G-MDSCs及HO-1對異基因造血干細(xì)胞移植后患者發(fā)生急性移植物抗宿主病的預(yù)測價值*

陳璐, 倪明, 王力, 潘成云, 亢倩, 詹雲(yún), 趙鵬, 王季石,3***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科, 貴州 貴陽 550001; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院, 貴州 貴陽 550004; 3.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 國家血液病臨床研究中心, 江蘇 蘇州 215006)

目前,異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)仍是多種常規(guī)療法無法治愈的血液系統(tǒng)疾病的唯一有效選擇[1-3]。allo-HSCT后可發(fā)生多種并發(fā)癥,其中移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GvHD)發(fā)生率高,嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量,甚至導(dǎo)致患者死亡[3-5]。如今,以細(xì)胞治療為基礎(chǔ)的抗急性GvHD(acute GvHD,aGvHD)療法已取得了一定的進(jìn)展[6],調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs)、免疫耐受性樹突狀細(xì)胞(tolerogenic dendritic cells, tDCs)及間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stromal cells, MSCs)均在aGvHD動物模型或Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)中展示出一定的療效[7]。髓系來源的抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是病理激活的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞,該群細(xì)胞具有強(qiáng)大的免疫抑制活性,在加速腫瘤進(jìn)展和破壞抗癌治療效果方面發(fā)揮著重要作用[8]。雖然已經(jīng)觀察到人類MDSCs與GvHD之間的臨床相關(guān)性[9],但無實(shí)際數(shù)據(jù)可以確定人MDSCs是否可在體內(nèi)預(yù)防和/或控制GvHD。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)屬于應(yīng)激蛋白家族[10],可對缺氧、細(xì)胞因子等刺激作出反應(yīng)[11],并誘導(dǎo)免疫耐受[12]。本課題組前期研究結(jié)果顯示,Ⅲ～Ⅳ aGvHD患者的HO-1表達(dá)明顯低于未發(fā)生aGvHD患者,提示氧化應(yīng)激分子HO-1可能有助于控制aGvHD[13-14]。然而,HO-1如何降低患者aGvHD的發(fā)生風(fēng)險目前尚不清楚,因此本研究擬通過分析all-HSCT后病人不同時間點(diǎn)的新鮮外周血、探討粒細(xì)胞的-MDSCs(granulocytic-MDSCs,G-MDSCs)及胞內(nèi)HO-1、白細(xì)胞介素10(interleukin-10, IL-10)等細(xì)胞因子對aGvHD發(fā)病的預(yù)測作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1樣本來源及分組 選取2021 年9月—2023 年1月allo-HSCT術(shù)后患者29例,要求符合初次確診、術(shù)前接受清髓治療及預(yù)計(jì)生存時間大于3個月,排除行自體造血干細(xì)胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation, AHSCT)術(shù)患者及傳染性疾病(如乙肝、梅毒、艾滋病等)患者。取新鮮外周血(未過夜)作為標(biāo)本來源。本研究已根據(jù)《赫爾辛基宣言》獲得了病人以及供者的知情同意。

1.1.2主要試劑及儀器 抗分化簇14抗體(anti-cluster of differentiation 14, anti-CD14)、抗人類白細(xì)胞抗原DR抗體(anti-human leukocyte antigen-DR, anti-HLA-DR)、抗分化簇11b抗體(anti-cluster of differentiation 11b, CD11b)及IL-10(anti-IL-10)抗體(美國Thermo Fisher Scientific公司),抗分化簇33抗體(anti-cluster of differentiation 33, anti-CD33)、紅細(xì)胞裂解液及細(xì)胞破膜液均為美國BD Biosciences公司),抗HO-1(anti-HO-1)抗體(英國abcam公司),流式細(xì)胞計(jì)數(shù)微球(美國BioLegend公司),5 g/L牛血清白蛋白(protein standard solution, BSA;北京索萊寶科技有限公司),1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS;中國蘭杰柯科技有限公司);5 mL流式試管(墨西哥FALCON公司),流式細(xì)胞儀(BD FACSLyricTMFlow Cytometer,美國BD Biosciences公司),牛血清白蛋白(protein standard solution, BSA;北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1一般臨床資料及aGvHD的診斷 收集患者性別、年齡、疾病診斷[急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)、急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoid leukemia,ALL)、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes,MDS)、再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)及非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin lymphoma, NHL)]、術(shù)前預(yù)處理方案[白消安/環(huán)磷酰胺(busulfan/cyclophosphamide,Bu/Cy)、抗胸腺細(xì)胞球蛋白(anti-thymocyte globulin,ATG)、阿扎胞苷(azacitidine,AZA)、伊達(dá)比星(idarubicin,IDA)、美法侖(melphalan, Mel)、依托泊苷(etoposide,VP16)、氟尿嘧啶 (fluorouracil,Flu)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)、環(huán)孢霉素(cyclosporine,Cs)及霉酚酸酯(mycophenolate mofetil,MMF)]、排異預(yù)防、感染及復(fù)發(fā)情況等一般資料;結(jié)合患者移植治療過程中臨時與長期醫(yī)囑以及對應(yīng)病程,參照1974年西雅圖分級標(biāo)準(zhǔn)[15]判斷患者是否發(fā)生aGvHD及其程度。

