不同產(chǎn)地3種膿瘡草屬藥用植物的非揮發(fā)性成分分析

張俊紅， 蘇志強， 何艷青， 鐘惠青， 丁漢朋

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，廣東廣州 510405；2.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院藥學部，廣東深圳 518000）

膿瘡草又稱白益母草，《中華本草》[1]記載：“膿瘡草味苦、辛，性涼，可活血調經(jīng)、消腫止痛。”產(chǎn)地較為狹窄，多分布在內蒙古地區(qū)，被蒙醫(yī)譽為“瘡疾之圣藥”。唇形科膿瘡草屬（Panzeria Moench）植物按照《中國植物志》其分為3 個種，即膿瘡草（P.alaschanica）、 甘肅膿瘡草（P.kansuensis）和小花膿瘡草（P.parviflara）[2]。但目前，膿瘡草藥材資源的有效活性成分及其生物種類成分差異尚不完全清楚。基于此，本研究對甘肅、陜西、新疆、寧夏及內蒙古等不同產(chǎn)地膿瘡草屬藥用植物的膿瘡草（P.alaschanica）、甘肅膿瘡草（P.kansuensis）和小花膿瘡草（P.parviflara）非揮發(fā)性成分差異進行分析，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器冷凍離心機（H1650-W 型，湖南湘儀集團）；DNA 提取研磨儀（MM400 型，德國Retsch公司）；凝膠成像儀（JYO4S-3C型，北京君意東方電泳設備有限公司）；PCR 儀（MG96+型，杭州朗基科儀公司）；水平電泳儀（JY300C 型，北京君意東方電泳設備有限公司）；3730XL 測序儀（62500200型，美國ABI公司）。

1.2 試劑綠原酸（成都植物純化公司，批號：Y02J11L113432）；檸檬酸、異槲皮苷、山柰酚、芹菜苷、水仙苷、水蘇堿等物質的標準品（成都植物純化公司，批號：P25J9L66554），且標準品純度均高于98%；高效甲酸、乙腈（美國賽默飛世爾公司）。

1.3 樣品本研究中膿瘡草屬藥用植物膿瘡草（P.alaschanica）、甘肅膿瘡草（P.kansuensis）和小花膿瘡草（P.parviflara）的產(chǎn)地分布上包括我國甘肅、陜西、新疆、寧夏及內蒙古等地。樣品采集信息見表1。

表1 膿瘡草屬樣品采集信息Table 1 Sample collection information of Panzeria Moench samples

1.4 標準品溶液的制備取適量綠原酸、水蘇堿和檸檬酸，以蒸餾水溶解制備成終濃度為100 pg/mL的標準品溶液。異槲皮苷以及水蘇堿等標準品精確稱量，以甲醇/H2O（v/v= 70/30）溶解液制備成終濃度為100 μg/mL 的標準品溶液。所有標準品溶液均于4 ℃冰箱中儲存。

1.5 供試品溶液的制備取1 g膿瘡草屬樣品（S1 ～S4）粉末，置于50 mL 錐形瓶內加30 mL 甲醇/H2O（v/v= 70/30）后超聲（500 W，40 Hz）提取30 min。收集到的提取溶液用0.22 μg濾膜過濾，備用。

1.6 飛行時間質譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF/MS）技術色譜柱為ACQUITY BEH C18（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm），流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃。梯度程序：0.00 ～0.50 min，10% ～12% B；0.50 ～1.80 min，12% ～13% B；1.80 ～2.00 min，13% ～17% B；2.00 ～7.50 min，17% ～20% B；7.50 ～9.00 min，20% ～34% B；9.00 ～12.00 min，34% ～35% B；12.00 ～13.50 min，35%～45%B；13.50 ～15.00 min，45% ～46% B；15.00 ～19.00 min，46% ～71% B；19.00 ～30.00 min，71%～90%B，31.00 ～32.00 min，90%B。進樣量為2 μg。

質譜分析是在配備電噴霧電離源（ESI）的Waters QTOF Synapt G1-Si 質譜儀（Waters Corp，美國）上進行的。所有樣本均進行了ESI-以及ESI+多種模式的測定方法，具體參數(shù)如下：MSE，質量掃描范圍m/z為100 ～1 500 Da，錐電壓25 V，脫溶的氣流量850 L/h，溫度450 ℃，毛細管電壓3 000 V，同時，低CE 掃描中，碰撞能量為6 eV、4 eV，高碰撞能量掃描則為35 ～60 eV、12 eV。

1.7 指紋圖譜方法學分析將供試樣品S14 溶液在同日內進行6次檢測，以檢測值評估儀器的日內精密水平，而在持續(xù)5 d 評估S14 溶液的相對標準偏差（RSD）水平以此評估日間的精密水平。將S14藥材平行制作5 份，按照“1.6”項下UPLC-QTOF/MS 方法進行重復性檢驗。并且于4 ℃溫度對0、2、4、8、24、36、48 h S14 樣品結果進行統(tǒng)計分析。通過分析數(shù)據(jù)來評估樣品的平穩(wěn)水平，以RSD表示以上所有評估的變異程度。

