廣西鐵皮石斛核苷類成分和多糖的含量研究

吳樟樺， 胡莉， 李錦妍， 張林， 黃月純，3， 李運容， 魏剛

（1.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510006；3.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405；4.廣西中醫藥大學附屬國際壯醫醫院，廣西南寧 530201）

鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛Dendrobium officinaleKimuraetMigo 的干燥莖，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，為傳統名貴珍稀中藥材[1]。北宋蘇頌編撰具官修性質的《本草圖經》記載：“石斛，生六安山谷水傍石上，今荊湖、川、廣州郡及溫、臺州亦有之，以廣南者為佳。”此后，明清的主要本草基本沿用了石斛“以廣南者為佳”的記載，此處的“廣南”意為宋朝時期的“廣南路”，意指今天的廣東、廣西兩省[2]。本課題組前期進行了大量的本草考證和實地考察，本草記載應用最廣、最久的藥用石斛應為鐵皮石斛，且廣西、廣東為鐵皮石斛的主要道地產區之一，已有1 000年以上的應用歷史[3]。

核苷類物質是生命活動過程中的重要代謝產物，在抗腫瘤、保護心肌損傷、抗病毒、免疫調節、抗菌抗炎等生命調節過程中起著重要的作用[4-6]。一直以來，人們利用核苷類物質特性，研發了多種核苷類藥物用于人類疾病等領域中。與此同時，天然核苷類物質在醫藥領域也持續受到科學關注。近年來，它不僅被作為人類疾病診斷的生物標志物，在中藥材品質評價及質量研究中也是重要的生物活性成分檢測指標，甚至作為質量標記用于名貴藥材品質評價。如2020 年版《中國藥典》中規定，冬蟲夏草腺苷的含量不得少于0.01%[7]。因此，分析廣西鐵皮石斛核苷類成分具有重要的研究意義。

中藥多糖具有免疫調節、抗腫瘤、降血脂、抗輻射、抗蟲害等作用[8]。多糖是鐵皮石斛的重要成分，鐵皮石斛因含有較高的多糖含量而區別于其他品種的石斛，《中國藥典》對鐵皮石斛中D-甘露糖、D-葡萄糖的含量和比值作了明確規定[7]。已有研究表明，鐵皮石斛中D-甘露糖與D-葡萄糖高效液相色譜（HPLC）含量測定方法重復性較好，用兩者含量之和替代具有較大誤差的總多糖含量作為測定指標具有可行性[9]。但針對廣西產區的鐵皮石斛以及生長年限、種植模式對多糖含量影響尚不清楚。

本研究建立了鳥苷、尿苷、腺苷以及多糖類成分（D-甘露糖和D-葡萄糖）HPLC 含量測定方法，并選取24 批不同生長年限和種植模式的廣西鐵皮石斛進行含量測定，分析廣西鐵皮石斛核苷類及多糖類成分的范圍，并探討生長年限與種植模式對這些成分含量的影響，為廣西鐵皮石斛的質量控制提供參考依據。現將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 儀器與試劑MS-204S（d=0.1 mg）電子天平（瑞士Mettler Teledo公司）；MS-105 Du（d=0.01 mg）電子天平（瑞士Mettle Toledo 公司）；KQ-400KDE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；金剛手提式多功能粉碎機（上海市廣沙工貿有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；DHG-9245A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；予華SHZ-D（III）循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，HP1260）；TDZ4-WS 型離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；鹵素水分測定儀（HB43-S）。乙睛（色譜純），甲醇（色譜純）均購自德國Merck 公司；水為屈臣氏蒸餾水，三氯甲烷、鹽酸等其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 核苷類成分（尿苷、鳥苷、腺苷）含量測定研究

2.1.1 對照品溶液的制備 分別取尿苷對照品2.1 mg、鳥苷對照品2.4 mg、腺苷對照品2.3 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加60%甲醇稀釋至刻度，分別制成尿苷對照品溶液（0.084 mg/mL）、鳥苷對照品溶液（0.096 mg/mL）、腺苷對照品溶液（0.092 mg/mL）。

