苗藥桿努盡煙對慢性阻塞性肺疾病大鼠糖皮質激素耐藥作用的分子機制*

占雅婷, 雷昆彧, 劉嬌嬌, 吳寧*

(貴州醫科大學 基礎醫學院化學與生物化學實驗室, 貴州 貴陽 550025)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是目前世界上影響人類生活質量的4大慢性病之一[1-2]。糖皮質激素(glucocorticoid, GC)作為一種高效的抗炎藥物,廣泛應用于COPD的臨床治療,但部分病人出現了不敏感現象而導致療效不佳[3]。近年來隨著對GC藥物耐藥機制研究的不斷深入,P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase, P38MAPK)信號通路被認為在GC抵抗中承擔不可或缺的橋梁作用,相關的上下游因子及基因位點參與調控GC抵抗[4-7]。一方面,P38MAPK信號通路與GC受體(GC receptor, GR)相互調節介導炎癥因子的激活[8];另一方面,P38MAPK信號通路影響GC對GR的敏感性[9-13]。近年來,植物化學物質和傳統化療藥物的組合療法逐漸應用于COPD患者的耐GC治療,且有一定的療效[14]。桿努盡煙是貴州苗族地區治療COPD的傳統藥物,應用歷史悠久、療效獨特、毒副作用小,尚處于經驗用藥階段[15]。課題組前期研究已經證明,桿努盡煙可通過調節P38MAPK上游的Toll樣受體4-髓樣分化因子88(toll-like receptor4-myeloid differentiation factor88, TLR4-MyD88)介導相關炎癥通路,減少炎癥因子的分泌,降低氣道炎癥反應[16-19]。本研究采用桿努盡煙、地塞米松及兩者聯合用藥對COPD大鼠進行對比治療,觀察大鼠肺組織的病理變化、白細胞介素-2(interleukin-2, IL-2)含量及P38MAPK、熱休克蛋白90(heat shock protein90, HSP90)、GR-α mRNA及蛋白質的表達,探究苗藥桿努盡煙對COPD大鼠GC治療的敏感性的潛在作用機制,為該藥的開發利用提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物及藥物來源 50只清潔Specific Pathogen Free(SPF)級、7～8周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠,雌雄各半,體質量(200±20)g,由學校動物中心提供[SYXF(黔)2018-0001];桿努盡煙全草采摘于凱里市爐山鎮,經貴州省中醫藥大學潘爐臺教授鑒定屬植物吊石苣苔(LysionotusPauciflorusMaxim.),地塞米松磷酸鈉注射液(貴州天地藥業,國藥準字H52020477)。

1.1.2主要試劑及儀器 遵義牌香煙,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS;美國Sigma),熱休克蛋白90(heat shock protein, HSP90)兔抗大鼠一抗、β-action(華安生物),GR-α兔抗大鼠一抗、P38MAPK兔抗大鼠一抗,辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)二抗(美國Bioworld公司);實時熒光定量PCR儀(美國ABI stepone plus),超微量紫外可見光分光光度計(美國ThermoNanoDrop/ND2000),BOX F3凝膠成像系統(英國Syngene/G),RA-2000全自動生化分析儀(美國Technicon),渦旋震蕩儀(美國Scientific Industries),高壓消毒鍋(日本HIRAYAMA),臺式高速離心機(美國Thermo),超速離心機(美國Optima XPN-100)。

1.2 實驗方法

1.2.1苗藥桿努盡煙水提液的制備 SD大鼠與人用藥體表面積換算得需制取8 g/kg的桿努盡煙水提物。稱取桿努盡煙全草1 kg,紗布包裹,置于恒溫水浴箱,水至淹沒藥材,90 ℃連續提取10 h;收集、過濾、旋蒸水提液,濃縮成1 kg/L的桿努盡煙水提物,分裝藥液于4 ℃冰箱儲藏[19]。

