發酵餌料對中華圓田螺生長性能和腸道菌群的影響

孫 濤 陳李婷 鄧小紅 樊薈慧 陳 靜 賓石玉，3

（1.廣西師范大學生命科學學院，廣西 桂林 541006；2.廣西全州縣水產技術推廣站，廣西 桂林 541500；3.廣西師范大學 珍稀瀕危動植物生態與環境保護教育部重點實驗室，廣西 桂林 541006）

動物腸道健康狀況與腸道菌群的穩態關系密切，腸道菌群變化直接影響動物腸道對飼料營養物質的消化、吸收與代謝，進而影響動物的生產性能。與常規飼料相比，發酵飼料經過微生物分解形成了豐富的次級代謝物，可以提高飼料利用率，具有降低畜禽疾病、提高免疫力、改善畜禽養殖環境等作用[1]。在豬[2]、蛋鴨[3]、肉雞[4]等畜禽中的研究中發現，發酵飼料能夠促進腸道健康，調節腸道菌群結構。中華圓田螺（Cipangopaludina cahayensis）俗稱田螺，是一種生活在淡水中的雜食軟體動物，生長繁殖迅速，尤其喜歡餌料豐富、土質柔軟的稻田環境。田螺肉味道鮮美，含有豐富的蛋白質及多種微量元素，營養價值高[5-6]，是我國稻田養殖的重要水產品種之一[7]。近年來，隨著稻螺綜合種養產業化發展，僅靠稻田天然餌料養殖，田螺的養殖效益難以得到有效提升。因此，如何提高規模化養殖田螺的生長速度和產量成為研究的熱點[8]。研究表明，以米糠為主要原料配制的發酵餌料能夠促進田螺生長，提高田螺養殖經濟效益[9]。但目前關于田螺發酵餌料的研究較少。本研究以中華圓田螺為研究對象，探討發酵餌料對其生長和腸道菌群的影響，為田螺發酵餌料的開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中華圓田螺由柳州市谷之韻農業發展有限公司里提供，發酵菌液（植物乳酸桿菌、釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌比例為1.5∶1.0∶1.0）由廣西科技大學提供。

發酵餌料配制：按照基礎餌料∶菌液比為5∶1將發酵菌液加入基礎餌料中，攪拌均勻，28 ℃恒溫培養箱中發酵7 d，4 ℃冰箱保存。發酵餌料的有效活菌數為1.02×1011CFU/kg，基礎餌料組成及營養水平見表1。

表1 基礎餌料組成和營養水平（風干基礎） 單位：%

1.2 試驗設計與飼養管理

選擇約25 g 的中華圓田螺60 只，隨機分為2 組，每組3 個重復，每個重復10 只螺。將田螺分別放入塑料養殖盆中，水量為浸沒過螺5 cm，保持25 ℃室溫。每天8：00、20：00 投喂餌料，投喂量為田螺體重的0.05%，每次投喂前用清水沖洗養殖盆，保持潔凈。A 組和B 組田螺分別飼喂基礎餌料和發酵餌料。試驗期20 d。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 樣品采集與處理

2.3.1 發酵餌料對中華圓田螺腸道門水平相對豐度的影響（見表4）

在新一代技術融合圖書館服務的實踐中，手機技術是應用廣泛而投入較小的。我團隊于2016年與本地一家公司合作，圍繞紙質圖書服務設計了10多種功能，實施效果良好。基于此，該項目在2018年6月獲得了全國高校應用案例二等獎。

1.3.3.2 建庫測序

隨著電力系統日益龐大，邊界條件增多，運行方式日趨復雜，其動態運行的非線性遞增，出現大停電的可能性在上升，應該考慮大停電事件出現后的應對措施。而大力發展分布式能源及能源互聯網是應對大停電事件技術防范的重要舉措。當然，還應考慮停電時天然氣輸送系統的正常運行和天然氣分布式能源黑啟動的技術配備，真正起到應急作用。

式中：W0為初重（g）；Wt為末重（g）；t為飼養天數（d）；Nt為終末只數；N0為初始只數；Wf為餌料攝入量（g）；Wp為餌料蛋白質含量（%）。

1.3.3 高通量測序

1.3.3.1 樣品DNA提取

利用糞便DNA提取試劑盒進行提取，具體步驟參照試劑盒的說明書進行操作。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop One微量核酸蛋白濃度測定儀檢測DNA的完整性、濃度和純度。

從表2可以看出，存在亞健康狀況的學生中膀胱能量阻滯的現象比較少見，主要存在的問題是能量不足，其中男生11人，女生26人，占亞健康總人數的74%.膀胱能量不均衡的人容易出現背部疼痛、小便異常的現象，情況嚴重者還可能出現記憶力減退的狀況.

