丁酸梭菌的分離鑒定及生物學特性研究

劉 瑾 趙 華

（天津科技大學生物工程學院 天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心 天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457）

丁酸梭菌屬于梭菌屬，是革蘭氏陽性菌中特有的腸道益生菌，具有較高的耐受性，菌體呈直桿狀或稍彎曲，被鞭毛包圍，是一種在惡劣環境中可通過形成芽孢增強自身對外界環境適應能力的菌株[1]。丁酸梭菌的芽孢抗逆性強，能夠經受制備過程中高溫、干燥、酸堿性的侵蝕，還具有穩定性強的特性[2]。芽孢在適當的條件下可重新萌芽并形成細菌。在腸道中，梭菌屬與乳酸菌屬等益生菌之間互利共生，可促進乳酸菌屬等益生菌的生長，達到調節動物腸道微生態平衡的作用[3]。

丁酸梭菌具有獨立的消化酶系統，可分泌多種代謝產物，其中丁酸是其最主要的代謝產物之一，可作為宿主胃腸道的能量來源[4]，促進胃腸上皮組織發育并鞏固其屏障功能[5]，達到促生長目的[6]。丁酸梭菌能夠產生較高濃度和純度的丁酸，具有較好的生長穩定性以及較低的營養需求等優點，極具開發潛力及商業價值[7]。近年來，丁酸梭菌作為益生菌被廣泛用于胃腸道疾病的臨床治療，如腸道菌群失調、藥物相關性腸炎、急性和慢性腹瀉、腸道應激綜合征和便秘等，具有極強的腸道整理作用，對維持腸道正常生態有益；與其他益生菌制劑相比，丁酸梭菌的生長速度快、抗應激能力強、可以在腸道內持續定植，能夠產生有機酸和丁酸梭菌肽[8-11]。丁酸梭菌發酵產生的分泌物可調節體內菌群結構和組成，改善動物機體內環境穩態，促進家畜生長[12]。丁酸梭菌及其代謝產物具有提高動物抗氧化能力、緩解炎癥、調節腸道免疫和屏障功能等作用[13-14]。這些特性使丁酸梭菌在食品、發酵工業、飼料、醫學醫藥等多個重要領域中具有得天獨厚的優勢[15-17]。

本研究從濃香型白酒窖泥中篩選丁酸梭菌，并對其進行生理生化試驗鑒定，采用氣相色譜法對其產酸量進行檢測，為丁酸梭菌在畜禽生產中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

窖泥樣品采自中國安徽文王酒業有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 窖泥懸浮液的制備

稱取窖泥樣品3.0 g，加入盛有80 mL RCM培養基和20 個無菌玻璃珠（φ=3 mm） 的螺口瓶中，37 ℃、220 r/min 振蕩30 min，得窖泥懸浮液。將獲得的窖泥懸浮液置于80 ℃下加熱10 min，殺死營養體細胞，獲得僅含孢子的滅活窖泥懸浮液。

1.2.2 丁酸梭菌的篩選

將10%滅活窖泥懸浮液接種于300 mL RCM 培養基中，平行3 組。搖勻后，封口膜隔絕氧氣，置于37 ℃厭氧培養箱中培養10 d，觀察螺口瓶內產氣情況，選用產氣多的螺口瓶吸取5.0 mL加入裝有RCM培養基的螺口瓶內，重復上述步驟，富集培養4～5 次。吸取富集培養菌液100 μL涂布，封口膜隔絕氧氣，放入厭氧袋中，35 ℃恒溫培養箱靜置培養3 d。挑取單菌落三區劃線重復此步驟2～3 次，得到純化單菌落。顯微鏡下觀察菌體，將篩選出的細菌在4 ℃下保存。

