補陽還五湯對Cav-1-/-小鼠腦缺血后m6A修飾和血管新生的影響

徐雅倩 ，陳博威 ，田豐銘 ，劉英飛 ，易健 ，劉柏炎

1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；

2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410203；

3.湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙 410006

缺血性腦卒中是嚴重危害人類健康的腦血管疾病之一[1]，血管新生是促進缺血性腦卒中神經功能恢復的重 要 途 徑[2]。N6-甲 基 腺 苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾是存在于高級真核生物RNA中的最普遍的修飾之一，RNA的m6A修飾在中樞神經系統生理病理過程中起著重要的生物學作用[3]。補陽還五湯是治療缺血性中風的有效方劑，但其治療腦缺血的分子機制仍待進一步闡明。課題組前期研究發現，小窩蛋白1（Cav-1）可能是補陽還五湯治療腦缺血的潛在靶點[4-6]，但Cav-1對腦缺血后m6A修飾的影響鮮見報道。本研究以Cav-1基因敲除（Cav-1-/-）小鼠為研究對象，觀察補陽還五湯對Cav-1-/-小鼠腦缺血后m6A修和血管新生的影響，探討其可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF 級雄性Cav-1-/-（KO）小鼠與同源野生型（WT）C57BL/6小鼠各36只，6～8周齡，體質量23～28 g。Cav-1-/-小鼠引種自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，由課題組長期飼養在湖南中醫藥大學第一附屬醫院SPF級動物房，小鼠子代經PCR鑒定為KO小鼠與同源WT 小鼠后納入實驗。本實驗經湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會批準（ZYFY20201215-1）。

1.2 藥物

補陽還五湯由黃芪、當歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花按120∶6∶4.5∶3∶3∶3∶3比例組成，飲片購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院。常規浸泡、煎煮后，用旋轉蒸發儀濃縮至原藥材濃度2 g/mL。濃縮液經課題組前期UPLC-Q-TOF-MS檢測，黃芪甲苷Ⅳ、芒柄花素、阿魏酸、芍藥內酯苷濃度分別為78.1、46.7、45.6、468.4 μg/mL[7]。

1.3 主要試劑與儀器

m6A 甲基化測定試劑盒（英國Abcam，貨號ab185912），兔抗血管性血友病因子（VWF）抗體（英國Abcam，貨號ab216566），小鼠抗增殖相關Ki-67抗體（武漢博士德，貨號M00254-9），RNA抽提試劑盒（北京碧云天，貨號R0026）。智能組織切片成像系統（美國PerkinElmer，型號Vectra3），熒光定量PCR 儀（德國Eppendorf，型號Realplex2）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模與給藥

將KO小鼠和WT小鼠按隨機數字表法分別分為對照組、模型組和補陽還五湯組，每組12只。采用大腦中動脈栓塞法復制腦缺血模型。將小鼠麻醉后固定，取頸正中切口，鈍性分離左側頸總、頸內、頸外動脈，將線栓經頸總動脈送入頸內動脈，當線栓上黑色標記點恰好位于頸總動脈分叉時固定線栓，消毒并縫合皮膚。對照組小鼠僅切開皮膚游離血管，隨后縫合皮膚。術后2 h參照Longa法[8]對小鼠進行神經行為學評分，評分1～3分為模型復制成功。

根據前期研究[4，6]，確定補陽還五湯給藥劑量為18.5 g/kg。補陽還五湯組于成模后給藥，模型組及對照組給予等體積蒸餾水，灌胃體積均為0.2 mL/10 g，每日1次，連續7 d。

2.2 神經行為學評分

腦缺血后第7日是血管新生黃金期[2，9]，因此，于第7日進行神經行為學評分。末次給藥2 h后，采用Levy A 14分評分法[10]對小鼠神經行為學進行評分。

2.3 取材

神經行為學評分后腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，斷頭分離全腦，每組隨機選取6只進行病理學及免疫熒光檢測，剩余6 只進行m6A 水平及RT-qPCR檢測。

