(wěn)定的特點，是很多中草藥的主要活性成分[4]。五環(huán)三萜類物質具有廣泛的生物學活性和藥理作用，如抗炎[5]、降血糖[6]、抗腫瘤[7]、抗寄生蟲[8]等。本研究的受試物有效成分主要包括山楂酸[9]、科羅索酸[10]、樺木醇、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸等。使用山楂酸治療腹瀉型腸易激綜合征具有較好的治療效果[11]。熊果酸可以維護腸道穩(wěn)態(tài)和機體健康[12]。小檗堿齊墩果酸鹽有助于仔豬的生長發(fā)育，可有效緩解仔豬感染產腸毒素大腸桿菌后的體重減輕[13]。從茶籽中提取的五環(huán)三萜類化合物可以提高畜禽生產性能，增強免疫力[14]。以三萜類為主要活性物質的糖萜素添加在飼料中，可有效提高肥育豬生長性能，增強免疫力，降低谷草轉氨酶活性。目前，關于該提取物遺傳毒性研究的報道較為少見。本文參照GB 15193.4—2014 食品安全國家標準中細菌回復突變試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗及精子畸變試驗的方法，評價五環(huán)三萜提取物是否具有的致突變性，為五環(huán)三萜提取物作為飼料添加劑的安全性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

依據GB 15193.4—2014 中推薦組合，選取鼠TA97、TA98、TA100、TA102 和TA1535 菌株，購自Molecular Toxicology Inc 公司。菌株儲存于-80 ℃或平板短期保存于4 ℃，備用。按GB 15193.4—2014 方法對菌株進行生物學特性鑒定。

1.1.2 試驗動物

Wistar 大鼠，雄性，5～6 周齡；ICR 小鼠，24～35 g。試驗動物由揚州大學獸醫(yī)學院比較醫(yī)學中心提供。動物生產許可證號：SCXK（蘇）2017-0004；使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0044。

1.1.3 試劑及儀器

五環(huán)三萜提取物成分為科羅索酸、樺木醇、山楂酸、白樺脂酸、齊墩果酸、微甲酸和熊果酸，含量≥90.0%（20191101），由湖南先偉生物有限公司提供。200 mg/mL多氯聯(lián)苯溶液、沙門氏菌細菌培養(yǎng)基，按GB 15193.4—2014 中要求配制。陽性誘變劑：1,8-二羥基蒽醌（S52025-379，德國Sigma 公司）、疊氮鈉（200001012，沈陽化學試劑廠）、2-氨基芴（26238B，美國Sigma-Aldrich公司）、敵克松（10112926，上海晶純試劑有限公司），均為分析純。

SG603A 生物安全柜（美國BAKER 公司）、SX-500高壓滅菌器（日本TOMY 公司）、BSA223S 電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）、GHP 系列隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）、UXF30086V 超低溫冰箱（美國Thermo Fisher 公司）、培養(yǎng)皿（南通蘇品實驗器材有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗

1.2.1.1 代謝活化系統(tǒng)（S9）

Wistar大鼠，雄性，5～6周齡。多氯聯(lián)苯玉米油溶液（200 g/L）按體重（500 mg/kg）腹腔注射。5 d 后處死大鼠，取肝臟，按GB 15193.4—2014 細菌回復突變試驗中大鼠肝S9的制備方法進行。

1.2.1.2 增菌培養(yǎng)

各試驗菌接種于5 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)條件：37 ℃、100 次/min，10 h。按照要求每毫升菌株培養(yǎng)物中應等于或大于1×109～2×109活菌數。

1.2.1.3 預試驗（點試驗法）

受試物劑量設置為50.00、10.00、2.00、0.40、0.08 g/L 溶液，另外設置的陰性對照（滅菌水、DMSO）和陽性對照組。每個劑量均設置有代謝活化系統(tǒng)（+S9）和無代謝活化系統(tǒng)（-S9）兩個系列，每個劑量組2個平行，每皿受試品溶液點樣10 μL。