1.2.2大鼠分組及COPD大鼠模型的建立 SD大鼠采用隨機分為對照組、模型組、桿努盡煙組、地塞米松組及聯合用藥組,10只/組,適應性飼養14 d,對照組置于正常無煙環境中常規飼養,后4組大鼠置于自制被動吸煙染毒箱(50 cm×40 cm×30 cm,上壁留有通氣孔、將10 mL針筒改裝為體外吸煙裝置),采用煙熏結合LPS氣管注射法復制COPD大鼠模型[20-21];造模需28 d,第1天和第14天以8%水合氯醛(0.05 mL/kg)腹腔內注射麻醉大鼠,氣道內注射200 g/L LPS溶液0.2 mL,當天不予香煙煙熏,其余時間煙熏30 min/次(每箱放置4個進煙口),2次/d、早晚各1次;造模結束后,每組取2只大鼠肺部標本制作蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)切片,在光學顯微鏡下,觀察完整的中小支氣管橫斷面,切片見部分支氣管、肺泡壞死,上皮細胞壞死脫落于管腔,胞核溶解,壞死區見炎性細胞浸潤,以淋巴細胞為主,伴少量纖維組織增生,提示造模成功[22]。

1.2.3給藥干預 各組大鼠適應性喂養14 d、開始造模時即給予干預:對照組大鼠不作任何處理,正常飼養;模型組大鼠用生理鹽水灌胃,1次/d、2 mL/只,共28 d;桿努盡煙組大鼠用桿努盡煙水提液灌胃,1次/d,8 g/kg,共28 d;地塞米松組大鼠霧化吸入地塞米松,1次/d、0.1 mg/只,共28 d;聯合用藥組大鼠用桿努盡煙灌胃聯合地塞米松霧化吸入,桿努盡煙8 g/kg、地塞米松0.1 mL/只,共28 d。

1.3 觀察指標

1.3.1呼吸系統癥狀觀察及肺組織的收集 觀察實驗過程中5組大鼠呼吸系統癥狀,包括有無喘息、咳嗽、體質量減輕、活動量減少及毛發光澤度下降等。5組大鼠腹腔注射麻醉劑水合氯醛后心臟取血,血液樣本旋轉離心制得血清,用于酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測;取血后注射過量麻醉劑處死,取肺組織,用生理鹽水沖洗后,左肺上葉固定于10%甲醛,右肺經液氮處理后置于-80 ℃冰箱保存,用于后續指標檢測。

1.3.2大鼠肺組織切片組織學變化 取“1.3.1”項下各組大鼠肺門根部取組織2 g固定于4%多聚甲醛溶液,經脫水、修剪、包埋、切片、HE染色、封片后鏡檢。

1.3.3大鼠肺組織中IL-2含量 取“1.3.1”項下各組大鼠新鮮肺組織50 mg,剪碎,加磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)于研磨器中充分研磨,4 ℃的條件下5 000 r/min離心10 min,取上清液,按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-2表達水平。

1.3.4大鼠肺組織P38MAPK、GR-α及HSP90mRNA表達 取“1.3.1”項下各組大鼠肺組織樣本后,制備肺組織勻漿,提取總RNA,對RNA濃度的測定及逆轉錄;逆轉錄的DNA進行PCR擴增,凝膠電泳后進行凝膠圖像分析;TRIZOL法提取主動脈總RNA,提取的RNA通過B-500超微量分光光度計測定其濃度和純度,通過凝膠電泳測定RNA完整度;使用逆轉錄試劑盒以RNA為模板合成互補脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA),其中,孵育條件為42 ℃ 2 min、50 ℃ 15 min,終止反應條件為85 ℃ 5 s,設計引物和引物序列見表1。Real-time PCR反應條件為5 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、40個循環,95 ℃ 15 s,60 ℃,95 ℃ 15 s;反應完成后,測定擴增循環數(cycle threshold,Ct)、熔融曲線(每個樣品重復檢測3次);以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內參,用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量;PCR擴增后,凝膠電泳后進行凝膠圖像分析。