1.2.2血標(biāo)本抽取 抽取病例組患者移植完成后第2、3、4、6、8周及第3個月等6個時間點(diǎn)的空腹新鮮外周血。

1.2.3全血活細(xì)胞中G-MDSCs表面抗原染色 取“1.2.2”項(xiàng)下新鮮外周血加入FACS試管中,加含有1% BSA的FACS Buffer 500 μL,2 000 r/min離心5 min,重復(fù)操作洗滌細(xì)胞2遍;取出FACS Tube,吸取上層懸液,含有5% BSA的Blocking Buffer 50 μL重懸細(xì)胞,同步細(xì)胞表面抗原封閉15 min;避光,往FACS Tube內(nèi)加G-MDSCs表面標(biāo)記抗體CD14、HLA-DR、CD11b、CD33各1 μL,避光孵育15～20 min;抗體孵育結(jié)束,加FACS Buffer 1 mL洗滌上述細(xì)胞1次,離心時間、轉(zhuǎn)速、溫度等條件同前。采用BD FACSLyricTM流式上機(jī)檢測G-MDSCs的百分比和絕對值計(jì)數(shù)。

1.2.4HO-1與IL-10的表達(dá) 取“1.2.2”項(xiàng)下新鮮外周血,采用破膜染色檢測G-MDSCs中氧化應(yīng)激蛋白HO-1[14]及經(jīng)典免疫抑制因子IL-10[16]的表達(dá),使用熒光減一對照(fluorescence minus one control, FMO control)確保染色的可靠性,即在對照管中加入除anti-HO-1及anti-IL-10之外的其他抗體作為染色對照組。

1.2.5G-MDSCs膜內(nèi)抗原HO-1、IL-10破膜染色 取“1.2.3”項(xiàng)下表面抗原染色完畢后細(xì)胞,往FACS Tube中加稀釋后的Lysing Solution(1×)1 mL裂解,避光10 min;2 000 r/min離心5 min,收獲細(xì)胞,FACS Buffer 500 μL洗滌細(xì)胞;FACS Tube中加稀釋后的Permeabilization Solution (1×)500 μL破膜,置于暗環(huán)境15 min;2 000 r/min離心5 min,收獲細(xì)胞,FACS Buffer 500 μL洗滌細(xì)胞;往收獲的細(xì)胞中加Blocking Buffer重懸細(xì)胞,室溫避光15 min;加G-MDSCs膜內(nèi)標(biāo)記抗體HO-1 和IL-10各1 μL,避光孵育30 min,同時開啟BD FACSLyricTM備用;抗體孵育結(jié)束,將裝有Precision Count Beads的試劑瓶置于XH-C旋渦混合器上振蕩30 s～1 min,吸取25 μL于FACS Tube中用于計(jì)算各細(xì)胞群體絕對值數(shù)目;加FACS Buffer或0.9%氯化鈉注射液1 mL 后上機(jī)檢測得中位熒光強(qiáng)度(median fluorescence intensity, MFI)、表達(dá)百分比及絕對值計(jì)數(shù)等。

1.2.6流式數(shù)據(jù)分析 取“1.2.5”項(xiàng)下表面抗原染色及破膜染色完畢的細(xì)胞,采用Flowojo 10.6.2(美國 BD Bioscience 公司)軟件進(jìn)行流式數(shù)據(jù)分析,詳細(xì)分析策略見圖1。首先圈選活細(xì)胞,隨后對其表型進(jìn)行分析,尋找G-MDSCs;通過圈選絕對值計(jì)數(shù)微球?qū)-MDSCs進(jìn)行計(jì)數(shù)。

