去氫木香內(nèi)酯在內(nèi)生真菌Y0 液體發(fā)酵中的生物轉(zhuǎn)化研究

郭 晶，陳 帥，鄒秋萍，劉明秀，李寶晶，何紅平，汪偉光，李艷平*

（1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院暨云南省南藥可持續(xù)利用重點實驗室，云南 昆明 650500；2. 云南中醫(yī)藥大學(xué)云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點實驗室，云南 昆明 650500；3. 云南民族大學(xué)國家民委民族藥內(nèi)生菌天然產(chǎn)物合成生物學(xué)重點實驗室，云南 昆明 650500）

微生物轉(zhuǎn)化（microbial transformation，MT）是通過微生物細胞將復(fù)雜的底物進行結(jié)構(gòu)修飾，也就是利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的某個或某一系列的酶對底物特定部位進行的催化反應(yīng)[1]。近年來，微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)因具有反應(yīng)類型廣、特異性強、副產(chǎn)物少、反應(yīng)條件溫和可控、環(huán)保無污染等優(yōu)點，已逐漸成為開發(fā)高活性、低毒性新藥的一條高效途徑[2-3]。利用微生物獨特而多樣的酶系統(tǒng)，以中藥活性成分作為底物，將微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用于中藥活性成分的結(jié)構(gòu)修飾，可獲得更多結(jié)構(gòu)新穎活性顯著的天然產(chǎn)物，可為現(xiàn)代中藥研發(fā)提供一種新的有效路徑。Ma 等[4]報道了Mucor polymorphosporus AS 3.3443 能夠通過有效催化脫氫，使廣木香內(nèi)酯的C11-C13雙鍵專一性還原轉(zhuǎn)化為11α，13-二氫脫氫廣木香內(nèi)酯（11α，13-dihydrodehydrocostuslactone）。劉偉[5]發(fā)現(xiàn)Cunninghamella elegans AS 3.2028 能夠轉(zhuǎn)化莪術(shù)二酮為環(huán)氧化產(chǎn)物8，9-環(huán)氧化莪術(shù)二酮。Arakawa 等[6]報道了土曲霉和黑曲霉（Aspergillus terreus）（A. niger）對芽孢素A 的生物轉(zhuǎn)化，獲得了三種具有新穎結(jié)構(gòu)骨架的倍半萜衍生物。與原始天然產(chǎn)物相比，真菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對HL-60細胞的細胞毒性更低。

木香（Aucklandia lappa）具有解痙、降壓及抗菌作用[7]，是多種中成藥的組方之一，例如香砂養(yǎng)胃片，其中主要活性成分是木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯，其中木香烴內(nèi)酯0.400～1.463 mg/片，去氫木香烴內(nèi)酯0.512～0.983 mg/片[8]。木香烴內(nèi)酯為倍半萜內(nèi)酯類化合物，結(jié)構(gòu)中α-亞甲基-γ-內(nèi)酯是其具有抗腫瘤活性的必要基團，天然存在的倍半萜內(nèi)酯類化合物雖然種類多，但含量較少，相關(guān)研究也較少。去氫木香內(nèi)酯具有愈創(chuàng)木烷骨架[9]，被認為是生物合成倍半萜內(nèi)酯的重要中間體，但因其較低的水溶性限制了它在臨床上的應(yīng)用，而通過具有立體和區(qū)域?qū)Ｒ恍缘纳镛D(zhuǎn)化作用能夠有效改善其溶解性和生物活性[10]。Choi 等[11]研究了去氫木香內(nèi)酯的抗腫瘤活性，考察了其對人類乳腺癌細胞和卵巢癌細胞的作用，發(fā)現(xiàn)去氫木香內(nèi)酯具有潛在的抗腫瘤活性。Park 等[12]的研究也表明去氫木香內(nèi)酯和木香烴內(nèi)酯還具有顯著抑制人類乳腺癌細胞MCF-7 和MDA-MB-453 的活性。Liu 等[13-14]主要研究了木香烴內(nèi)酯對人類肝癌細胞（Hepatic Cell Carcinoma）有絲分裂時細胞活力的影響，表明木香烴內(nèi)酯可以降低人類肝癌細胞（HCC）有絲分裂時細胞活力，抑制細胞周期。以上研究表明木香中以木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯為主的衍生物具有較好的生物活性和開發(fā)利用前景，而通過生物轉(zhuǎn)化的方式利用富含豐富酶系的真菌對木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯進行轉(zhuǎn)化，有可能獲得毒性較低，生物活性好的結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物[15]。本研究將探索木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯在真菌Y0 中生物轉(zhuǎn)化的情況。同時通過MTT 法檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對結(jié)腸癌細胞SW620 的細胞毒性，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（常州國華電器有限公司）；霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；分析天平；高效液相色譜儀（安捷倫公司）；AV-600 Hz 核磁共振儀（德國Bruker 公司）。