2.4 m6A水平檢測

提取缺血側皮質總RNA，向各孔中加入200 ng總RNA，并根據m6A甲基化試劑盒說明書分別加入相應試劑，于酶標儀波長450 nm處讀取各孔吸光度，比色法檢測m6A水平。

2.5 HE染色

腦組織于4%多聚甲醛中固定，常規脫水、透明、包埋及切片，以蘇木素-伊紅染色，封片后使用智能組織切片成像系統進行全片掃描。

2.6 免疫熒光雙標染色

采用免疫熒光雙標法檢測VWF/Ki-67雙標陽性細胞數，VWF標記血管內皮細胞，Ki-67標記增殖細胞，VWF/Ki-67雙標陽性細胞表示新生的血管內皮細胞。取全腦組織石蠟切片，依次脫蠟、抗原修復及封閉，分別加入VWF一抗（1∶100）、Ki-67一抗（1∶100），4 ℃孵育過夜，滴加熒光二抗，避光孵育1 h，PBS沖洗后滴加DAPI染色液，繼續孵育10 min，PBS沖洗后甘油封片。使用智能組織切片成像系統進行全片掃描，運用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算單位面積陽性細胞數。

2.7 RT-qPCR檢測

取30 mg缺血側皮質置于1.5 mL離心管中，迅速加入預冷裂解液600 μL，用微型電動勻漿器勻漿，通過離心柱法抽提RNA。將RNA反轉錄為cDNA，進行PCR擴增，引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成，引物序列見表1。以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算甲基轉移酶樣3（METTL3）、甲基轉移酶樣14（METTL14）、腎母細胞瘤1相關蛋白（WTAP）、肥胖相關蛋白（FTO）及AlkB 同系物5（ALKBH5）mRNA相對表達量。

表1 各基因PCR引物序列

3 統計學方法

采用GraphPad Prism 8統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，符合正態分布組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 補陽還五湯對小鼠神經行為學評分的影響

與同基因型對照組比較，WT、KO模型組小鼠神經行為學評分明顯升高（P＜0.01）；與同基因型模型組比較，WT、KO補陽還五湯組小鼠神經行為學評分明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；與WT模型組比較，KO模型組神經行為學評分明顯升高（P＜0.05）；與WT補陽還五湯組比較，KO補陽還五湯組神經行為學評分明顯升高（P＜0.01），見圖1。

圖1 各組小鼠神經行為學評分比較（±s，每組12只）

4.2 補陽還五湯對小鼠缺血側皮質m6A水平的影響

與同基因型對照組比較，WT、KO模型組小鼠缺血側皮質m6A水平明顯上升（P＜0.01）；與同基因型模型組比較，WT、KO 補陽還五湯組小鼠缺血側皮質m6A水平明顯下降（P＜0.01）；與WT模型組比較，KO模型組小鼠缺血側皮質m6A水平明顯升高（P＜0.05）；與WT補陽還五湯組比較，KO補陽還五湯組小鼠缺血側皮質m6A水平明顯升高（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組小鼠缺血側皮質m6A水平比較（±s，每組6只）

4.3 補陽還五湯對小鼠缺血側皮質病理形態的影響

與同基因型對照組比較，WT、KO模型組小鼠缺血側皮質神經元排列不規整，細胞間隙增寬，存在空泡，細胞核出現固縮；與同基因型模型組比較，WT、KO補陽還五湯組小鼠缺血側皮質神經元排列相對規整，細胞間隙減小，核仁較清晰；與WT模型組比較，KO模型組小鼠缺血側皮質神經元出現大量核固縮及空泡；與WT補陽還五湯組比較，KO補陽還五湯組小鼠缺血側皮質神經元排列相對欠規整，存在更多空泡。見圖3。