1.3.2 生長性能

由表5可知，中華圓田螺腸道排名前5的菌屬為變形菌屬、擬桿菌屬、厚壁菌屬、軟壁菌屬和衣原體。與A組相比，B組中華圓田螺豐度前5菌屬的相對豐度均有提高，其中厚壁菌屬和衣原體顯著提高（P＜0.05）。

1.4 數據統計與分析

將測序得到的原始數據進行質控、過濾、去嵌合體，得到有效數據?；谟行祿M行OTU 劃分和物種注釋，得到對應的物種信息和豐度情況，并作物種多樣性及組間差異分析。

財務預算管理的全面實施需要企業能夠制定出有效、詳細的可實施方案，方案中要包含具有的實施步驟以及相應的考評機制，通過合理、科學的財務指標對實施的結果進行評價，以此來確保預算的及時性和高效性。通過預算控制還能夠避免員工工作積極性不高的問題，通過對國有企業所有管理者、員工進行考評，從而來刺激其工作的積極性。

試驗數據采用SPSS 20.0統計軟件進行單因素方差分析，Duncan's 法進行多重比較。結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 發酵餌料對中華圓田螺生長性能的影響（見表2）

表2 發酵餌料對中華圓田螺生長性能的影響

由表2 可知，兩組田螺的成活率均為100%。與A 組相比，B 組田螺的WGR、SGR 和PER 均有所提高，FCR降低（P＞0.05）。

2.2 發酵餌料對中華圓田螺腸道內容物測序序列及OTU的影響（見表3）

表3 發酵餌料對中華圓田螺腸道內容物測序序列及OTU的影響

由表3 可知，通過高通量測序得到有效序列共375 141 條，序列長度范圍為416～455 bp。將有效序列進行聚類并劃分，對OTU進行統計，發現各組樣品的OTU覆蓋率均在99.9%以上，表明該測序能夠真實反映各組樣品的微生物組成。

2.3 發酵餌料對中華圓田螺腸道菌群組成的影響

試驗結束后禁食24 h，每個重復分別進行計數和稱重，統計餌料用量。每個重復田螺在無菌環境下解剖，取腸道內容物置于無菌袋中，液氮中速凍，-80 ℃保存。

試驗開始和結束，統計田螺的數量及重量，計算增重率（WGR）、特定生長率（SGR）、餌料系數（FCR）、蛋白質效率（PER）和成活率（SR）。

表4 發酵餌料對中華圓田螺腸道門水平相對豐度的影響 單位：%

腸道微生物物種分析顯示，所有樣品中發現微生包含32個門、54個綱、142個目、214個科、397個屬。

快遞市場魚龍混雜，與快遞業法規建設和標準制定滯后有一定關系，雖然2008年國內首個《中華人民共和國郵政行業標準》出臺，由于《標準》是推薦性的，并不具備法律強制力約束，多數快遞企業采取對其“視而不見”的態度，僅僅一部行業標準是遠遠不夠的，應通過各種形式和各種方式向政府、人大及社會公眾發出建言建議，促使人大、政府出臺相關的實施細則等法律法規，進一步規范和引導快遞行業。

由表4 可知，通過聚類分析及物種注釋發現，A 組、B組田螺腸道豐富度最高的前6個細菌門類依次為變形菌門、擬桿菌門、浮霉菌門、酸桿菌門、放線菌門和綠彎菌門，占總OTU 數的85%～89%。在門分類水平上，A 組、B 組田螺腸道菌門的相對豐富差異均不顯著（P＞0.05）。

煤礦業中使用防爆柴油機無軌膠輪車時，要進行嚴格的檢驗。檢測項目要做到主次分明，有重要項目，有次要項目，要嚴格遵守檢測標準，采用先進儀器設備，針對重點項目細致檢測。另一方面，防爆柴油機無軌膠輪車的安全生產檢測，不僅能快速發現安全隱患，又能夠加強無軌膠輪車的運輸監管力度，預防危險事故的發生。最后，開展安全性能檢測，不僅可以預防煤礦業工程作業過程中出現意外事故，而且可以為實施單位帶來巨大經濟效益、社會效益，發展前景良好。

2.3.2 發酵餌料對中華圓田螺腸道屬水平相對豐度的影響（見表5）

表5 發酵餌料對中華圓田螺腸道屬水平相對豐度的影響單位：%

提取樣品總DNA 后，根據16S rDNA V4-V5 區設計得到前端引物序列為-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，后端引物序列為-GGACTACNVGGGTWTCTAAT。在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增。采用GeneTools AnalysisSoftware 對PCR 產物進行純化、定量和均一化，形成測序文庫，質檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500高能量測序平臺進行測序，測序工作在廣東美格基因科技有限公司完成。