2.1.2 供試品溶液制備 石斛鮮品洗凈，去除其根、葉，取其莖，切碎后冷凍干燥或采用60 ℃低溫熱風干燥，干品粉碎，過65 目篩（四號篩），所有樣品低溫干燥保存。精密稱取樣品粉末（過四號篩）各1 g，精密稱定，加入50 mL 80%甲醇，超聲處理1 h，取出，放冷至室溫，濾過，用甲醇適量洗滌濾渣，合并濾液，揮干溶劑，殘渣加60%甲醇使其溶解，置于10 mL容量瓶中，加60%甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液，用于含量測定。

2.1.3 色譜條件 Zorbax SB Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～10 min，99%～95%B；10～15 min，95%～85%B；15 ～20 min，85%～80%B；20 ～30 min，80%～80%B；30 ～35 min，80%～99%B）；流速1.2 mL/min；柱溫20 ℃；檢測波長260 nm；進樣量4 μL。分離度良好，如圖1所示。

圖1 核苷類成分對照品及廣西鐵皮石斛樣品（S13）高效液相色譜（HPLC）圖譜Figure 1 High performance liquid chromatography（HPLC）chromatogram of Dendrobium nucleoside components control and the sample of Dendrobium officinale from Guangxi（S13）

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 精密度考察 精密吸取同一供試品溶液（S13）4 μL，連續進樣6 次，記錄峰面積。結果顯示：尿苷平均峰面積為99.093，相對標準偏差（RSD）為0.98%；鳥苷平均峰面積為87.700，RSD為0.62%；腺苷平均峰面積為187.279，RSD 為1.66%。結果表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 穩定性考察 精密吸取同一供試品溶液（S13）4 μL，分別在0、4、8、12、18、24 h 進樣，記錄峰面積。結果顯示：尿苷平均峰面積為100.850，RSD為0.74%；鳥苷平均峰面積為88.184，RSD 為0.73%；腺苷平均峰面積為186.824，RSD為1.15%。結果表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

3．3 本研究的臨床意義 心理理論是兒童重要的社會技能之一，而愿望和信念理解又是兒童心理理論發展中的兩項重要能力。孤獨癥兒童的社會交往障礙與其心理理論缺失有很大關系。本研究顯示智齡在3～5歲的孤獨癥兒童能理解愿望，卻在信念推理與錯誤信念理解方面存在困難。這說明對智齡較小的孤獨癥來說愿望理解更容易。因此，在臨床康復訓練時，應該針對孤獨癥兒童心理理論自身發展的特點，從愿望理解方面著手，訓練兒童區分自己和他人的愿望，了解愿望－情緒－行為之間的關系，并以此為基礎訓練兒童對信念的理解。

2.1.4.3 重復性考察 取同一樣品（S13）6 份，依法制備，進樣測定，記錄峰面積。結果顯示：尿苷平均含量為0.727 1 mg/g，RSD 為0.88%；鳥苷平均含量為0.122 2 mg/g，RSD 為0.79%；腺苷平均含量為0.257 9 mg/g，RSD 為0.33%。結果表明該方法重復性良好。

2.1.4.4 線性范圍考察 分別從“2.1.1”項下各對照品溶液中取出1 mL 置于5 mL 容量瓶，加60%甲醇定容至刻度，制成尿苷（0.016 73 mg/mL）、鳥苷（0.019 20 mg/mL）、腺苷（0.018 40 mg/mL）混合對照溶液。依照“2.1.3”項下色譜條件入液相色譜儀，進樣體積依次為0.5、1、2、5、7.5、10、12.5、15 μL，記錄峰面積。以對照品進樣量（X）為橫坐標，對照品峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，計算各對照品的回歸方程。各對照品的回歸方程如表1所示。

表1 尿苷、鳥苷、腺苷線性關系Table 1 Linear relation test results of uridine，guanosine，adenosine

2.1.4.5 加樣回收率考察 稱取已知含量的廣西鐵皮石斛樣品（S13）各6 份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.1.2 ”項下方法提取，進行測定，記錄峰面積，并計算回收率和RSD。結果顯示：尿苷平均回收率102.08%，RSD 為1.92%；鳥苷的平均回收率99.79%，RSD 為2.00%；腺苷的平均回收率100.39%，RSD 為2.28%。結果如表2所示。

表2 尿苷、鳥苷、腺苷平均加樣回收率結果Table 2 Average recovery results of uridine，guanosine，adenosine

2.1.5 樣品的測定 取不同批次的廣西鐵皮石斛樣品粉末，按“2.1.2”項下供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件測定，記錄尿苷、鳥苷、腺苷的峰面積，計算含量及三者含量之和。所有樣品的含量測定結果如表3所示。