表1 GR-α、P38MAPK、HSP90及GAPDH引物序列Tab.1 Primer sequences of GR-α, P38 MAPK, HSP90 and GAPDH

1.3.5大鼠肺組織P38MAPK、GR-α及HSP90蛋白表達 取“1.2.4”項下各組大鼠肺組織20 mg充分淹沒于裂解液200 μg,二辛可寧酸含量測定(bicinchoninic acid assay,BCA)蛋白濃度檢測定量蛋白濃度;取總蛋白40 μg,5×樣品緩沖液配平上樣液,沸水浴10 min;配置10%分離膠、5%濃縮膠,凝固膠后拔出梳齒上樣;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)電泳,濃縮膠45 min、80 V,分離膠60 min、120 V;根據分子量大小進行切膠,聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜轉膜,90 min、120 mA恒流;5%三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水與補間液(tris buffered saline with tween,TBST)加至脫脂奶粉封閉1 h,4 ℃一抗孵育過夜;1×TBST漂洗液洗PVDF膜6次,5 min/次,加二抗配制液,搖床孵育2 h;取膜,回收二抗,1×TBST溶液洗滌6次,5 min/次;PVDF膜置于增強型化學發光劑(enhanced chemiluminescence,ECL)液中,用凝膠成像系統顯影并分析條帶灰度值,比較各目的條帶與β-action的蛋白相對表達量。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 呼吸系統癥狀

與對照組相比,桿努盡煙組、地塞米松組、模型組及聯合用藥組大鼠均有不同程度的喘息、咳嗽、精神狀態不佳,其中聯合用藥組呼吸系統癥狀最輕。

2.2 大鼠肺組織的特征

給藥28 d結束時,對照組大鼠肺組織見各級支氣管結構正常,支氣管纖毛上皮排列整齊,肺泡上皮細胞正常,肺間質未見明顯纖維組織增生及炎性浸潤;模型組大鼠肺組織見支氣管結構受損,管腔狹窄,局部肺泡隔輕微增厚,支氣管上皮細胞脫落,管腔內可見脫落細胞碎片,支氣管或血管周圍可見大量淋巴細胞浸潤;桿努盡煙組大鼠肺組織見支氣管結構輕度變形,上皮細胞少量脫落,炎細胞增生情況緩解;地塞米松組大鼠肺組織支氣管結構改變,部分纖毛上皮脫落,少量淋巴細胞和泡沫細胞浸潤;聯合用藥組大鼠肺組織見支氣管上皮細胞脫落有所改善,炎細胞增生情況緩解。見圖1。

注:綠色箭頭表示炎細胞浸潤,黃色箭頭表示泡沫細胞。圖1 各組大鼠肺組織切片(HE,×100)Fig.1 Lung tissue sections of rat in each group(HE,×100)

2.3 血清IL-2含量

ELISA法檢測結果顯示(表2),模型組、桿努盡煙組、地塞米松組和聯合用藥組大鼠血清IL-2含量均較對照組明顯升高(P<0.01),其中,聯合用藥組IL-2指標最接近對照組水平;與模型組相比,桿努盡煙組、地塞米松組大鼠血清IL-2含量均降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清中IL-2水平Tab.2 Serum IL-2 levels of rat in each

2.4 肺組織中P38MAPK、GR-α及HSP90 mRNA的表達

給藥第28天時,與對照組比較,其余各組大鼠肺組織中P38MAPK、GR-α及HSP90 mRNA表達升高(P<0.05) ,以模型組增加最為明顯;與模型組相比,各給藥組大鼠肺組織P38MAPK、GR-α及HSP90 mRNA表達有不同程度降低(P<0.05),其中以聯合用藥組降幅最大。見圖2。

注:(1)與對照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。圖2 各組大鼠肺組織P38MAPK、GR-α及HSP90mRNA表達Fig.2 Expression of P38MAPK, GR-α, and HSP90 mRNA in rat lung tissues in each group