1.8 數(shù)據(jù)處理通過Waters 分析軟件MarkerLynx XS 4.1進行數(shù)據(jù)分析。設定數(shù)值如下：樣品保留時間為0.4 ～30 min；離子碎片的質量范圍設定為50 ～1 000 Da；質量公差設定為50 mDa；干擾信號消除數(shù)值為6；同時同位素峰被排除分析。最終應用Simca-p軟件進行樣品主成分分析。

2 結果

2.1 化合物鑒定

2.1.1 UPLC-Q-TOF/MS 定性分析 本次研究主要對內蒙古產(chǎn)膿瘡草（S7、S8）進行UPLC-Q-TOF/MS 定性分析，色譜圖如圖1 所示。根據(jù)標準品、參考文獻和相關的數(shù)據(jù)庫，共鑒定了41 種化合物，涵蓋黃酮類、生物堿類、有機酸類以及木脂素類等，見表2。

圖1 內蒙古產(chǎn)膿瘡草基峰離子（BPI）Figure 1 Base peak ion of P.alaschanica from Inner Mongolia（BPI）

表2 內蒙古產(chǎn)膿瘡草化學成分UPLC-Q-TOF/MS 分析Table 2 UPLC-Q-TOF/MS analysis of chemical composition in P.alaschanica from Inner Mongolia

2.1.2 黃酮類成分分析 共得到黃酮類成分16種，其中包括槲皮素、異鼠李素及其衍生物。通過對標準品的分析，針對苷元的特征離子進行總結，并以此確定了苷元的類型。之后，依據(jù)糖基化以及糖苷位置判斷化合物，對槲皮素以及異鼠李素衍生物的鑒定進行分析。

負離子模式中化合物10 于m/z609 區(qū)域產(chǎn)生了[M-H]-離子峰。高CE 掃描結果顯示，其m/z數(shù)值對應151、227、255、300、301，這種裂解規(guī)律與槲皮素的相似性較高。同時，m/z301[M-308]-顯示出己糖以及脫氧己糖的中性缺失。結果中新橙皮苷[M-H-120]-的特征峰未見展現(xiàn)，m/z300 代表苷元自由基，m/z255、151、227 片段是由自由基裂解而成。見圖2。通過標準品的分析能夠確認為蘆丁物質，異槲皮苷于m/z463 區(qū)域中展現(xiàn)出[M-H]-離子，并且在m/z301 區(qū)域中展現(xiàn)出了較為明顯的碎片離子峰，同時m/z有151、179、227、255、271、300、301 碎片離子峰，由此可見其苷元為槲皮素。經(jīng)標準品鑒定為異槲皮苷。

圖2 蘆丁的裂解途徑和質譜圖分析Figure 2 Cleavage pathway and mass spectrometric analysis of rutin

異鼠李素3-O-葡萄糖苷于m/z477區(qū)域產(chǎn)生了[M-H]-離子，且于m/z315 區(qū)域中產(chǎn)生了較為明顯的碎片離子峰。同時，m/z314 區(qū)域展現(xiàn)為苷元自由基峰，且m/z285、271、243 是由苷元自由基裂解后而成的碎片離子峰。見圖3。

圖3 異鼠李素-3-O-葡萄糖苷的裂解途徑及質譜圖分析Figure 3 Cleavage pathway and mass spectrometric analysis of isorhamnetin-3-O-glucoside

水仙苷于m/z623 區(qū)域中產(chǎn)生了[M-H]-離子，同時，于m/z315 區(qū)域中產(chǎn)生了明顯的碎片離子峰，因糖基中1→6 鍵相較于單糖的糖原離子發(fā)生率更高，所以在m/z315 區(qū)域的離子峰相較于化合物18的表現(xiàn)更強。見圖4。結果表明其為水仙苷。

圖4 水仙苷裂解途徑和MS/MS分析Figure 4 Narcissin cleavage pathway and MS/MS analysis

2.1.3 生物堿類成分分析 對于生物堿類成分的鑒定結果只發(fā)現(xiàn)了1 類，正離子模式中，化合物1以m/z287[2M-H]+、m/z144[M]+形式存在，并且高CE 檢測結果顯示，在m/z58、84、102、116 區(qū)域中展現(xiàn)出特征離子峰，相對而言，特征碎片丟失依次為m/z28、42、60、86。見圖5。

圖5 水蘇堿裂解途徑以及MS/MS分析Figure 5 Cleavage pathway of hydrastine and MS/MS analysis

2.1.4 有機酸類成分分析 在內蒙古膿瘡草中共鑒定出2 種有機酸。化合物2 于m/z191[M-H]-產(chǎn)生了碎片離子峰。高CE 檢測結果顯示，于m/z173[M-H-H2O]-、m/z111[M-H-H2O]-和m/z85[M-HH2O-2CO2]區(qū)域產(chǎn)生較為明顯的碎片離子。見圖6。