圖3 各組小鼠缺血側皮質形態（HE染色，×400）

4.4 補陽還五湯對小鼠缺血側皮質血管新生的影響

與同基因型對照組比較，WT、KO模型組小鼠缺血側皮質VWF/Ki-67 雙標陽性細胞數明顯增加（P＜0.01）；與同基因型模型組比較，WT、KO補陽還五湯組小鼠缺血側皮質雙標陽性細胞數明顯增加（P＜0.05）；與WT模型組比較，KO模型組小鼠缺血側皮質雙標陽性細胞數明顯減少（P＜0.05）；與WT補陽還五湯組比較，KO補陽還五湯組小鼠缺血側皮質雙標陽性細胞數明顯減少（P＜0.01）。見圖4、圖5。

圖4 各組小鼠缺血側皮質VWF/Ki-67雙標陽性細胞（免疫熒光染色，×400）

圖5 各組小鼠缺血側皮質VWF/Ki-67雙標陽性細胞數比較（±s，每組6只）

4.5 補陽還五湯對小鼠缺血側皮質m6A 甲基化酶mRNA表達的影響

與同基因型對照組比較，KO模型組小鼠缺血側皮質WTAP mRNA 表達明顯升高（P＜0.01），WT、KO模型組小鼠缺血側皮質FTO和ALKBH5 mRNA表達明顯下降（P＜0.01）；與WT模型組比較，KO模型組小鼠缺血側皮質WTAP mRNA表達明顯升高（P＜0.05），FTO 和ALKBH5 mRNA 表達明顯下降（P＜0.01，P＜0.05）；與同基因型模型組比較，KO補陽還五湯組小鼠缺血側皮質WTAP mRNA 表達明顯降低（P＜0.01），WT、KO 補陽還五湯組小鼠缺血側皮質FTO 和ALKBH5 mRNA 表達明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）；與WT補陽還五湯組比較，KO補陽還五湯組小鼠缺血側皮質FTO 和ALKBH5 mRNA 表達明顯降低（P＜0.01）。各組METTL3和METTL14 mRNA表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠缺血側皮質m6A甲基化酶mRNA表達比較（±s）

表2 各組小鼠缺血側皮質m6A甲基化酶mRNA表達比較（±s）

ALKBH5 1.01±0.08 0.60±0.10**0.75±0.08#0.99±0.08 0.44±0.11**▲0.60±0.07#◇◇組別WT對照組WT模型組WT補陽還五湯組KO對照組KO模型組KO補陽還五湯組只數6 6 6 6 6 6 METTL3 1.01±0.04 1.08±0.23 0.99±0.24 1.01±0.07 1.05±0.13 0.99±0.15 METTL14 0.99±0.06 1.09±0.20 0.94±0.24 0.97±0.10 1.04±0.10 1.06±0.16 WTAP 0.99±0.11 1.06±0.21 1.01±0.15 1.00±0.07 1.34±0.11**▲1.16±0.07##FTO 1.00±0.10 0.48±0.09**0.70±0.11##0.98±0.08 0.30±0.06**▲▲0.52±0.08##◇◇

5 討論

缺血性腦卒中屬中醫學“中風”范疇，多因風、痰、瘀、火留滯經絡，氣血運行不暢所致，氣虛血瘀是中風病重要的病理因素[11]。補陽還五湯為治療中風病氣虛血瘀證的代表方，其君藥黃芪有消瘀不傷正之效，臣以當歸尾化瘀不傷血，佐以川芎、赤芍、桃仁、紅花活血祛瘀，地龍通絡。全方具備補氣為先，祛瘀為輔，標本兼顧之特點。課題組既往研究表明，補陽還五湯能夠通過多途徑、多通路、多靶點發揮抗腦缺血損傷的作用[12-13]。