注:(1)表示Precision Count Beads,(2)表示活細(xì)胞群體;SSC-A/FSC-A后流式框選在(2)基礎(chǔ)上展開。圖1 CD14-HLA-DR-CD11b+CD33midG-MDSCs、HO-1及IL-10流式分析策略Fig.1 Strategy analysis of CD14-HLA-DR-CD11b+CD33midG-MDSCs, HO-1, and IL-10

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以 [n(%)]表示,數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn);運(yùn)用Mann Whitney秩和檢驗(yàn)及兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較計(jì)量資料;以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

allo-HSCT術(shù)后患者分為有aGvHD組(n=15)和無aGvHD組(n=14),2組患者性別、年齡、疾病診斷類型、是否外周血來源、預(yù)處理方案、aGvHD預(yù)防方案、是否發(fā)生感染及復(fù)發(fā)等一般臨床資料,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1)。allo-HSCT患者術(shù)后發(fā)生aGvHD的平均天數(shù)為42.5(11,139)d,aGvHD分度0、Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ分別為0、2、7及5例,累及皮膚、胃腸道、肝臟及未知部位分別為12、11、12及1例。

表1 有aGvHD組和無aGvHD組allo-HSCT術(shù)后患者的臨床特征Tab.1 Clinical characteristics after allo-HSCT in aGvHD group and non-aGvHD group

2.2 G-MDSCs水平

2組患者allo-HSCT后第2周于外周血中檢測到G-MDSCs,且在第4周時有aGvHD組病人G-MDSCs的百分比及絕對值計(jì)數(shù)均高于無aGvHD組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2)。

注:A為百分比,B為絕對值計(jì)數(shù);(1)與無aGvHD組比較,P<0.05。圖2 有aGvHD組和無aGvHD組allo-HSCT術(shù)后患者不同時間點(diǎn)G-MDSCs的水平Fig.2 Expressions of G-MDSCs in patients with aGvHD and without aGvHD after allo-HSCT at different time points

2.3 HO-1和IL-10的表達(dá)

結(jié)果顯示,HO-1及IL-10對照管表達(dá)均在0附近,但HO-1組實(shí)驗(yàn)管峰值較對照管明顯右移(范圍103～104),IL-10組實(shí)驗(yàn)管峰大約位于0～104且較對照管右移。見圖3。

圖3 allo-HSCT術(shù)后患者G-MDSCs中HO-1與IL-10的表達(dá)(FMO染色)Fig.3 Expressions of HO-1 and IL-10 in G-MDSCs of patients after allo-HSCT (FMO staining)

2.4 HO-1表達(dá)的百分比、MFI及絕對值計(jì)數(shù)

在allo-HSCT后第4周時有aGvHD組病人G-MDSCs中HO-1表達(dá)的百分比、MFI及絕對值計(jì)數(shù)均高于無aGvHD組,其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注:A為表達(dá)百分比,B為MFI,C為絕對值計(jì)數(shù);(1)與無aGvHD組比較,P<0.05。圖4 有aGvHD組和無aGvHD組allo-HSCT術(shù)后患者不同時間點(diǎn)G-MDSCs中HO-1的水平Fig.4 Expressions of HO-1 in G-MDSCs of patients with aGvHD and without aGvHD after allo-HSCT at different time points

3 討論

aGvHD是allo-HSCT后典型且嚴(yán)重并發(fā)癥,其發(fā)病機(jī)制至今仍不明確。以往研究認(rèn)為,人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)不合引起的同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞激活及隨后造成的靶器官損傷是aGvHD的主要病理生理過程,在同胞全相合異基因移植中GvHD發(fā)生率為30%～50%,而在無關(guān)供體異基因移植中發(fā)生率高達(dá)70%[17];發(fā)生重度aGvHD的約占無關(guān)供體移植患者的50%,重度aGvHD患者5年存活率不到20%[18]。因此,對allo-HSCT患者進(jìn)行GvHD的預(yù)防及治療是提高患者長期生存率及改善生存質(zhì)量的關(guān)鍵。MDSCs是一類維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞群體,正常人體內(nèi)均有存在[19-20]。當(dāng)機(jī)體在處于應(yīng)激及出現(xiàn)炎癥反應(yīng)等病理狀態(tài)時,體內(nèi)免疫細(xì)胞被激活,此時MDSCs比例增多以控制自身過度反應(yīng)的免疫狀態(tài)[21-22]。目前,不論是在腫瘤的免疫逃逸研究領(lǐng)域,還是在allo-HSCT背景下的免疫耐受,MDSCs都是科學(xué)研究之熱點(diǎn)。