1.2.3 篩選菌株的鑒定

1.2.3.1 菌落形態學觀察

點接單菌落于RCM 固體培養基上，37 ℃倒置培養3 d，觀察記錄初篩菌的菌落形態、顏色、透明程度、光澤、大小等，分離純化后的菌株進行革蘭氏染色。

1.2.3.2 生理生化鑒定

參照《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》中的方法對疑似菌株進行相關生理生化鑒定。

1.2.3.3 16S rDNA序列分析

（1）脫氧核糖核酸（DNA）提取。

將獲得的單菌接入RCM 液體培養基內進行厭氧培養，培養3 d得到新鮮培養液，8 000 r/min離心10 min收集菌體，使用1 mL RCM培養基重懸。

（2）PCR擴增。

利用PCR 擴增得到目的16S rDNA，將得到驗證的PCR 產物送至金唯智生物科技有限公司測序，選定目的菌株。引物為細菌通用引物，序列為27F（5'-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-ACGGTTACCTTG TTACGACTT-3'）。

PCR 擴增體系：2×Es Taq MasterMix 12.5 μL、27F 1 μL、1492R 1 μL、菌株培養液1 μL，加入ddH2O補至總體系25 μL。

PCR 反應參數：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30 個循環；72 ℃終延伸2 min。

取擴增好的PCR產物3 μL，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行進一步驗證，剩余PCR 擴增產物于4 ℃冰箱內保存。若電泳驗證獲得較好的PCR 擴增產物，則將剩余PCR 擴增產物送至蘇州金維智生物工程有限公司進行測序分析，并通過NCBI 中的BLAST 數據庫對測序結果進行比對，選擇相似性較高的模式菌株序列。

1.2.4 測定篩選菌株生物學性能

1.2.4.1 菌株產酸量的測定

（1）酸類物質的定性檢測。

分別吸取乙酸、丁酸、己酸標準品1 mL于氣相色譜瓶內進行檢測，氣相色譜分析條件見表1，獲得單獨短鏈脂肪酸（SCFAs）出峰保留時間。氣相色譜儀的配備為氫離子火焰檢測器（FID）、DB-FFAP（30 m×320 μm×0.5 μm）色譜柱。

表1 氣相色譜分析條件

（2）酸類物質的標準曲線建立。

SCFAs 標準溶液質量濃度見表2，根據表2 配制SCFAs 的混合標準液，分別吸取酸類混合標準溶液1 mL，使用0.22 μm的有機相濾膜機型過濾，將溶液過濾至氣相色譜瓶內，按照表1方法進行檢測，獲得3種酸的氣相分析結果，以峰面積Y為縱坐標，質量濃度（g/L）X為橫坐標進行線性回歸，得到混合酸的各標準曲線。

表2 SCFAs標準溶液質量濃度 單位：g/L

（3）分析方法的精密度分析。

取表2內濃度等級1的混合標準溶液，按照表1的氣相分析條件連續進樣6 次，每次進樣結束后為樣品換上未使用的氣相色譜瓶的螺口蓋，最終結果選擇以丁酸的峰面積作為酸的代表計算相對標準偏差（RSD）用于表示分析測試結果的精密度。

式中：X為單次進樣峰面積，μ為6次進樣峰面積平均值，n為6次試驗。

（4）培養液的前處理。

將篩選獲得的2 株單菌接種于RCM 固體培養基上，厭氧袋內37 ℃培養3 d。使用接種環挑取少許菌落接種于300 mL RCM液體培養基內，培養6 d。

取菌體培養液1 mL，加入2%稀硫酸溶液，混勻，調節pH值為2，充分混勻完全酸化。用1 mL色譜純二氯甲烷1∶1 進行萃取，萃取液用0.22 μm 濾膜過濾作為待測樣品。

