奶山羊CAEV感染血清抗體的消長規律

王登峰,古努爾·吐爾遜,李建軍,洪都孜·波拉提,楊學云,孟肖瀟,吳建勇

(1.福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)/福建省動物藥物工程實驗室,福州 350002;2.新疆畜牧科學院獸醫研究所/新疆動物疫病研究重點實驗室,烏魯木齊 830013)

0 引 言

【研究意義】山羊關節炎-腦炎(Caprine arthritis encephalitis,CAE)是一種山羊慢性傳染病,發病羊臨床表現為慢性多發性關節炎、滑膜炎、滑囊炎和幼畜腦炎,有時也發生間質性肺炎、間質性乳房炎和腦脊髓炎等臨床癥狀,但大多數受感染山羊不表現出臨床疾病[1]。【前人研究進展】目前尚未見到可一次檢測各種基因型病原且敏感度較高的分子生物學檢測方法[2,5-7]。CAEV感染后,感染動物至少針對4種病毒主要抗原產生抗體:外膜糖蛋白(SU,gp135)和跨膜糖蛋白(TM,gp45)、衣殼(CA,p28)和基質(MA,p16)蛋白,一旦感染后抗體持續存在[8]。迄今為止,CAE血清學診斷的主要方法是基于三種不同抗原組合之一的血清學免疫酶分析:全病毒抗原(SU、TM、CA和MA的混合物),或重組TM和CA抗原組合,或SU抗原,其中使用全病毒抗原檢測被測動物血清中總抗體水平是檢疫上較常用的方法[9]。【本研究切入點】由于山羊感染CAEV后終生帶毒,刺激產生的抗體持續存在,雖存在多種基因型毒株但其抗原性高度交叉,檢測病毒刺激產生的特異性抗體成為判斷感染的主要方法[2,10],尋找和設計適配各種型和亞型的通用檢測引物極為困難,需研究感染后抗體產生的時間和抗體的消長規律。【擬解決的關鍵問題】采用CAEV山東分離株和參考株(ATCC VR-905)經頸靜脈感染關中奶山羊,收集的血清樣本,運用CAEV/MVV總抗體檢測試劑盒(IDEXX,J701)定期檢測300 d內的動物血清抗體,分析感染后可檢測抗體出現的時間和抗體水平的消長規律,為CAEV總抗體檢測技術在檢疫中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 CAEV毒株和試驗動物

1987～1994年間新疆畜牧科學院獸醫研究先后從甘肅、陜西、貴州、四川和山東分離到CAEV病毒,毒株的全基因組序列已提交至GenBank,登錄號依次為KT749881、KT749879、KT749880、KT214469和KT749878。以gag-pol基因序列為基礎進行遺傳進化分析,確定所有分離株均屬于B1基因型,其gag基因序列的相似性為99.2%～99.9%。奶山羊感染試驗中使用山東株(KT749878)和購自美國菌種保藏中心的參考株(ATCC VR-905),其中山東株感染羊作為試驗組,參考株感染羊作為參考株對照組。

從新疆石河子市某奶山羊養殖場購買關中奶山羊9只(<3月齡),其中公羊5只和母羊4只,所有羊購買前10 d經試管凝集試驗(動物布魯氏菌病診斷技術GB/T18646—2002)確認為布魯桿菌病血清學陰性。奶山羊購買后集中飼養,在感染前70 d和10 d分別采集血液樣本,使用CAEV/MVV總抗體檢測試劑盒進行抗體檢測和血液DNA中CAEV前病毒p28蛋白基因(p1:5’- ATA GTA GTG CAA GCA GCA GGA-3’;p2:5’-TGC ATT TTG AAC CCT TCT GAT CCC-3’)檢測,確認為CAEV感染陰性羊。