表3 24批廣西鐵皮石斛核苷類成分含量測定結果Table 3 Determination results of the contents of nucleosides in 24 batches of Dendrobium officinale from Guangxi

2.2D-甘露糖、D-葡萄糖HPLC柱前衍生含量測定

2.2.1 對照品與供試品溶液的制備 同文獻研究[10]的制備方法。

2.2.2 色譜條件 同文獻研究[10]的色譜條件。結果分離度良好，如圖2所示。

圖2 混合單糖對照品與廣西鐵皮石斛樣品（S14）高效液相色譜（HPLC）圖譜Figure 2 HPLC chromatogram of mixed monosaccharide reference substance control and the sample of Dendrobium officinale from Guangxi（S14）

2.2.3 相對校正因子的計算 同文獻研究[10]的校正因子計算。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 精密度考察 精密吸取同一供試品溶液（S14）10 μL，連續進樣6 次，記錄峰面積。結果顯示：D-甘露糖平均峰面積為2 897.85，RSD 為0.93%；D-葡萄糖平均峰面積為408.74，RSD 為2.33%。結果表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 穩定性考察 精密吸取同一供試品溶液（S14）10 μL，分別在0、2、4、6、8、16、24 h 進樣，記錄峰面積。結果顯示：D-甘露糖平均峰面積為2 875.46，RSD 為1.35%；D-葡萄糖平均峰面積為408.41，RSD 為1.01%。結果表明，供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.4.3 重復性考察 取同一樣品（S14）6 份，依法制備，進樣測定，記錄峰面積。結果顯示：D-甘露糖平均含量為31.61%，RSD 為1.43%；D-葡萄糖平均含量為4.76%，RSD 為1.32%。結果表明該方法重復性良好。

2.2.4.4 線性范圍考察 同文獻研究[10]的線性考察結果。

2.2.4.5 加樣回收率考察 稱取已知含量的廣西石斛樣品（S14）各6 份，每份約0.06 g，精密稱定，按“2.2.1”項下方法提取。揮干后的濾紙筒拆開剪碎連同濾渣置于燒杯中，加水100 mL，并加入相當于樣品D-甘露糖、D-葡萄糖含量的對照品。再精密加入內標溶液2 mL（12.016 mg/mL），按“2.2.1”項下方法制備，進行測定，記錄峰面積，并計算回收率和RSD。結果顯示：D-甘露糖平均回收率99.74%，RSD 為2.08%；D-葡萄糖的平均回收率100.79%，RSD為2.37%。

2.2.5 含量測定 取不同批次的廣西石斛樣品粉末，按“2.2.1”項下供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，按“2.2.2”項下色譜條件測定，記錄D-甘露糖、D-葡萄糖和內標物的峰面積。以內標法計算各樣品中D-甘露糖含量、D-葡萄糖含量，并計算兩者含量之和。結果見表4。

表4 廣西鐵皮石斛D-甘露糖、D-葡萄糖的含量及兩者含量之和Table 4 Contents and the sum of D-mannose and D-glucose in Dendrobium officinale from Guangxi

3 討論

3.1 廣西鐵皮石槲核苷類成分含量測定分析比較供試品不同溶媒（70%甲醇，80%甲醇，90%甲醇，甲醇）、不同提取時間（50、60、70 min）、料液比（1∶50、1∶75、1∶100）的提取效果，分析表明，因為核苷類成分的親水性，采用含醇量較高的溶媒會降低提取效率，但采用70%甲醇溶液作為溶媒時會提取出更多水溶性物質，造成供試品雜質過多，極易堵塞儀器與色譜柱，故最后采用80%甲醇作為提取溶媒。對于不同的提取時間和料液比，都能達到較好的分離度，實驗結果顯示，以60 min、料液比1∶50 條件下，提取效率更高。

