天冬氨酸酶體系中R-3-氨基丁酸相關物質HPLC 方法研究

穆玉敏，韓廣欣，張浩月，梁海龍，楊夢茜，劉麗榮，任麗梅,2,3

（1.石家莊學院化工學院，河北 石家莊 050035；2.河北省生物制藥國際聯合研究中心，河北 石家莊 050035；3.河北省高效微生物制藥應用技術研發中心，河北 石家莊 050035；4.美邦美和生物科技有限公司，河北 石家莊 050000）

0 引 言

R-3-氨基丁酸是醫藥中間體R-3- 氨基丁醇的前體。R-3-氨基丁醇則是合成抗艾滋病整合酶抑制劑杜魯特韋的重要原料。R-3-氨基丁酸還可以衍生為β-內酰胺，進而合成青霉烯類抗生素。

杜魯特韋(Dolutegravir)作為葛蘭素史克旗下抗HIV 新藥，2013 年獲批FDA 上市并承認了它的突破性。降低杜魯特韋原料藥成本、推廣其應用范圍的關鍵步驟是R-3-氨基丁酸。

據統計，2016 年全球抗HIV 藥物銷售額為230.23 億美元，2011～2016 年復合增速為8.4%，顯著高于全球藥物市場約3.5%的平均增長率。到2022 年市場價值增長到320 億美元，R-3-氨基丁酸作為其重要原料中間體，其市場容量及價格也是水漲船高。

R-3-氨基丁酸為一種手性氨基醇類，早期的氨基醇類物質主要通過天然的氨基酸為原料還原得到。目前，合成R-3-氨基丁醇的方法有以硼氫化物還原法、以酒石酸為拆分劑的拆分法和以釕碳等為誘導劑的化學誘導法等，近年興起以各種酶為核心的生物催化和基因轉移等合成方法。采用以上方法制備R-3-氨基丁醇的環境有不能直接獲得手性產物、污染大、收率不高且不利于企業的節能減排等缺點，生物法的相關產品研究逐步走向市場。為了降低杜魯特韋原料藥成本，推廣R-3-氨基丁醇應用范圍，重要步驟在于開發一種高效、低成本的路線合成高純度的R-3-氨基丁酸。

隨著科學研究進步，發現利用天冬氨酸酶突變體可以提供一種催化反式丁烯酸生產R-3-氨基丁酸的新路線。優化其生產工藝達到工業化生產，對于生物醫藥行業具有重要的意義。該酶促體系由巴豆酸、銨鹽、含鎂離子的鹽組成，重組天冬氨酸酶突變體為生物酶催化劑，以氨水調節pH，在特定溫度及堿性條件下進行反應，然后經過分離、純化、脫色、過濾、結晶、干燥，獲得R-3-氨基丁酸。相對以上提及的化學法，生物催化具有環境友好、條件溫和、收率高、易制備和工藝路線短等優點，可為杜魯特韋重要原料R-3-氨基丁醇的工業化生產提供可靠的技術支撐。除此之外，與傳統的化學合成相比，微生物合成技術是通過環境友好的途徑制備，免于使用重金屬、有機溶劑以及強酸強堿，且生物催化劑具有高效的底物特異性，可減少副產物的形成。R-3-氨基丁酸是一種典型的手性β 氨基酸，據研究發現其有效組分僅為R 構型。

