抗菌肽-Mt6的理化特性和抗菌活性及聯合抗真菌藥物對白色念珠菌的作用*

黃敏慧, 曾曄, 張迎春, 李彩多, 吳建偉, 陳崢宏, 王濤*

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院, 貴州 貴陽 550025; 2.貴州省普通高等學校病原生物學特色重點實驗室, 貴州 貴陽 550025)

由于抗菌藥物的不規范使用,微生物耐藥性已成為當今威脅公共衛生健康的重要挑戰之一[1]。據預測,如果不加以控制,到2050年因微生物耐藥導致的死亡人數每年可多達1 000萬人[2-3]。研究表明,目前新開發的抗菌藥臨床效果并不顯著,不足以應對當前微生物耐藥性的挑戰[4-5],因此尋找新型抗微生物藥物或治療方法已迫在眉睫。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是生物體抵御外界病原體感染的小分子功能多肽,由于其具有抗細菌、真菌以及病毒等廣譜的生物學活性且不易產生耐藥等特點引起了廣泛關注[6-8]。家蠅抗真菌肽-1A(Muscadomesticaantifungal peptide-1A,MAF-1A)是家蠅幼蟲特有AMPs,本課題組前期研究表明其對白念珠菌(Candidaalbicans,C.albicans)等真菌、病毒和腫瘤細胞均具有抑制活性,但與傳統抗菌藥物相比MAF-1A存在抗菌活性相對不高的弱點,限制了其臨床應用[9-11]。目前,以天然活性AMPs為模板進行結構優化是獲得高抗菌活性衍生肽的主要策略[12-13]。研究還發現,將AMPs與臨床常用抗菌藥物聯用不但能提高抗菌效果,還可以減少抗菌藥物的用量,對降低微生物耐藥率有重要意義,但AMPs與傳統藥物的聯合抗菌作用研究主要集中在抗細菌活性方面,對于抗真菌作用的研究鮮見報道[14-16]。本研究通過對MAF-1A的氨基酸分子進行替換、獲得衍生肽AMPs-Mt6,分析其對C.albicans以及多種革蘭陽性菌(gram-positive bacteria,G+)和革蘭陰性菌(gram-negative bacteria,G-)的抗菌活性;并將AMPs-Mt6與4種臨床常用抗真菌藥物分別進行聯合抗菌試驗,檢測AMPs-Mt6聯合不同抗真菌藥對C.albicans的體外抑菌效果,為開發新型抗菌藥物及療法提供一定的理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1菌株來源C.albicansATCC10231、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)ATCC25923、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)ATCC25922、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)、甲型副傷寒沙門菌(Salmonellaparatyphi,S.paratyphi)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,K.pneumoniae)由貴州醫科大學病原生物學微生物教研室提供。

1.1.2主要試劑及儀器 兩性霉素B(amphotericin B,AmB)、氟康唑(fluconazole,FLC)、伊曲康唑(itraconazole,ITC)、5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC),沙氏葡萄糖瓊脂培養基(sabouraud dextrose agar,SDA)、水解酪蛋白瓊脂培養基(mueller-hinton agar, MHA)及水解酪蛋白肉湯培養基(mueller-hinton brothmedium,MHB;北京Solarbio),RPMI-1640干粉培養基(上海Gibco),磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS)和碳酸氫鈉干粉(北京Solarbio),3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(上海Gibco);SW-CJ-1F雙面垂直流超凈工作臺(蘇州凈化)、臺式高速冷凍離心機(德國SIGMA)、SPX智能生化培養箱 (寧波普朗特)、HR40-ⅡA2生物安全柜(青島海爾)、GI54DS全自動高壓蒸汽滅菌器(廈門深華)。