1.2.1.4 正式試驗（平板摻入法）

受試物設置5 個劑量組，分別為0.008、0.040、0.200、1.000、5.000 mg/皿；另設DMSO對照組、滅菌水陰性對照及陽性對照組。每個劑量組都包括+S9和-S9兩個系列，每個劑量組3 個重復。制備底層培養(yǎng)基平板（10 mL/皿），取2 mL頂層培養(yǎng)基倒入5 mL無菌EP管中，加入100 μL 配置好的菌液，試驗組加10 μL 受試物，未處理對照組加10 μL 生理鹽水，DMSO 對照組加入10 μL DMSO，陽性對照組加入相應的誘變劑，-S9 組加入500 μL 生理鹽水，+S9 組加入500 μL S9 混合液。混勻頂層培養(yǎng)基，倒入鋪好底層培養(yǎng)基的平板上使其均勻分布，平放凝固后倒置培養(yǎng)，經37 ℃培養(yǎng)48 h，計數菌落數。

1.2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

50只ICR小鼠，25～35 g，雌、雄各半。受試物設置1.25 、2.50、5.00 g/kg BW 3 個劑量組，設環(huán)磷酰胺陽性對照組及滅菌水陰性對照組。給藥2次，間隔24 h。環(huán)磷酰胺對照組腹腔注射給藥一次。第二次給藥6 h后解剖小鼠，取股骨，用注射器吸取小牛血清沖出骨髓細胞進行推片，待涂片風干后使用甲醇固定，姬姆薩染色后鏡檢。每只小鼠計數1 000 個嗜多染紅細胞（PCE），計算其中含微核的細胞數目，并計數200 個紅細胞，計算嗜多染紅細胞（PCE）與正常紅細胞（NCE）的比值。

1.2.3 小鼠精子畸變試驗

30～35 gICR雄鼠50只，設置1.25、2.50、5.00 g/kg BW 3個劑量組，并設環(huán)磷酰胺陽性對照組及滅菌水陰性對照組。灌胃染毒，共給藥5次，每次給藥間隔24 h。陽性對照組按40 mg/kg BW進行環(huán)磷酰胺腹腔注射。于第一次給藥后35 d解剖小鼠，取兩側附睪，在生理鹽水中剪碎并吹打混勻，吸取過濾后的懸浮液制片，使用甲醇固定，2%伊紅染液染色。在油鏡下觀察精子形態(tài)，每只小鼠檢查精子800條，統(tǒng)計精子畸變率和畸變種類。

1.3 數據統(tǒng)計與分析

采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行數據統(tǒng)計分析。兩獨立樣本之間比較采用t檢驗，多組別采用單因素方差分析，結果用“平均值±標準差”表示，P＜0.05差異顯著。

2 結果與分析

2.1 Ames 試驗結果

預試驗結果顯示，受試物各劑量組對5 種試驗菌無明顯抑菌作用。

正式試驗結果顯示，受試物各劑量組中5 種試驗菌的菌株表現(xiàn)正常，陽性對照試驗及各菌株驗證試驗反應符合要求。受試物Ames 試驗兩次重復試驗結果見表1 和表2。由表1 及表2 可知，受試物在每皿0.008～5.000 mg/皿劑量范圍內，有或無S9 時，5 種試驗菌的平均回變菌落數均在陰性對照的兩倍以內，無劑量-反應關系，并且兩次重復結果一致。

表1 五環(huán)三萜提取物對鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗結果的影響（第一次）

表2 五環(huán)三萜提取物對鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗結果的影響（第二次）

2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

五環(huán)三萜提取物的小鼠骨髓細胞微核試驗結果見表3。由表3可知，各試驗組嗜多染紅細胞與正常紅細胞的比值（PCE/NCE）在0.6～1.2范圍內，且陽性對照組微核率顯著高于陰性對照組，表明本試驗方法結果可靠。五環(huán)三萜提取物各劑量組與陰性對照組的嗜多染紅細胞微核率均小于5%，且無顯著差異性（P＞0.05），表明受試物小鼠骨髓細胞微試驗結果為陰性。

表3 五環(huán)三萜提取物對小鼠骨髓細胞微核試驗結果

2.3 小鼠精子畸變試驗

五環(huán)三萜提取物的小鼠精子畸變率結果見表4，畸變精子類別統(tǒng)計結果見表5。由表4可知，陽性對照組精子畸變率顯著高于陰性對照組（P＜0.05），表明本試驗方法可靠。五環(huán)三萜提取物各劑量組的精子畸變率與陰性對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