本論文根據生物酶催化的高選擇性，針對生物催化結束后的反應液以及終成品獲得前成分復雜的母液等進行分析方法探討。生物酶催化原理：巴豆酸加銨鹽經天冬氨酸酶催化，催化條件42 ℃pH 9.0，200 rpm 得到R-3-氨基丁酸。反應液及母液等純化步驟為：催化反應液—離心過濾—超濾—脫色（活性炭） —脫炭—減壓濃縮—結晶—離心洗滌—干燥—成品包裝。由生物酶催化原理和反應液及母液等純化步驟可知，該反應中間步驟包含銨根離子、鎂離子、原輔料雜質、反應雜質等復雜組分。目前國內外關于R-3-氨基丁酸含量測定方法主要為滴定法：精密稱定R-3-氨基丁酸標準品0.1 g 到250 mL 三角瓶中，加3 mL 無水甲酸待樣品完全溶解后繼續加入50 mL 冰醋酸，然后加兩滴結晶紫指示劑，立刻用高氯酸（已標定） 滴定至紫色消失變為藍色，保持30 s 不變色。R-3-氨基丁酸含量測定方法衍生法：采用1-氟-2,4-二硝基苯和HPLC 進行衍生化，在360 nm 處進行紫外檢測。R-3-氨基丁酸的相關物質檢測高效液相法：流動相：準確量取純水990 mL，甲醇10 mL 加入1 000 mL 量筒，加入0.5 mL 磷酸和1 mL 三乙胺調pH 為5.6，過濾超聲15 min 即得。稀釋液：超純水，色譜條件：色譜柱：YMC - Pack Pro C18 150×4.6 mml.D.S-3 μm；210 nm；流速：0.5 mL.min；波長：210 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；運行時間：30 min。上述3 種方法實驗步驟繁瑣，且需結合不同方法定量檢測R-3-氨基丁酸及其相關物質巴豆酸等，為解決現有方法存在的問題，本文開發了一種能夠快速、準確定量檢測R-3-氨基丁酸及其相關物質的高效液相色譜分析方法。通過50 mL 小體系反應及1 L、30 L 體積放大反應驗證，在該方法條件下反應底物巴豆酸在濃度0.05~0.4 g/L 范圍內線性良好，R2＞3 個9，產物R-3-氨基丁酸在濃度0.35~2 g/L 范圍內線性良好，R2＞3 個9，此方法同時滿足監測催化反應過程、原輔料及成品雜質監測，效率大大提升，該檢測法靈敏度高，檢測限為0.2 g/L，定量限0.5 g/L，對獲取高純度R-3-氨基丁酸有重大貢獻。

1 結果與討論

1.1 實驗部分

1.1.1 儀器與設備

高效液相色譜儀，LC-2030 Plus 島津。

電子天平，賽多利斯儀器有限公司型號AUW 220D。

pH 計，梅特勒- 托利多儀器有限公司，Seven2 Go S2。

1.1.2 材料與試劑

磷酸二氫鉀，分析純。

乙腈，色譜純。

磷酸阿拉丁色譜純含量≥85%。

超純水。

甲醇康科德，色譜純。

三乙胺色譜純含量≥99.5%。

R-3-氨基丁酸標樣麥克林含量≥99.5%。

巴豆酸標樣阿拉丁含量≥98%。

1.2 實驗方法

1.2.1 流動相制備

流動相一：準確量取純水990 mL，甲醇10 mL加入1 000 mL 量筒，加入0.5 mL 磷酸和1 mL 三乙胺調pH 為5.6，過濾超聲15 min。

流動相二：30 mM 磷酸二氫鉀加入超純水超聲至完全溶解，加5%乙腈，用磷酸調pH 為2.5，用0.45μm 有機膜過濾后超聲15 min。

1.2.2 標準溶液的制備

質量濃度為10 mg/mL 的標準溶液配置：精準稱量0.1 g（精確至0.000 1 g） R-3-氨基丁酸標準品，用超純水溶解后定容至10 mL，震蕩混勻。分別吸取0.5、1、1.5 和2 mL 至10 mL 容量瓶，稀釋成0.5、1.0、1.5 和2.0 mg.mL-1的標準溶液，備用。質量濃度為10 mg/mL的標準溶液的配置：準確稱取0.1 g（精確至0.000 1 g） 巴豆酸標準品，用超純水經超聲波溶解后并定容至10 mL，振蕩混勻，用超純水按上述步驟將10 mg/mL的標準溶液逐級稀釋成0.05、1.0、2.0 和4.0 mg/mL的標準溶液，備用。

1.2.3 高效液相色譜分析條件

分析條件1：色譜柱:YMC - Pack Pro C18 150×4.6 mml.D.S-3 μm；流速：0.5 mL/min；波長：210 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；運行時間：30 min。

分析條件2：安捷倫Analytical 4.6×250 mm 5-Micron ；流速：1.0 mL/min；波長：210 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；采集時間：20 min。色譜操作條件為典型操作參數，依據儀器特點，可對操作參數進行適當調整，以獲得最佳效果。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

分別用流動相一、二對應分析條件1、2，進液相檢測R-3-氨基丁酸成品得到R-3-氨基丁酸及相關物質色譜。色譜條件2 R-3-氨基丁酸如圖1 所示。

圖1 色譜條件2 R-3-氨基丁酸Fig.1 Chromatography condition 2 R-3-aminobutyric acid.