1.2 研究方法

1.2.1AMPs-Mt6分子設計、生物信息學分析及化學合成 以MAF-1A的氨基酸序列為模板,使用賴氨酸(lysine,K)替換 MAF-1A序列中的谷氨酸(glutamic acid,E)、天冬酰胺(aspartic acid,D)來增強衍生肽的陽離子性;以亮氨酸(leucine,L)以及色氨酸(tryptophan,W)替換谷氨酰胺(glutamin,Q)增強衍生肽的疏水性。利用ProtParam網站軟件 (https://web.expasy.org/protparam/) 預測AMPs的正電荷、疏水性等理化性質,HeliQuest網站軟件(https://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ ComputParams.py) 預測AMPs的螺旋輪投影,Network Protein Sequence(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl/page=/NPSA/npsa. html) 網站的Hierarchical Neural Network軟件計算AMPs中α-螺旋所占比例。模板肽及衍生肽均委托生工生物(上海)工程股份有限公司采用9-芴甲氧羰基固相合成法合成,高效液相色譜純化、液相色譜-質譜驗證,多肽合成純度≥98%。

1.2.2AMPs-Mt6的抗菌活性檢測 挑取對數生長期的C.albicans、S.aureus、B.subtilis、E.coli、P.aeruginosa、S.paratyphi、K.pneumoniae菌落置于PBS中制備成細胞懸液,用RPMI-1640液體培養基將C.albicans菌液濃度調整至(0.5～2.5)×106cfu/L,用MHB將S.aureus、B.subtilis、E.coli、P.aeruginosa、S.paratyphi、K.pneumoniae菌液濃度調整至1.0×1011cfu/L;取相同體積的菌液100 μL和不同終濃度AMPs-Mt6稀釋液(156.25～2 500.00 mg/L)于96孔板中混勻,37 ℃孵育24 h,肉眼觀察無菌生長孔對應的濃度為衍生肽的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC);取MIC 試驗中判定為無菌生長的培養液,真菌接種于SDA平板,細菌接種于MHA平板后,置37 ℃培養24 h,觀察生長現象,以無菌生長所對應的最低藥物濃度分別為最小殺真菌濃度(minimum fungicidal concentration,MFC)和最小殺細菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC),每組實驗重復3次;同時設MAF-1A對照組及陰性對照組。

1.2.3FLC、AmB、ITC以及5-FC對C.albicans的MIC值測定 參考文獻[17]M27-A3方法,取濃度為(0.5～2.5)×106cfu/L的C.albicans菌液100 μL和相同體積不同終濃度0.25～64.00 mg/L的藥物稀釋液于96孔板中混勻,37 ℃孵育24 h,肉眼觀察無菌生長孔對應的濃度為MIC;取MIC試驗中判定無菌生長的培養液接種于SDA 平板,37 ℃培養24 h后觀察生長現象,以無菌生長所對應的最低藥物濃度為MFC,實驗重復3次。

1.2.4AMPs-Mt6分別與FLC、AmB、ITC、5-FC聯合用藥效果檢測 參考文獻[18]方法并稍作修改。采用7×7棋盤,AMPs-Mt6分別與FLC、AmB、ITC及5-FC聯合使用,實驗步驟如圖1所示(以AMPs-Mt6和FLC聯合使用為例),每孔分別加(0.5～2.5)×106cfu/L的C.albicans菌液100 μL和AMPs-Mt6、FLC(或AmB、ITC、5-FC)稀釋液各50 μL,使得每一橫行AMPs-Mt6的終濃度為2×MIC、1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC及0×MIC,同時每一縱列FLC(或AmB、ITC、5-FC)的終濃度不變;每一縱列FLC(或AmB、ITC、5-FC)的終濃度為2×MIC、1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC及0×MIC,同時每一橫行AMPs-Mt6的終濃度不變。混勻后于37 ℃恒溫孵育18～24 h。

注:A～G表示終濃度為2×MIC、1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC、0×MIC的抗真菌藥物;1～7表示終濃度為2×MIC、1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC及0×MIC的AMPs稀釋液。圖1 AMPs-Mt6和不同抗真菌藥物聯合抗菌的實驗示意Fig.1 Schematic diagram of AMPs-Mt6 combined with different antifungal drugs