腦缺血后缺血半暗區血流的恢復有賴于側支循環的建立，新形成的側支血管可明顯改善缺血區周圍組織灌流，血管新生通過啟動損傷區微血管網重建，為損傷神經元修復、突觸重建和神經發生創造良好的微環境[9，14]。臨床研究顯示，腦梗死患者腦組織血管密度與腦卒中預后呈正相關[2]。本研究中，小鼠在腦缺血后有一定的血管內皮細胞新生，但新生細胞數量有限。補陽還五湯干預能顯著提高缺血側皮質新生血管內皮細胞的數量，提示補陽還五湯能夠促進腦缺血后血管新生。

m6A修飾是一種動態的表觀遺傳修飾，不僅影響mRNA的穩定性，還能影響mRNA的翻譯潛能[15]。本研究顯示，缺血側皮質m6A水平較同基因型對照組顯著升高，與既往研究結果[16]一致。m6A修飾是動態且可逆的，由甲基化轉移酶安裝，去甲基化酶刪除。為此，本研究檢測5種常見的m6A甲基化酶的表達水平，發現KO模型組小鼠缺血皮質區WTAP表達上調，WT及KO模型組小鼠FTO和ALKBH5表達下調，補陽還五湯能逆轉上述變化，但METTL3和METTL14甲基化轉移酶表達未見明顯變化。WTAP是一種m6A甲基化轉移酶，其高表達可能導致m6A水平上升[17]，目前其與腦缺血相關的報道較少，有待進一步研究。FTO是一種m6A去甲基化酶，在腦內有豐富的表達[18]。有研究表明，FTO在腦缺血皮質神經元中特異性下調[19]，在梗死心肌細胞中FTO的表達也下調[20]，表明缺血損傷中FTO普遍呈低表達。而過表達FTO可減輕腦缺血導致的神經元凋亡[16]。ALKBH5也是一種m6A去甲基化酶，既往研究表明，在缺氧復氧處理的神經元中敲除ALKBH5會加重神經元損傷[16]。此外，ALKBH5能夠去甲基化B 淋巴細胞瘤-2（BCL2），防止BCL2 mRNA降解，并抑制神經元凋亡[21]。推測補陽還五湯可能通過影響m6A修飾，發揮抗腦缺血損傷的作用。

細胞膜小窩是細胞膜上的特殊凹陷，是各類細胞信號分子的聚集地，在血管內皮細胞及神經元中有豐富的表達。Cav-1是小窩中重要的功能結構與核心蛋白，其不僅參與神經系統發育，也能調節血腦屏障通透性、炎癥、血管新生和神經再生等參與腦缺血損傷[22]。研究表明，過表達Cav-1可明顯促進內皮細胞分化并上調毛細血管樣管狀結構數量，沉默Cav-1表達則導致毛細血管樣管狀結構數量減少，提示Cav-1可能在腦缺血后的血管新生過程中發揮重要作用[23]。此外，研究表明，Cav-1可能與m6A水平密切相關，如Cav-1對于FTO敲低細胞的增殖和轉移至關重要，FTO能夠通過Cav-1影響細胞的能量代謝水平[24]。本研究發現，雖然各組WT小鼠WTAP表達無明顯變化，但KO模型組小鼠WTAP表達上調，提示在腦缺血后Cav-1可能通過調控WTAP表達，影響m6A修飾的RNA甲基化水平，其機制有待進一步研究。同時，KO模型組及KO補陽還五湯組與各自WT組相比，FTO和ALKBH5表達下降，提示在腦缺血后Cav-1可能通過影響去甲基化酶FTO及ALKBH5，調控m6A水平。此外，本研究還發現補陽還五湯能夠促進腦缺血后神經功能恢復及血管新生，降低病理形態損傷及m6A修飾的RNA甲基化水平，但KO小鼠的神經功能恢復、病理形態改善、新生血管內皮數目及RNA甲基化水平不及WT組。

綜上所述，Cav-1缺失會抑制腦缺血后血管新生，加劇m6A水平失調。補陽還五湯可能通過Cav-1調控腦缺血小鼠m6A修飾的RNA甲基化水平，促進血管新生。本研究同時從Cav-1及m6A修飾角度探討補陽還五湯促進腦缺血后血管新生的機制，可為補陽還五湯的表觀轉錄機制研究提供新思路。