（5）氣相色譜分析培養液的酸類物質。

將單菌的培養液樣品前處理后，按照表1 進行氣相色譜分析，利用混合酸類物質的標準曲線定量得到2 株單菌的產酸種類以及產量。

1.2.4.2 篩選菌株活菌數的測定

篩選菌株培養6 d 后測定其發酵液生物量OD600nm值判斷發酵液中菌株活菌數，3個平行，重復3次。

1.2.4.3 篩選菌株芽孢率的測定

將培養6 d的培養液80 ℃水浴10 min稀釋涂布于LB培養基，重復3次，計算芽孢率。

1.2.4.4 篩選菌株淀粉酶活性的測定

各取相同OD600nm值的1 mL發酵液滴加到淀粉瓊脂平板指定位置，厭氧培養72 h，在表面覆蓋一層碘液，觀察并測定透明圈的直徑。

2 結果與分析

2.1 窖泥菌的篩選

利用RCM培養基從窖泥中共分離出15株菌落形態存在差異的單菌落，通過繼續培養篩選出2 株菌，其生長發育較為穩定，不易變性，命名為菌株J-1和菌株J-2。

2.2 篩選菌株的鑒定

2.2.1 菌落形態學觀察結果

將分離得到的菌株J-1、菌株J-2在RCM培養基厭氧培養5～7 d觀察其菌落形態，對單菌落進行革蘭氏染色并使用油鏡觀察，結果見圖1。

圖1 菌落形態及革蘭氏染色結果（100×油鏡）

由圖1（a）、圖1（c）可知，菌株J-1分離后的菌落形態在RCM 平板培養基上皆呈現菌落大，白色不透明，中間深四周淺，菌落中心微微凸起，表面粗糙、扁平、不規則。

由圖1（b）、圖1（d）可知，菌株J-2為革蘭氏陽性菌，菌體呈現長棒狀。

2.2.2 生理生化鑒定結果

對分離株進行單糖分解試驗、H2S試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、MR試驗、V-P試驗、硝酸鹽還原試驗等生理生化試驗，結果見表3。根據《伯杰氏系統細菌手冊》可初步判斷菌株J-1、菌株J-2均為丁酸梭菌。

表3 菌株生理生化鑒定結果

2.2.3 分子生物學鑒定結果

將分離得到的菌株J-1、菌株J-2 在35 ℃的RCM 液體培養基內培養2 d，得到新鮮菌體培養液，提取16S rDNA 進行PCR 擴增，將擴增結果在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳中進行DNA驗證，使用凝膠電泳成像系統得到的結果見圖2。

圖2 PCR擴增產物

由圖2 可知，篩選獲得的2 株單菌PCR 擴增產物在1 500～2 000 bp之間均出現了清晰且無彌散的條帶，表明得到了較高質量的PCR擴增產物。

將擴增所得的產物送樣進行測序，測序完成后將菌株16S rDNA全序列基因組在NCBI中的BLAST數據庫進行比對。根據對比結果可知，菌株J-1 與酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）序列同源性為98.41%，菌株J-2 與酪丁酸梭菌序列同源性為98.32%，均與酪丁酸梭菌具有較高的親緣性。采用MEGA-X軟件進行系統發育樹的構建，結果見圖3。

由圖3 可知，根據NCBI 的比對及系統發育樹可知，菌株J-1、J-2 與酪丁酸梭菌有較高的親緣性，為梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）。

2.3 篩選菌株生物學特性測定結果

2.3.1 菌株產酸量的測定結果

2.3.1.1 酸類物質的定性檢測

根據步驟可得單獨酸類物質的氣相定性分析結果，可知乙酸、丁酸、己酸的出峰保留時間分別為5.868、7.458、9.770 min。

混合酸的氣相分析結果見圖4。由圖4可知，氣相分析圖清晰明了，峰形對稱性高，色譜圖峰形尖銳，且無雜質峰干擾，物質分離單一，可準確定性，氣相分析方法分離快速、操作實用以及分析周期短。