1.2.5聯合用藥效果判定 根據部分抑菌濃度指數[fractional inhibitory concentration index,FIC index;FIC index=(藥物A聯合使用時MIC值/藥物A單用時MIC值)+(藥物B在聯合使用時MIC/藥物B在單用時MIC值)]判斷聯合用藥效果,標準如下[18]:FIC index≤0.5時,聯合用藥效果為協同;0.52時,聯合用藥效果為拮抗。

2 結果

2.1 AMPs-Mt6生物信息學結果

生物信息學軟件分析結果顯示,使用K、L、W替換相應氨基酸獲得衍生肽AMPs-Mt6(表1):與模板肽MAF-1A相比,AMPs-Mt6的正電荷數由+2增加到+9,疏水性由0.013增加到0.451,結構中的α-螺旋占比有所增加至81%,不穩定指數降低至16.07(表2);螺旋輪結構預測結果顯示,AMPs-Mt6為兩親性結構(圖2)。

表1 MAF-1A和AMPs-Mt6的氨基酸序列Tab.1 Sequence of MAF-1A and AMPs-Mt6

表2 MAF-1A和AMPs-Mt6理化性質參數Tab.2 Physicochemical properties of MAF-1A and AMPs-Mt6

注:字母表示氨基酸的縮寫,其中A為丙氨酸,D為天冬氨酸,E為谷氨酸,F為苯丙氨酸,I為異亮氨酸,K為賴氨酸,L為亮氨酸,M為甲硫氨酸,Q為谷氨酰胺,S為絲氨酸,T為蘇氨酸,W為色氨酸;藍色表示帶正電的親水性氨基酸氨基,紅色表示帶負電的氨基酸殘基,黃色表示強疏水性氨基酸,灰色表示疏水性氨基酸,紫色表示不帶電的氨基酸殘基;箭頭表示的是疏水力距的大小。圖2 MAF-1A和AMPs-Mt6的螺旋輪結構Fig.2 Helical wheel projection of MAF-1A and AMPs-Mt6

2.2 AMPs-Mt6抗菌活性

AMPs-Mt6生物學活性檢測結果顯示(表3),與模板肽MAF-1A相比,AMPs-Mt6對C.albicans、S.aureus、B.subtilis、E.coli、P.aeruginosa、S.paratyphi及K.pneumoniae均表現出明顯的抗菌活性,其中對C.albicans抑制活性最強(MIC為312.50 mg/L、MFC為625.00 mg/L),且明顯優于模板肽MAF-1A。

表3 MAF-1A 和AMPs-Mt6對不同微生物的抗菌活性Tab.3 Antimicrobial activity of MAF-1A and AMPs-Mt6 against different microorganisms

2.3 FLC、AmB、ITC及5-FC對C. albicans的抑制活性

微量肉湯稀釋法檢測結果顯示(表4),FLC、AmB、ITC及5-FC抗C.albicans的MIC分別為0.50、0.50、0.25及1.00 mg/L,MFC值分別為2.00、2.00、1.00及4.00 mg/L。

表4 FLC、AmB、ITC及5-FC對C. albicans的MIC和MFCTab.4 MIC and MFC of FLC, AmB, ITC, and 5-FC against C. albicans

2.4 AMPs-Mt6分別與FLC、AmB、ITC、5-FC聯合使用的抗C. albicans效果

AMPs-Mt6與藥物聯合藥敏實驗結果顯示(表5),AMPs-Mt6與FLC聯合使用抗C.albicans時,FIC index值為0.63,表現為相加效應;與AmB聯合使用時,FIC index值為0.19,表現為協同效應;與ITC聯合使用時,FIC index值為0.36,表現為協同效應;與5-FC聯合使用時,FIC index值為0.37,表現為協同效應。

表5 AMPs-Mt6與常用抗真菌藥物聯合的抗C. albicans效果Tab.5 Effect of AMPs-Mt6 combined with antifungal drugs against C. albicans