為從多層面探討MDSCs可能在aGvHD發(fā)生發(fā)展中參與的作用,在移植后不同時間點(diǎn)對患者的外周血進(jìn)行免疫監(jiān)測時加入了CD14-HLA-DR-CD11b+CD33midG-MDSCs的絕對數(shù),從而使得數(shù)據(jù)不僅僅有描述細(xì)胞間相對數(shù)量關(guān)系的百分比,也可以憑借絕對數(shù)描述患者外周血中G-MDSCs的數(shù)量。結(jié)果顯示,患者G-MDSCs水平高于正常人,隨著時間的延長逐漸下降,印證了移植后早期免疫重建中大量不成熟粒細(xì)胞中有較多G-MDSCs的猜想,這也提示了G-MDSCs在移植后早期患者中的表達(dá)具有一定的異質(zhì)性。Wang等[23]報道了在異基因骨髓移植受者小鼠模型中,移植后MDSCs的比例明顯升高,隨后會逐漸下降至未行骨髓移植的對照組水平;也有研究顯示,allo-HSCT后第28天時擁有高百分比(P=0.025 7)和高絕對數(shù)(P=0.011 1)G-MDSCs的患者隨后發(fā)生aGvHD的風(fēng)險較高,提示高水平的G-MDSCs可能對aGvHD發(fā)生有預(yù)測作用;林毓等[19]利用小鼠建立不同嚴(yán)重程度的aGvHD模型,發(fā)現(xiàn)移植后2周各組小鼠外周血及脾臟中MDSCs及各亞群的比例均處于較高水平,但移植后4周無aGvHD組小鼠外周血和脾臟MDSCs及其各亞群水平下降,輕度及中重度aGvHD組小鼠MDSCs比例仍保持在較高水平,脾臟MDSCs比例與aGvHD的嚴(yán)重程度呈正相關(guān),中重度組比例較輕度組更高,表明了小鼠異基因骨髓移植后aGvHD可誘導(dǎo)脾臟MDSCs的聚集,且與aGvHD嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一致之處。因此,有理由認(rèn)為allo-HSCT術(shù)后隨著患者免疫重建的進(jìn)行,其機(jī)體內(nèi)各免疫細(xì)胞逐漸趨于成熟,G-MDSCs表達(dá)百分率逐漸降低;但發(fā)生aGvHD后G-MDSCs的表達(dá)量明顯升高。因此,allo-HSCT后G-MDSCs的延遲降低可能標(biāo)志著患者體內(nèi)存在尚無明顯臨床癥狀的炎癥,因而有較高發(fā)生aGvHD的風(fēng)險。

HO-1是一種氧化應(yīng)激標(biāo)志物[14],已有研究表明其在誘導(dǎo)由細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen species, ROS)積累引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)通路相關(guān)基因表達(dá)中起作用[24-25]。為進(jìn)一步深入分析G-MDSCs的變化與機(jī)體炎癥反應(yīng)間的關(guān)聯(lián)性,本研究對allo-HSCT后患者不同時間點(diǎn)外周血標(biāo)本中G-MDSCs進(jìn)行了破膜染色,觀察其胞內(nèi)HO-1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,有aGvHD組allo-HSCT后患者G-MDSCs中HO-1的表達(dá)百分比、絕對數(shù)及MFI均高于無aGvHD組患者,提示盡管此時患者無明顯aGvHD癥狀,但其體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)已處于較高水平,免疫系統(tǒng)處于較強(qiáng)的激活狀態(tài),因此有較高aGvHD發(fā)生風(fēng)險。IL-10是一類經(jīng)典的并具有抗炎特性的細(xì)胞因子,在預(yù)防炎癥及病態(tài)自身免疫中起到重要作用[26-28];IL-10可通過限制機(jī)體對病原體的免疫應(yīng)答,進(jìn)而防止宿主受到損傷,在感染中發(fā)揮核心作用[29];也是MDSCs發(fā)揮免疫抑制作用的機(jī)制之一[30]。然而,在allo-HSCT后患者外周血G-MDSCs中并未觀察到 IL-10的大量表達(dá),其原因還需后續(xù)行轉(zhuǎn)錄組測序等來進(jìn)一步探明。

綜上所述,本研究描述了G-MDSCs在allo-HSCT后患者3月內(nèi)的變化趨勢,并對移植后早期G-MDSCs的免疫重建過程這一新興研究領(lǐng)域進(jìn)行了探討,結(jié)果表明G-MDSCs及HO-1可能是allo-HSCT后患者aGvHD發(fā)生的預(yù)警標(biāo)志,同時也可以反映患者體內(nèi)的炎癥水平。