乙酸乙酯（分析純）、甲醇（色譜純）、葡萄糖（分析純）；木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯；PDA（Potato Dextrose Agar 馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基（上海博微生物科技有限公司）；PDB 培養(yǎng)基（新鮮去皮馬鈴薯：葡萄糖：蒸餾水，比例為10 ∶1 ∶50）；正相硅膠柱色譜（100～200 目）。

1.2 菌株培養(yǎng)鑒定和生物轉(zhuǎn)化 去氫木香內(nèi)酯和木香烴內(nèi)酯分別在內(nèi)生真菌Y0（Coniothyrium pyrinum）發(fā)酵液進行生物轉(zhuǎn)化研究。用PDA 培養(yǎng)基活化菌株Y0，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，無菌條件下，挑取長勢良好的新鮮菌落放入裝有PDB 培養(yǎng)基離心管，恒溫振蕩培養(yǎng)箱28 ℃、120 rpm 培養(yǎng)。

分別稱取50 mg 去氫木香內(nèi)酯和木香烴內(nèi)酯置于離心管中，加DMSO 溶解，用PTFE 膜過濾，制成25 mg/mL 的化合物溶液。取80 μL 化合物溶液至培養(yǎng)液（50 mL）中，混勻并做好標記，設(shè)置僅含培養(yǎng)基不含化合物溶液的菌液做為空白對照，恒溫振蕩培養(yǎng)箱28 ℃、120 rpm 培養(yǎng)。第1、3、5、7 天分別取發(fā)酵液（2 mL）用等體積乙酸乙酯超聲提取，離心，取上清液旋干，用色譜甲醇溶解后用高效液相檢測，在第3 天有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物生成。

1.3 提取、分離純化及鑒定 培養(yǎng)液加入等體積乙酸乙酯超聲提取30 min，離心，取上清液蒸干，濃縮。將濃縮液用硅膠柱色譜分離，用石油醚-乙酸乙酯（15 ∶1～1 ∶1 梯度洗脫），得到Fr 1～Fr 4，F(xiàn)r 2 用高效液相色譜檢測。采用色譜柱Zorbax SB-C18（250 mm×9.4 mm，5 μm）；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；以乙腈為流動相A，水為流動相B，乙腈/水=40 ∶60（v/v）；流速：流速3 mL/min 等度洗脫，得到化合物1（5 mg，tR=16.16 min）和化合物2（0.7 mg，tR=15.57 min）。通過薄層色譜GF254 硅膠板，以10%濃硫酸-乙醇顯色檢識轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，根據(jù)化合物波譜數(shù)據(jù)對化合物結(jié)構(gòu)進行解析（1H NMR 和13C NMR）。

1.4 細胞毒檢測方法 收集對數(shù)生長期的結(jié)腸癌SW620 細胞，以5×104個/mL 的密度接種于96 孔板（100 μL/孔），培養(yǎng)24 h 后去除舊培養(yǎng)基，加入含化合物1、化合物2，且濃度為10～50 μg/mL 的新培養(yǎng)基，并孵育24 h，丟棄上清，每孔加入10 μL 5mg/mL MTT 溶液，4 h 后，去除MTT 溶液，加入200 μL 二甲基亞砜（DMSO）。在波長為490 nm 的酶標儀下測定OD 值。根據(jù)以下公式計算細胞存活率：細胞存活率=（A 化合物組-A 調(diào)零組）/（A 對照組-A 調(diào)零組）×100%。

1.5 化合物1 和2 與結(jié)腸癌SW620 細胞靶點預(yù)測與分子對接 使用GeneCards（www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫和OMIM（omim.org）數(shù)據(jù)庫獲取結(jié)腸癌SW620細胞相關(guān)靶點；使用Swiss Target Prediction（www.swisstargetprediction.ch）數(shù)據(jù)庫對化合物1 和化合物2 的靶點進行預(yù)測；使用Origin 2021 軟件對兩個化合物的靶點與疾病的靶點做交集維恩圖；使用UniProt（www.uniprot.org）數(shù)據(jù)庫和PDB（www1.rcsb.org）數(shù)據(jù)庫獲取兩個化合物與疾病各自的交集靶點；使用PyMOL2.3.0 軟件和ChemDraw 2020 軟件對靶點蛋白和兩個化合物分別進行分子對接前處理；使用Auto Dock Tools1.5.6 和Auto Dock Vina1.2.0 軟件對兩個化合物和各自的交集靶點蛋白進行分子對接；使用PyMOL 軟件對對接結(jié)果進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 高效液相色譜檢測圖 去氫木香內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、Y0 菌液以及去氫木香內(nèi)酯+Y0 菌液和木香烴內(nèi)酯+Y0 菌液制成檢測液，用乙腈-水（10%～100%）梯度分析30 min，檢測結(jié)果如圖1、圖2 所示。