1.1.2 主要試劑

CAEV/MVV總抗體檢測試劑盒(IDEXX CAEV/MVV Total Ab,J701)購自IDEXX公司(美國);PrimeScript RT reagent Kit、SYBR premix Ex Taq II購自寶日醫生物技術(北京)有限公司;動物組織DNA提取試劑盒(DP318)、病毒RNA提取試劑盒(DP315-R)、2×TaqPCR MasterMix(KT201-02)、D2000 DNA Marker(MD114)購自天根生化科技(北京)有限公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

奶山羊隨機分成3組,每組3只:試驗組感染CAEV山東株、參考株對照組感染ATCC VR-905和陰性對照組。使用較高的感染劑量:試驗組感染劑量為4.04×108copies/羊,參考株對照組為5.80×107copies/羊,陰性對照組靜脈注射同步處理的正常細胞培養上清液2 mL。感染前第10 d時單只羊隔離同等條件飼養。感染后的第8、15、24、28、42、58、71、84、99、113、128、155、170、182、210、243、273、300 d用EDTA-K2抗凝管和血清采集管分別采集頸靜脈血液樣本3～5 mL,每種血樣分成3份。

試驗期間對山羊進行臨床記錄,結束后試驗羊全部頸靜脈放血宰殺,采集前肢關節滑膜組織進行CAEV前病毒p28基因的擴增、測序和比對分析,并進行病理剖檢,隨后焚燒銷毀處理。

1.2.2 奶山羊感染后CAEV總抗體的檢測

使用IDEXX公司(美國)生產的CAEV/MVV總抗體檢測試劑盒進行血清中CAEV全病毒特異性抗體的檢測。

其中,OD450sample為樣本OD450nm值,OD450negative為陰性對照平均OD450nm值,OD450positive為陽性對照平均OD450nm值。結果判定標準為Value<30%為陰性,30%≤Value<40%為可疑,Value>40%為陽性。

1.3 數據處理

采用GraphPad Prism 6.0繪制抗體動態曲線圖;抗體水平的組間比較采用方差分析;采用Origin 2018軟件繪制基于非線性曲線模型的抗體動態擬合曲線。

2 結果與分析

2.1 感染鑒定

研究表明,在300 d的監測周期內,未觀察到試驗組和參考株對照組山羊出現關節炎或關節腫大、腦炎等臨床癥狀;試驗羊剖檢后也未見肺臟、腦組織、乳腺和關節等出現臨床病理變化。監測期結束后,試驗羊宰殺后取前肢關節滑膜組織進行CAEV前病毒p28基因擴增和序列測定,試驗組和參考株對照組擴增的靶標序列分別與感染用山東株、參考株(ATCC VR-905)的相似度大于99.9%,試驗羊和參考株對照羊感染的病毒與設計一致,陰性對照組中靶標序列檢測為陰性。圖1

注：A:奶山羊感染CAEV后抗體水平變化趨勢;B:山東株試驗組、參考株對照組和陰性對照組抗體水平的組間比較;1:山東株試驗組;2:參考株對照組;3:陰性對照組;**** 表示P<0.001

2.2 感染后抗體監測

研究表明,感染后第24 d時,試驗組1只公羊和參考株對照組1只母羊和抗體轉陽;第28 d時,試驗組無變化,參考株對照組再次有1只母羊抗體轉陽;第42 d時試驗組其余2只羊轉陽;參考株對照組無變化;第71 d時,試驗組均為陽性,參考株對照組第3只羊(公羊)抗體轉陽。試驗組和參考株對照組山羊抗體轉陽后在各個檢測時間點均為陽性,陰性對照組抗體始終為陰性。

試驗組和參考株對照組山羊感染CAEV后,在抗體轉陽后至感染后第99 d期間CAEV總抗體OD450值呈快速上升趨勢。試驗組在感染后第99 d時抗體OD450值達到頂峰,在余下的200 d監測期間內維持在較高值的平臺期;參考株對照組抗體平均OD450值在感染后180 d時達到頂峰,雖自155 d起抗體平均OD450值均較高并維持至監測結束,但該期間個體值差異較大。陰性對照組的平均OD450值始終較低且判定為抗體陰性的狀態。在整個監測周期內,試驗組和參考株對照組的抗體水平均極顯著高于陰性對照組(P<0.001),但兩者之間無統計學差異(P>0.05)。圖1