本研究測得的廣西仿野生鐵皮石斛的尿苷、鳥苷、腺苷平均含量以及這3種核苷成分總平均含量分別為0.075 6 ～0.160 0 mg/g（均值為0.109 1 mg/g）、0.070 4 ～0.195 4 mg/g（均值為0.124 1 mg/g）、0.096 4 ～0.217 3 mg/g（均值為0.147 3 mg/g）和0.242 4 ～0.564 6 mg/g（均值為0.380 4 mg/g）；廣西大棚種植鐵皮石斛的尿苷、鳥苷、腺苷平均含量以及這3 種核苷成分總平均含量分別為0.040 6 ～0.147 2 mg/g（均值為0.086 4 mg/g）、0.039 5 ～0.153 9 mg/g（均值為0.085 6 mg/g）、0.079 8 ～0.197 9 mg/g（均值為0.118 1 mg/g）和0.159 9 ～0.490 7 mg/g（均值為0.290 1 mg/g）。結果表明，廣西鐵皮石斛核苷類成分含量相對較高，仿野生鐵皮石斛3種核苷成分的平均含量比大棚種植的高，由此可見，核苷類成分在仿野生種植樣品更有優勢。

在仿野生種植樣品中，根據生長年限一共分為1 ～2 年生和2 年及以上兩組。1 ～2 年生樣品的尿苷、鳥苷、腺苷平均含量以及這3 種核苷類成分總平均含量分別為0.110 1 ～0.160 0 mg/g（均值為0.136 8 mg/g）、0.135 3 ～0.195 4 mg/g（均值為0.166 3 mg/g）、0.129 5 ～0.217 3 mg/g（均值為0.184 9 mg/g）和0.386 4 ～0.564 6 mg/g（均值為0.488 1 mg/g）；2 年及以上生樣品的尿苷、鳥苷、腺苷平均含量以及這3種核苷類成分總平均含量分別為0.075 6 ～0.093 4 mg/g（均值為0.081 3 mg/g）、0.070 4 ～0.094 4 mg/g（均值為0.081 9 mg/g）、0.096 4 ～0.125 4 mg/g（均值為0.109 6 mg/g）和0.242 4 ～0.311 2 mg/g（均值為0.272 7 mg/g）。結果表明，隨著生長年限的增加，廣西仿野生鐵皮石斛核苷類成分含量有降低趨勢。

3.2 多糖（D-甘露糖、D-葡萄糖）含量的測定本研究參考課題組前期霍山石斛含量的測定方法，采用HPLC 柱前衍生的方法并進行了方法學的驗證，結果表明此方法穩定可靠，可以用于廣西鐵皮石斛多糖含量的測定。

所有的廣西鐵皮石斛樣品D-甘露糖含量范圍17.71%～35.04%（均值為24.08%）、D-葡萄糖含量范圍2.63%～14.02%（均值為5.84%）、D-甘露糖與D-葡萄糖含量之和范圍20.34% ～44.35%（均值為29.92%）均符合藥典相關含量限度要求。其中：仿野生廣西鐵皮石斛的D-甘露糖的平均含量為17.71%～35.04%（均值為23.72%），D-葡萄糖的平均含量為2.63%～5.73%（均值為4.18%），D-甘露糖與D-葡萄糖含量之和為20.34%～40.29%（均值為27.91%）；大棚栽培廣西鐵皮石斛的D-甘露糖的平均含量為18.51% ～32.54%（均值為24.81%），D-葡萄糖的平均含量為5.87% ～14.02%（均值為9.14%），D-甘露糖與D-葡萄糖平均含量之和為25.32% ～44.35%（均值為33.95%）。從整體趨勢來看，大棚種植廣西鐵皮石斛的多糖含量比仿野生樣品高，這可能是因為在野外環境下，植物需要消耗更多的糖分等供能物質來維持自身代謝以及抵御惡劣環境的脅迫。

仿野生廣西鐵皮石斛1～2 年生樣品的D-甘露糖的平均含量為20.36%～35.04%（均值為27.29%），D-葡萄糖的平均含量為3.93～5.73%（均值為4.75%），D-甘露糖與D-葡萄糖含量之和為24.43%～40.29%（均值為32.05%）；2 年及以上樣品的D-甘露糖的平均含量為17.71%～24.44%（均值為20.15%），D-葡萄糖的平均含量為2.63%～5.06%（均值為3.61%），D-甘露糖與D-葡萄糖平均含量之和為20.34%～27.97%（均值為23.76%）。在不同生長年份的仿野生鐵皮石斛中，呈現出1～2 年生樣品的多糖含量高于2～3 年生樣品。

綜上所述，廣西鐵皮石斛具有一定含量的核苷類成分和多糖成分，有一定的優越性，其核苷類和多糖成分的含量與種植模式和生長年限相關，可以為廣西鐵皮石斛的質量評價提供一定的依據。