圖1 去氫木香內(nèi)酯、Y0 菌液、去氫木香內(nèi)酯+Y0 菌液高效液相檢測圖

圖2 木香烴內(nèi)酯、Y0 菌液、木香烴內(nèi)酯+Y0 菌液高效液相檢測圖

2.2 去氫木香內(nèi)酯在Y0 液體發(fā)酵液中轉(zhuǎn)化過程圖

圖3 去氫木香內(nèi)酯在Y0 液體發(fā)酵液中轉(zhuǎn)化過程圖

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1 化合物1 黃色油狀，C15H20O3，1H-NMR（600 MHz，acetone-d6）δH：2.81（1H，m，H-1），2.11（1H，m，H-2a），2.09（1H，m，H-2b），2.50（1H，m，H-5），3.83（1H，t，J = 9.5 Hz，H-6），1.78 （1H，dd，J = 10.4，9.5 Hz，H-7），2.03（2H，m，H-8），2.50（1H，m，H-9a），1.78（1H，m，H-9b），2.27（1H，m，H-11），1.13（3H，d，J=7.0 Hz，H-13），5.22（1H，m，H-14a），5.21（1H，m，H-14b），4.87（1H，m，H-15a），4.71（1H，m，H-15b）.13CNMR（150 MHz，acetone-d6）δC：44.3（C-1），40.7（C-2），74.5（C-3），156.7（C-4），50.5（C-5），85.8（C-6），50.6（C-7），33.2（C-8），39.0（C-9），151.3（C-10），42.2（C-11），178.5（C-12），13.5（C-13），111.0（C-14），112.0（C-15）. 以上波譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[16]，故鑒定化合物1 為（1S，3S，5S，6S，7S，11S）-3- hydroxyl-11，13-dihydrodehydrocostuslactone。

2.3.2 化合物2 無色針晶，C15H20O3，1H-NMR（600 MHz，acetone-d6）δH：2.81（1H，m，H-1），1.92（2H，m，H-2），4.60（1H，m，H-3），2.81（1H，m，H-5），3.96（1H，m，H-6），2.11（1H，m，H-7），1.36（1H，dd，J =12.6，4.6 Hz，H-8a），1.79 （1H，m，H-8b），2.00（1H，dd，J=12.6，4.6 Hz，H-9a），1.92（1H，m，H-9b），2.63（1H，m，H-11），1.10（3H，d，J = 7.8 Hz，H-13），5.24（1H，m，H-14a），5.22（1H，m，H-14b），4.87（1H，s，H-15a），4.73（1H，s，H-15b）.13C-NMR（150 MHz，acetone-d6）δC：44.2（C-1），39.8（C-2），74.4（C-3），156.7（C-4），45.4（C-5），85.8（C-6），51.0（C-7），29.6（C-8），38.8（C-9），151.3（C-10），41.0（C-11），179.7（C-12），11.6（C-13），111.1（C-14），111.9（C-15）. 以上波譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[16]，故鑒定化合物2 為（1S，3S，5S，6S，7S，11R）- 3-hydroxyl-11，13-dihydrodehydrocostuslactone.

2.4 化合物1 和2 對結(jié)腸癌SW620 細胞的細胞毒性結(jié)果顯示，化合物1 和2 對結(jié)腸癌SW620 細胞表現(xiàn)出溫和的細胞毒性（表1）。

表1 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1 和2 對結(jié)腸癌細胞SW620 的細胞毒性

2.5 化合物和結(jié)腸癌SW620 細胞靶點預(yù)測與分子對接結(jié)果 使用GeneCards 數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫獲取到結(jié)腸癌SW620 細胞相關(guān)靶點共960 個；使用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到化合物1 的靶點有100 個，化合物2 的靶點有57 個；化合物與疾病靶點交集圖如下圖4。分子對接結(jié)果如下表2、3，一般來說結(jié)合能小于-7 kcal/mol 代表結(jié)合作用強烈。取各自結(jié)合能最好的對接組進行對接情況可視化，如下圖5、6。化合物1 與結(jié)腸癌細胞SW620 的交集靶點有26 個，化合物2 與結(jié)腸癌細胞SW620 的交集靶點有16 個。其中化合物1 與靶點蛋白VDR 中的LEU-230、LEU-233 和VAL-234 等多個氨基酸殘基形成多條疏水作用鍵，化合物2 與靶點蛋白CDK1 中的ILE-10、VAL-18 和ALA-31 等多個氨基酸殘基形成多條疏水作用鍵，且兩組結(jié)合能分別為-9.7 kcal/mol 和-8.5 kcal/mol，結(jié)合能優(yōu)異且結(jié)合作用強烈。推斷化合物1 和化合物2 具有抑制結(jié)腸癌細胞SW620的作用。