能源供需情況：2020年、2025年和2030年的能源需求缺口分別為4 225萬tce、6 615萬tce和 10 215 萬tce，能源缺口不斷增大。

2.4 發酵餌料對中華圓田螺對腸道菌群Alpha 多樣性的影響（見表6）

表6 發酵餌料對中華圓田螺對腸道菌群Alpha多樣性的影響

Chao1指數數值越大，物種越豐富；Simpson 數值越大，物種多樣性越高。

采用時長T對機會通信產生的連續數據進行切片,生成一系列離散的拓撲快照圖,時長T的大小對實驗結果的精度有很大的影響,T值的選取是切片的關鍵.

由表6 可知，B 組腸道菌群的OTU 數量、Chao1 指數、Simpson 指數均高于A 組（P＞0.05），表明投喂發酵餌料提高了中華圓田螺腸道微生物群落多樣性和豐度。

3 討論

3.1 發酵餌料對中華圓田螺生長性能的影響

生長性能是評價發酵飼料營養狀況及經濟效益的重要指標。研究表明，發酵飼料能夠提高飼糧的營養價值，改善適口性，促進動物采食，提高動物生長性能。原因是發酵過程中添加的菌種能夠改善動物腸道菌群，且在代謝過程中產生多種營養物質（如氨基酸、蛋白質和有機酸等）[10-11]，可以改善餌料品質，激活淀粉酶、蛋白酶等與碳水化合物和蛋白質代謝相關的消化酶，加快魚、蝦對營養物質的消化吸收[12-13]，進而提高生長性能。本試驗研究發現，發酵餌料組中華圓田螺的WGR、SGR、PER 和FCR 均高于對照組，表明發酵餌料在一定程度上促進了中華圓田螺的生長。有研究表明，厚壁菌門在腸道中的主要作用是促進碳水化合物和蛋白質水解[14]，因此推測投喂發酵餌料提高了腸道中厚壁菌門微生物豐度，從而對營養消化吸收具有一定的促進作用，提高了田螺的生長性能。

3.2 發酵餌料對中華圓田螺腸道菌群的影響

本研究對中華圓田螺腸道菌群的V4～V5 區進行擴增測序，得到的序列片段長度在416.28～454.99 bp 范圍內，符合該區域的片段要求，并獲得大量有效信息序列；基于OTU在門水平的分類表明，中華圓田螺腸道菌群包含32 個門、54 個綱、142 個目、214 個科、397 個屬，其中豐富度最高的是變形菌門和擬桿菌門，結果與大部分水產動物腸道微生物豐度相似。變形菌門是許多淡水及海水魚類腸道菌群中非常豐富的門[15]。鱘魚[15]的前腸道菌群中變形菌門豐度高達75%。牛蛙[16]腸道菌群中，梭桿菌門、厚壁菌門和變形菌門豐度占99%以上。日本沼蝦[17]的腸道微生物中變形菌門豐度最高，其次是厚壁菌門。日本鰻鱺[18]腸道中的變形菌門和厚壁菌門豐度最高。目前關于水產動物腸道菌群的相關研究較少。本研究結果可為淡水螺類腸道微生物研究提供了一定參考，對田螺餌料開發、飼養環境的選擇、消化病理研究具有一定的參考價值。

腸道菌群是數量和種類非常龐大的微生物群體，在維持正常的消化吸收、免疫防御等功能中具有重要作用。在具體功能上，有研究表明變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門能夠分泌促進消化的酶[19]，放線菌能夠在一定程度上影響生物的生理與代謝[20-21]。而腸道菌群的相對豐度高則利于維持腸道微生物菌群穩態，進而促進腸道健康，有利于提高生長性能[13]。本研究中，與基礎餌料組相比，發酵餌料組的OTU 數目、Chao1 指數、Simpson指數均得到提高，表明發酵餌料更利于提高中華圓田螺的腸道微生物豐度，推測發酵餌料對促進中華圓田螺腸道健康具有一定的積極作用；在兩組的豐度前5的細菌組成對比中發現，發酵餌料組中華圓田螺腸道中優勢菌屬變形菌屬、擬桿菌屬、厚壁菌屬、軟壁菌屬和衣原體的相對豐度均提高，其中厚壁菌和衣原體顯著提高。

4 結論

在本試驗條件下，與未發酵基礎餌料相對比，發酵餌料可以提高中華圓田螺的生長性能、腸道微生物群落的多樣性和豐度。