表4 五環(huán)三萜提取物對小鼠精子畸變率的影響

表5 五環(huán)三萜提取物對小鼠精子畸變試驗各類精子畸變百分率 單位：%

由表5可知，各組間畸變類別無顯著差異（P＞0.05），表明受試物的小鼠精子畸變試驗結果為陰性。

3 討論

在飼料中添加萜類提取物可以增強動物的免疫應答及抗病能力，在畜禽養(yǎng)殖中具有潛在的應用價值[15]。急性毒性和亞慢性毒性試驗結果表明，在飼料中添加五環(huán)三萜提取物是相對安全的[16]。本文采用Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗及小鼠精子畸變試驗，從體外基因突變、體細胞和生殖細胞危害3 個方面對五環(huán)三萜提取物的致突變作用進行評價，進一步為五環(huán)三萜提取物作為飼料添加劑的安全性提供依據。

3.1 五環(huán)三萜提取物對鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗結果的影響

本試驗中，在試驗劑量下五環(huán)三萜提取物的Ames試驗中受試物各劑量組中5 種試驗菌的菌株生長正常，陽性對照試驗及各菌株驗證試驗反應合格。受試物在各劑量范圍內，有或無S9 時，5 種試驗菌的平均回變菌落數均在陰性對照的兩倍以內，未見劑量-反應關系，表明五環(huán)三萜提取物不具有致微生物（細菌）的基因突變作用。Ames 試驗是一種在體外進行的致突變實驗法，可以快速、便捷地檢測受試物引起的點突變。菌株（突變型）與受試物接觸，如果菌株（突變型）重新成為野生型菌株，表示其發(fā)生了回復突變從而體現(xiàn)出受試物具有致突變性。Ames試驗結果的判定是在一種及多種試驗菌株得到陽性結果，則認為受試物是致突變物；當所有試驗菌株均得到陰性結果，認為受試物是非致突變物。若在無活化系統(tǒng)（-S9）時得到陽性結果，說明受試物是直接致突變物。若在有活化系統(tǒng)（+S9）時為陽性結果，表明受試物是間接致突變物。目前，有研究表明，某些五環(huán)三萜類也不具有致突變性，如沙棘葉科羅索酸[17]濃縮物的Ames試驗結果也表明其不具有致突變性[18]。

3.2 五環(huán)三萜提取物對小鼠骨髓微核細胞率的影響

本試驗中，在試驗劑量條件下五環(huán)三萜提取物未增加小鼠骨髓細胞微核率，表明在該試驗條件下五環(huán)三萜提取物不具有對小鼠體細胞的遺傳毒性。小鼠骨髓細胞微核試驗是用于反映受試物是否會引起染色體或有絲分裂損傷是否具有體細胞致突變作用，是從細胞水平上檢測受試物是否具有體細胞遺傳毒性的一種方法。在細胞的有絲分裂過程中，無著絲粒的染色體片段或者因紡錘體受損而丟失的整個染色體，會在細胞分裂后期仍留在子細胞的胞質內形成微核。在小鼠骨髓中PCE 數量較充足，微核易辨別且微核自發(fā)率低因此可作為理想的試驗動物。有研究發(fā)現(xiàn)，楤木葉中分離出的多種五環(huán)三萜類皂苷，在小鼠骨髓微核試驗中也表現(xiàn)為無致突變性，并且能明顯抑制由環(huán)磷酰胺誘發(fā)的小鼠骨髓細胞的遺傳毒性，表明五環(huán)三萜類皂苷可保護由化學誘變劑引起的染色體斷裂，具有抗突變作用[19]。

3.3 五環(huán)三萜提取物對小鼠精子畸變率的影響

在本試驗中，在試驗劑量下小鼠精子畸變試驗結果為陰性，表明五環(huán)三萜提取物不具有對小鼠生殖細胞的遺傳毒性。小鼠精子畸變試驗中精子形態(tài)的改變提示著相關基因發(fā)生改變，將受試物給予雄性動物后，如果受試物具有遺傳毒性會使精子形態(tài)出現(xiàn)折尾、香蕉頭、無鉤、胖頭和無定形頭等變化，從形態(tài)學角度直接觀察受試物對精子產生的影響，來檢測受試物對雄性生精細胞的致突變作用，從而判斷其對生殖細胞是否具有潛在的致突變性。人參皂苷屬于三萜類皂苷，是人參、刺玫果、黃芪等中藥材中的主要活性成分之一，在對其進行小鼠精子畸變試驗發(fā)現(xiàn)其未誘發(fā)小鼠精子畸形率增高不具有致畸作用，活性氧引起的小鼠精原細胞氧化損傷可以被人參皂苷所緩解[20]。

4 結論

本試驗中，五環(huán)三萜提取物對Ames試驗、骨髓細胞微核試驗及精子畸變試驗的試驗結果表明其不具有致基因突變作用。