表2 化合物1 與交集靶點結(jié)合能數(shù)據(jù)

表3 化合物2 與交集靶點結(jié)合能數(shù)據(jù)

圖4 化合物1、化合物2 靶點與疾病靶點交集圖

圖5 化合物1 與結(jié)腸癌SW620 細胞的蛋白結(jié)合圖

圖6 化合物2 與結(jié)腸癌SW620 細胞的蛋白結(jié)合圖

3 討論

前期研究了木香烴內(nèi)酯與去氫木香烴內(nèi)酯在Y0液體菌液中的生物轉(zhuǎn)化，第1、3、5、7 天分別對菌液檢測，在第3 天檢測有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物生成，但由于木香烴內(nèi)酯的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)率低，未能分離得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，后期將會繼續(xù)優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化條件，以期分離得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。去氫木香內(nèi)酯在Y0 菌液中轉(zhuǎn)化得到2 個產(chǎn)物，產(chǎn)物1 轉(zhuǎn)化產(chǎn)率為10%，產(chǎn)物2 轉(zhuǎn)化產(chǎn)率為1.4%。作為分子轉(zhuǎn)化的工具，微生物能夠利用酶對傳統(tǒng)化學(xué)合成中的惰性位點進行結(jié)構(gòu)修飾，具有空間選擇性和立體選擇性的特點，能夠?qū)崿F(xiàn)化學(xué)合成難以實現(xiàn)的反應(yīng)，解決化學(xué)合成過程繁瑣、污染、成本過高等問題。羥化酶、還原酶及異構(gòu)酶是微生物中常見酶[18]，本實驗中通過微生物轉(zhuǎn)化獲得到的2 個產(chǎn)物1 和2 均是去氫木香內(nèi)酯C-3 位發(fā)生羥基化，C-11 發(fā)生還原所得，這表明發(fā)生在C-11 的還原反應(yīng)可能沒有立體選擇的特異性，因此獲得了S、R 兩種構(gòu)型的產(chǎn)物。

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1 和2 對結(jié)腸癌細胞SW620 具有一定的細胞毒性，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對化合物1、2 靶點預(yù)測，并從GeneCards 數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫獲取結(jié)腸癌SW620 細胞相關(guān)靶點。化合物1 與結(jié)腸癌細胞SW620 的交集靶點有26 個，化合物1 與靶點蛋白維生素D 受體（vitam in D receptor，VDR）結(jié)合能為-9.7 kcal/mol，且 與VDR 中 的LEU-230、LEU-233 和VAL-234 等多個氨基酸殘基形成多條疏水作用鍵，結(jié)合作用強烈。VDR 是一種核轉(zhuǎn)錄因子通過與配體特異結(jié)合調(diào)控多種基因的表達，從而調(diào)節(jié)多種生命活動的進行，在人體各組織細胞中廣泛存在，在結(jié)腸、腎上腺皮質(zhì)、肺等部位的細胞及淋巴細胞中表達量較高[19-20]。Cross 等[21]研究證實，1，25-二羥基維生素D3能有效降低直腸癌、乳腺癌、卵巢癌等多種癌癥的死亡率。近年來大量研究表明:1，25-二羥基維生素D3主要通過依賴VDR 途徑調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖分化，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等，從而抑制腫瘤細胞生長。網(wǎng)絡(luò)藥理與分子對接結(jié)果顯示化合物1 與VDR 有很好的結(jié)合，因此化合物1 有可能通過抑制VDR 發(fā)揮潛在治療結(jié)腸癌的作用。化合物2 與結(jié)腸癌細胞SW620 的交集靶點有16 個，其中與靶點蛋白CDK1 中的ILE-10、VAL-18 和ALA-31 等多個氨基酸殘基形成多條疏水作用鍵，結(jié)合能為-8.5 kcal/mol，結(jié)合作用強烈。細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent protein kinase 1，CDK1）是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，作為控制細胞周期的起始、進展和終止的主要角色，于細胞周期多個環(huán)節(jié)中均可作為抗癌天然靶標。由于CDK1 在有絲分裂過程的調(diào)控中具有重要作用，已有較多的關(guān)于降低CDK1 活性的物質(zhì)被開發(fā)為抗癌藥物。其中，一些藥物可以通過抑制CDK1 的活性阻滯G2/M 期以達到治療結(jié)直腸癌的目的。例如斑蝥素就是通過抑制CDK1 活性導(dǎo)致結(jié)直腸癌colo 205 細胞中的G2/M 期阻滯和細胞凋亡的[22]。但化合物1、2 抗結(jié)腸癌的活性與可能的作用機制有待進一步的體內(nèi)外實驗來探討。