2.5 肺組織中P38MAPK、GR-α及HSP90蛋白的表達

Western blot法檢測結果顯示(圖3),與對照組相比,模型組、桿努盡煙組、地塞米松組及聯合用藥組大鼠肺組織中P38MAPK、GR-α表達均上升,其中聯合用藥組最接近對照組水平(P<0.05);與模型組相比,桿努盡煙組、地塞米松組及聯合用藥組大鼠肺組織HSP90蛋白表達均接近對照組,其中聯合用藥組相對表達最少(P<0.05)。

注:A為Western blot法檢測結果,B為Western blot法定量結果;(1)與對照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。圖3 各組大鼠肺組織P38MAPK、GR-α及HSP90蛋白表達Fig.3 Protein expression of P38 MAPK, GR-α, and HSP90 in rat lung tissues in each group

3 討論

臨床中,GC藥物因具有強大的抗炎作用,而被廣泛應用于慢性氣道炎癥的治療,發揮其抗炎、抗免疫的作用[5, 10]。但是部分患者存在對激素不敏感或抵抗現象,不利于疾病的治療和病情的控制。P38MAPK信號通路可被廣泛炎癥因子激活,其是促炎細胞因子轉錄和翻譯分子水平上關鍵的信號調節通路,這使得P38MAPK同路的不成組成部分稱為治療自身免疫性和炎癥性疾病的潛在靶點[11-12,23]。人類GR的絲氨酸226號位處有一個共識的P38MAPK磷酸化序列,這可能是P38MAPK信號通路對GR的直接影響位點。

貴州省苗藥資源豐富,苗族習慣用桿努盡煙治療COPD,療效顯著,且苗藥具有對成分、多靶點、多途徑及低毒副作用等特點[15]。現代藥理學研究表明,桿努盡煙中含有黃酮類、苯乙醇類、β-谷甾醇及熊果酸等有機化學成分,有良好的抗炎止咳作用[19,24]。本研究在前期研究的基礎上[18-19],進一步探究桿努盡煙是否通過P38MAPK信號通路途徑改善GC對COPD療效,并為其臨床應用提供理論支持和基礎數據。

本研究結果顯示,聯合藥物組治療后,大鼠肺部病理狀態得到一定的改善,支氣管上皮細胞脫落減少,炎癥細胞數有所下降;與桿努盡煙組和GC組相比,聯合用藥組大鼠肺組織勻漿中P38MAPK表達下調,GR-α、IL-2表達升高(P<0.05),提示桿努盡煙能降低P38MAPK的表達含量,并抑制IL-2的分泌,在一定程度上局限炎癥蔓延,提高COPD大鼠GC治療的敏感性。據此推測,桿努盡煙可能是通過干預IL-2的分泌、抑制P38MAPK的活性、增加GR與HSP90等解離及自身構像的改變啟動核轉位信號,進而增加激素和脫氧核糖核苷酸-GC效應元件(deoxyribonucleic acid-glucocorticoidresponseelement,DNA-GRE)的結合穩定性、核轉移能力及與上游信號因子(如轉錄因子)之間的相互作用能力。

綜上所述,P38MAPK信號通路的過度激活是降低GC敏感性的主要信號通路之一;多種炎癥因子通過激活P38MAPK信號通路,調控細胞內核轉位信號,導致GC抵抗。因此,調節細胞內P38MAPK可能是克服GC抵抗的重要方法。值得注意的是,在本研究中苗藥桿努盡煙與GC聯合治療COPD大鼠,可以減少大鼠肺組織IL-2分泌、下調P38MAPK水平、提高GR-α和HSP90水平。因此,可以認為桿努盡煙對GC產生允許作用,增加其對GC敏感性,抑制急性發病期氣道炎癥的進展,發揮協同治療作用。兩者聯合使用有望成為克服GC治療不敏感型COPD患者的有力策略。