2.3 抗體水平動態曲線的非線性擬合

研究表明,奶山羊感染后抗體變化趨勢整體呈現拋物線狀,但各感染羊自抗體轉陽后的整個監測期間其抗體值的95%置信帶最低值和95%預測帶最低值均高于陽性臨界判定值,抗體轉陽后的整個監測周期內均可使用檢測總抗體的方法鑒別感染羊。

CAEV感染組抗體轉陽后的整個監測期內,試驗組3只羊的抗體OD450值95%預測帶均在0.5～2.3,參考株對照組1只羊的抗體OD450值95%預測帶在0.5～2.6,其它2只羊在0.5～1.5,我國分離的山東株和參考株(ATCC VR-905)在刺激山羊產生體液免疫方面可能存在差異。圖2

注：山東株試驗組:A:1號羊(公);B:2號羊(母);C:3號羊(公);參考株對照組:D:1號羊(母);E:2號羊(公);F:3號羊(公)

3 討 論

1987～1994年間先后從我國甘肅、陜西、貴州、四川和山東山羊體內分離到CAEV[11-13]。1987～1995年間使用瓊脂擴散檢測方法(AGID)對我國17個省(區)的13個山羊品種共計21 169只(次)山羊的CAEV血清學調查,顯示總陽性率3.33%,11個省(區)檢出抗體陽性羊[14]。2018年,對我國11個省(區)2 083只山羊的調查顯示抗體陽性率為0.38%,4個省(區)檢出抗體陽性羊[15],有文獻也顯示中國臺灣地區山羊的血清學陽性率[16]。CAEV在我國各地羊群中整體流行率仍較低。日本和西班牙南部的個體陽性率和場陽性率比例也有文獻報道[17,18]。該病毒復制緩慢,經多年的隱性感染后最多30%的感染羊出現臨床癥狀[5, 19]。

目前,CAEV/MVV總抗體檢測試劑盒是用于區分CAEV感染山羊的主要方法之一。奶山羊感染山羊關節炎-腦炎病毒后總抗體轉陽和抗體OD450值結果顯示:CAEV山東株感染后第24 d時僅一只羊抗體轉陽,直至第42 d時全部轉陽;參考株(ATCC VR-905)感染后第24和28 d時各有一只羊抗體轉陽,第三只羊在第42、58 d時仍為陰性,直至第71 d時抗體轉陽。繼續監測發現,抗體轉陽后在余下的監測期內均為陽性。抗體水平動態曲線的非線性曲線模型擬合分析也顯示各感染羊自抗體轉陽后的整個監測期間其抗體值的95%置信帶最低值和95%預測帶最低值均高于陽性臨界判定值;研究證實山羊感染CAEV后的抗體持續期可以長達5年以上[20],抗體轉陽后的整個監測周期內均可使用檢測CAEV總抗體的方法進行鑒別感染羊。同時,試驗發現使用該方法對感染后30和45 d的山羊進行檢測出現50%(3/6)和16.7%(1/6)的山羊判定為抗體陰性,即“假陰性”,山羊CAE檢疫中,使用CAEV/MVV總抗體檢測試劑盒(IDEXX)進行檢測時,對抗體陰性山羊必須進行間隔期不少于60 d的2次以上的檢疫才可判定為陰性。

4 結 論

山羊經頸靜脈感染CAEV后45 d時約85%(5/6)的山羊血清總抗體轉陽,71 d時所有感染山羊血清總抗體均轉陽,其后200余天的檢測期內抗體持續處在較高水平。檢測山羊血清中CAEV總抗體水平適用于感染動物的判定,使用血清中總抗體水平檢疫時,必須進行間隔期不少于60 d的2次以上的檢疫方可確診為陰性羊。