圖6 綠原酸破碎途徑以及MS/MS分析Figure 6 Chlorogenic acid fragmentation pathway and MS/MS analysis

2.1.5 木脂素類成分分析 毛蕊糖苷于m/z623區(qū)域中產(chǎn)生了[M-H]-離子峰，其關鍵峰分別為m/z461、m/z315和m/z161。見圖7。

圖7 毛蕊糖苷的質譜以及裂解途徑Figure 7 Mass spectra of trichothecene and the cleavage pathway

2.23種膿瘡草中藥指紋圖譜的相似性分析

2.2.1 方法學考察

2.2.1.1 穩(wěn)定性分析 結果顯示，S1 ～S14 各色譜圖的相似度均高于0.99，異槲皮素以及蘆丁的相對峰面積RSD 水平均低于4.9%，表明樣品在室溫條件下24 h內的穩(wěn)定性較好。

2.2.1.2 重復性分析 結果顯示，S1 ～S14 各色譜圖的相似度均高于0.98，異槲皮素以及蘆丁的相對峰面積的RSD 水平處于0.3% ～2.94%之間，表明樣品精確度較高。

2.2.2 構建指紋圖譜 將數(shù)據(jù)導入中藥指紋圖譜相似度計算軟件，進行色譜峰差異性評價和整體相似度評價。色譜圖相似性評價結果可見，甘肅膿瘡草、膿瘡草的相似水平均大于0.97，表明相似度較高。由此可見，就成分而言，小花膿瘡草與甘肅膿瘡草、膿瘡草差異性較為明顯，甘肅膿瘡草和膿瘡草兩者的成分相似度較高。

2.2.3 主成分分析 圖8-A 結果顯示，S5 膿瘡草與S10甘肅膿瘡草的主要成分與其他樣品間產(chǎn)生了較大背離效應，表明這2種樣品中具有顯著的離群水平，另外，S5膿瘡草與S10甘肅膿瘡草的圖示所在位置遠高于置信區(qū)間，表現(xiàn)出較為明顯的異常值。由此可見，S5膿瘡草與S10甘肅膿瘡草相較于其他樣品結果具有很大的偏差。對S5膿瘡草與S10甘肅膿瘡草的主要成分進行提取分析，結果如圖8-B 所示。在17.102、17.845 min 這2 個時間中，樣本的主成分差異較大，與S5膿瘡草、S10甘肅膿瘡草呈負相關，與其他樣品呈正相關。在16.184、20.643 min 2 個時間中，樣本的主成分差異同樣較大，S5 膿瘡草與S10 甘肅膿瘡草呈正相關。

圖8 膿瘡草屬樣品（S1 ～S14）主成分分析Figure 8 Principal component analysis of Panzeria Moench samples（S1-S14）

3 討論

本研究應用UPLC-Q-TOF/MS 技術揭示了內蒙古產(chǎn)膿瘡草中的化學成分，共鑒定了41 種化學成分，包括黃酮類、生物堿類、有機酸類及木脂素類成分。在所鑒定到的成分中，內蒙古產(chǎn)膿瘡草中主要含有較多種類的黃酮類成分，包括黃酮和黃酮醇類成分。根據(jù)已有的文獻報道，黃酮類成分具有多種的生物活性[3]，如抗炎[4]、抗氧化[5-6]等。而對于膿瘡草的功效記載其解毒消腫的功效，可能與其含有多種黃酮類成分相關[7]。

按照《中國植物志》分類方式，本研究采用中藥指紋圖譜相似度和主成分分析的方法，對小花膿瘡草、甘肅膿瘡草和膿瘡草等3個種屬的成分進行比較分析，結果顯示，小花膿瘡草在成分種類和含量上，與甘肅膿瘡草和膿瘡草存在較大的差異，而甘肅膿瘡草與膿瘡草在成分上則沒有明顯的差異。且甘肅、陜西、內蒙古產(chǎn)地膿瘡草在化學成分上同樣呈現(xiàn)出相似性。甘肅膿瘡草和膿瘡草中含有較多的水仙苷，而小花膿瘡草中水仙苷成分的含量相對較少。從成分分析的結果來看，小花膿瘡草的生物學活性與膿瘡草可能存在藥效差異。甘肅膿瘡草在非揮發(fā)性成分的含量和種類上均與膿瘡草呈現(xiàn)出相似性，且無論是中藥指紋圖譜相似性評價結果還是主成分分析結果，均表現(xiàn)出高度的一致性。

但本次研究未檢測揮發(fā)性成分，且藥用植物對于成分和含量檢測的最終目的是確保藥效，對于甘肅膿瘡草能否與膿瘡草發(fā)揮同等的生物活性，有待于更深的成分檢測分析和藥理實驗的進一步驗證。