圖4 混合酸的氣相分析結果

混合酸的標準曲線見表4。由表4 可知，乙酸、丁酸、己酸的標準曲線在線性范圍內具有良好的線性關系，相關系數均大于0.999，表明該氣相分析方法具有可靠性。

表4 混合酸的標準曲線

根據連續進樣濃度等級1的混合標準溶液6次得到丁酸的色譜峰面積計算RSD，見表5。

根據RSD 計算公式可得，6 次連續進樣，以丁酸為代表獲得RSD為0.185%。結果表明該氣相色譜分析方法精密度優良。

2.3.1.2 菌株培養液中的酸種類及含量對比

將培養6 d的培養液通過前處理，并使用氣相進行定性及定量分析，菌株產酸種類及產量見表6。

2.3.2 菌株生物學性能比較（見表7）

表7 菌株生物學性能比較

由表7可知，兩株菌的生物量無明顯差異，菌株J-1的生孢率比菌株J-2高17.16%，菌株J-1產生的淀粉酶活性高于菌株J-2。益生菌在腸道內產生的淀粉酶可將碳水化合物降解為低聚糖，促進益生菌對碳源的利用。研究表明，菌株J-1生物學性能最優。

3 討論

3.1 丁酸梭菌的分離、鑒定分析

丁酸可降低環境的pH值，改變菌群的生長環境，影響其他菌群的生長繁殖，維持腸道菌群的平衡，改善腸道消化吸收功能。目前，大部分丁酸梭菌分離自人的腸道和土壤，來自白酒窖泥中的丁酸梭菌較少。白酒釀造過程中丁酸梭菌的含量以及發酵分泌物可在一定程度上影響白酒風味，將其應用于飼料中不僅具備良好的整腸作用，還能夠起到一定的風味調整作用，增強飼料的益生價值[18-20]。本研究從濃香型白酒窖泥中篩選出15 株形態各異的菌株，最終選擇兩株菌株，通過生理生化鑒定和16S rRNA測序比對，確定其為丁酸梭菌。系統發育樹分析發現，兩株分離株與酪丁酸梭菌種屬關系最近。

3.2 丁酸梭菌產酸量分析

丁酸梭菌代謝產物中含有大量丁酸、乳酸等物質，這些物質可促進雙歧桿菌和乳酸菌等益生菌生長，抑制金黃色葡萄球菌、傷寒沙門桿菌、霍亂沙門桿菌等致病微生物的生長，在動物腸道中發揮巨大作用[21-22]。丁酸梭菌代謝產生的丁酸、蛋白酶、維生素、抗菌肽物質等物質可提高機體的消化功能，增強免疫系統，清理腸道中的有毒物質，提高腸道抗病能力[23]。本研究篩選得到的菌株J-1丁酸產量可達411.7 mg/L，為后續優化發酵培養基及培養條件以提高丁酸產量提供試驗基礎。

3.3 丁酸梭菌制劑的腸道益生性分析

目前，丁酸梭菌制劑被廣泛應用于畜牧業中[24]。丁酸梭菌作為飼料添加劑，具有促進機體腸道有益菌群增殖，抑制有害菌群生長繁殖的保健功能，食用添加丁酸的飼料可使畜禽獲得更高的營養價值并提高免疫力，為腸道上皮組織細胞的再生和修復提供營養物質，改善腸道形態和結構，抑制機體炎癥反應，增強動物機體免疫力以及抗氧化等生物學功能[25-26]。丁酸梭菌在生長過程可形成芽孢，在最終商品化的菌劑中，活菌大多以芽孢的形式存在，而非芽孢形態的菌制劑不具備耐藥性[27]。因此，提高丁酸梭菌在發酵過程中的菌體數量以及菌體形成芽孢的條件與配方進行一系列研究對其在飼料中應用具有重要意義。本研究中，菌株J-1 的生孢率為77.64%，可為后續提高生孢率提供參考

4 結論

本研究從窖泥中篩選獲得菌株J-1、菌株J-2，經形態學觀察、生理生化試驗、分子生物學鑒定，確定菌株為丁酸梭菌。對兩株丁酸梭菌進行生物學性能對比，菌株J-1在產酸種類及含量、活菌數、芽孢率、淀粉酶活性等方面均明顯優于菌株J-2，可作為菌制劑儲備菌株。