3 討論

AMPs作為具有抗細菌、真菌等多種生物學功能的小分子功能多肽,因其獨特的作用機制,通常不會誘導病原體產生耐藥性,具有被開發成新型抗菌藥物的潛力[19-20]。但大多數天然AMPs由于抗菌活性低于傳統抗菌藥物,以及藥代動力學較差等問題,限制了其開發與利用,因此需要通過分子改造以獲得優良的AMPs分子[21-22]。

氨基酸殘基替換法是目前AMPs分子改造方法中較為常用的一種,以天然活性AMPs的氨基酸序列為模板,通過用優勢氨基酸在序列中特定位置的替換來優化影響AMPs抗菌活性的陽離子性、疏水性、雙親性及α-螺旋等理化性質和結構參數,從而提高AMPs的生物學活性[23-24]。本研究中以AMPs MAF-1A的氨基酸序列為模板,采用氨基酸殘基替換法對其結構及理化性質進行優化后得到1條全新多肽AMPs-Mt6,生物信息學分析結果顯示,與模板肽MAF-1A相比,AMPs-Mt6的正電荷數、疏水性、α-螺旋以及穩定性均增加,說明經分子改造所獲的AMPs-Mt6的理化性質優于模板肽MAF-1A;抗菌活性實驗結果顯示,AMPs-Mt6對C.albicans的抗菌活性明顯強于模板肽MAF-1A,對S.aureus、B.subtilis、E.coli、P.aeruginosa、S.paratyphi及K.pneumoniae等6種不同的G+和G-細菌均表現出明顯的抗菌活性,而模板肽MAF-1A只對真菌C.albicans具有抑制活性,對以上細菌均無抑制作用,結果表明衍生肽AMPs-Mt6除了具有抗真菌活性外還具有抗細菌活性,其抗菌活性及抗菌譜較模板肽MAF-1A均顯著增強,提示AMPs-Mt6具有進一步被開發成抗菌藥物的潛力。

C.albicans作為一類可定植于人體口腔、陰道等部位的機會致病性真菌,可導致機體黏膜感染甚至深入內部組織引起侵襲性念珠菌病[25]。唑類、多烯類及棘白菌素類是目前臨床常用的抗真菌藥物,然而由于這些抗真菌治療藥物長期的使用使得臨床C.albicans耐藥問題亟待解決[26]。Jahangiri等[27]研究表明,將AMPs Nisin和P10分別與頭孢他啶、妥布霉素、環丙沙星、多尼培南及粘菌素聯合使用,抗鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌時呈協同或相加效應,在低濃度下對鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌及其多重耐藥菌株均有明顯抑制作用。此外,Zeng等[28]將AMPs zp16與萬古霉素和替考拉寧聯合使用后,對肺炎克雷伯菌耐藥株表現出協同抑制效應,抗菌效果顯著增強。本研究結果顯示,AMPs-Mt6與AmB、ITC、5-FC分別聯用時,抗C.albicans效果均呈協同效應,與FLC聯用時呈相加效應,且AMPs-Mt6與FLC、AmB、ITC、5-FC聯用抗C.albicans的MIC值與單用時MIC值相比,均有不同程度的減低,AMPs-Mt6與抗菌藥物在較低濃度下就能對C.albicans產生良好的抑制作用,表明AMPs-Mt6與傳統抗真菌藥物聯用能增強抗菌效果,這一結果提示AMPs-Mt6與抗真菌藥物聯用對減少臨床抗菌藥物用量、降低藥物相關耐藥性的產生具有一定意義,但具體作用機制還有待深入探究。

綜上所述,經分子改造所獲得的AMPs-Mt6的抗菌活性和抗菌譜較模板肽MAF-1A明顯增強,與臨床常用抗真菌藥物FLC、AmB、ITC、5-FC聯用可增強抗菌藥物對C.albicans的抑殺作用,提示衍生肽AMPs-Mt6具有成為新型臨床抗菌藥物候選分子的潛力。