色譜條件1 R-3-氨基丁酸如圖2 所示。

圖2 色譜條件1 R-3-氨基丁酸Fig.2 Chromatography condition 1 R-3-aminobutyric acid

由圖1 和圖2 可以看出，兩個色譜條件檢測同一樣品R-3-氨基丁酸可得出結論。

（1） 液相色譜條件二基線相較平穩。

（2） 液相色譜條件二靈敏度更高，可檢測其相關物質更低檢出限，有利于工藝控制得到純度更高的產品。

（3） 液相色譜條件二相對時間較短，可提高檢測效率。

綜上特點色譜條件二可以同時完成原輔料、催化反應、純化結晶和成品含量及雜質分析，高效便捷。

2.2 檢出限和定量限及方法線性相關性的測定

分別以3 倍和10 倍信噪比濃度得到檢測限（LOD） 和定量限（LOQ），LOD 為0.15 mg/mL，LOQ 為0.5 mg/mL。配制R-3- 氨基丁酸和巴豆酸不同質量濃度標準溶液4 個，在液相色譜條件二下， 分別進行分析檢測，用質量濃度做橫坐標，以峰面積為縱坐標得到線性回歸方程。線性關系測試結果見表1。

表1 線性關系測試結果Table 1 Result of linear relationship test

如表1 在液相色譜條件二體系中，該反應底物巴豆酸在濃度0.05~0.4 g/L 范圍線性良好，R2＞3個9，產物R-3-氨基丁酸在濃度0.35-2 g/L 范圍線性良好，R2＞3 個9，該液相色譜條件可滿足催化反應至結晶過程含量及雜質監測，方便快捷。

2.3 方法精密度的測定

對同一樣品重復6 次，在液相色譜條件二體系中檢測，精密度測試結果見表2。

表2 精密度測試結果Table 2 Result of the precision test

準偏差為8.9%；雜質標準偏差為5.0%；巴豆酸標準偏差為1.4%；該液相色譜條件對各個重要物質均能達到精密測定，重現性好。

3 展 望

R-3-氨基丁酸是抗艾滋病藥物杜魯特韋的重要原料，市場需求量與日俱增，本文主要對天冬氨酸酶生物催化反應體系有關物質開展了一些研究，該工藝條件溫和、環境友好、工藝路線短、收率高、易制備、選擇性高，但該方法蛋白含量大，尤其全菌體系表現出更強的活性，礙于時間受限，不完善之處，從以下幾個方面繼續探究。

（1） R-3-氨基丁酸UV 響應值較低，檢出限相對較高，線性范圍較窄，巴豆酸UV 響應值較高，線性范圍寬，合理稀釋倍數尤為重要。

（2） R-3-氨基丁酸與S-3-氨基丁酸形影不離，僅R-3-氨基丁酸為有意義活性，化工等其余領域是否直接高效生成R 構型無法確定，本方法是否適用其體系有待研究。

（3） 本文涉及催化反應底物較少蛋白較高體系，檢測前必需對樣品進行高溫滅活及離心去除蛋白處理，用0.22μm 有機濾膜過濾上機檢測，添加預柱以適當保護色譜柱，需進一步優化上機檢測前處理手段。

4 結 語

上述實驗結果表明，采用本方法可滿足生物轉化法體系R-3-氨基丁酸原輔料、催化反應、純化結晶、成品含量同時檢測R-3-氨基丁酸及其有關物質檢測，線性回歸方程符合標準，基線平穩、分離效果好、準確度和精密度高、操作簡單、快捷，是一種較為理想的HPLC 分析方法。

本文借助于生物轉化法高選擇性優點，生成高純度R-3-氨基丁酸技術日益成熟，本方法成本大大降低，且順應我國環保發展趨勢，推廣此分析方法極具必要性。

本文方法已同時以實驗級試劑和工業級試劑，在不同發酵體系和搖瓶催化及公斤級催化實驗驗證，在成品檢測中更體現出其有關物質檢出限更低的優勢，從而得到含量更高，純度更高成品。