質譜分析聯合網絡藥理學探析固本方對三陰性乳腺癌的作用機制

楊麗娜， 楊振江， 古宏暉， 陳鐘， 何力

（深圳市中醫院腫瘤與血液病科，廣東深圳 518033）

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指病理表現為雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體（human epidermal growth factor receptor，HER2）均陰性的一種特殊類型乳腺癌，占女性乳腺癌15%左右，與其他類型乳腺癌5年生存率相差12%～20%，預后差的主要原因為容易復發轉移、且一旦復發轉移后缺乏有效治療[1]。早期降低復發轉移是改善TNBC 不良預后的重要手段，除了通過新輔助化療、免疫治療提高病理完全緩解（pathological complete response，PCR）率，以及輔助化療方案優化，術后綜合治療后的維持治療也是一種重要手段。口服甲氨喋呤、環磷酰胺、卡培他濱等藥物被用于Ⅱ～Ⅲ期TNBC 綜合治療后的維持治療，可延長術后2 ～3 年無病生存期（disease-free survival，DFS）、減少復發轉移率。盡管這些口服化療藥物服用簡便、費用相對低廉，但長期服用存在化療毒副作用，限制臨床應用，目前TNBC 術后仍缺乏有效的維持治療方法[2-4]。而中醫藥治療TNBC 顯示出了一定的優勢，有研究[5-6]表明，聯合或者不聯合西醫放化療，中成藥或辨證中藥內服作為TNBC 術后維持治療手段，不僅可改善患者癥狀、提高卡氏評分（Karnofsky performance status，KPS）、改善生活質量，還可以降低復發轉移率、延長DFS（率）、提高生存率，且無長期口服化療藥物維持治療的毒副作用累積，如手足綜合征、骨髓抑制等，是一種可行的選擇。固本方為科室經驗方，基于文獻研究、名老中醫經驗及臨床經驗組方而成，全方扶正抗癌、調和氣機，臨床觀察可改善患者生活質量、延長DFS期[7]。本研究運用質譜聯合網絡藥理學分析固本方抗TNBC 的靶點及通路，并進行實驗驗證，以探索固本方治療TNBC 的作用機制[7]，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 質譜分析

1.1.1 質譜條件 島津LCMS-2020型質譜儀；色譜柱：Thermo AcclaimTM120 色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）。以乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液為流動相，梯度洗脫：0 ～10 min，20% ～45%乙腈；10 ～25 min，45% ～67%乙腈；25 ～30 min，67% ～90%乙腈；30 ～42 min，90%乙腈；42 ～44 min，90% ～20%乙腈；44 ～54 min，20%乙腈。柱溫：30 ℃。體積流量：0.8 mL/min。

采用電噴霧離子化源（ESI）；載氣為N2，體積流量1.5 L/min；離子噴霧溫度為350 ℃。同時檢測正負離子模式，掃描方式為選擇離子檢測模式（SIM）；用于定量分析檢測的離子為：毛蕊異黃酮葡萄糖苷m/z447.10[M+H]+；貝母素甲m/z432.30[M+H]+；澳洲茄堿m/z884.40[M+H]+；黨參炔苷m/z419.20[M+H]+；芒柄花苷m/z431.10[M+H]+；毛蕊異黃酮m/z285.05[M+H]+；芒柄花素m/z269.05[M+H]+；紫杉醇m/z854.30[M+H]+；靈芝酸Bm/z515.20[M+H]-；柴胡皂苷Am/z779.35[M+H]-；齊墩果酸m/z455.25[M+H]-；熊果酸m/z455.25[M+H]-。

1.1.2 固本方凍干粉制備 固本方中藥組成：黨參30 g、黃芪20 g、靈芝30 g、白術10 g、山藥15 g、枸杞子15 g、薏苡仁30 g、浙貝母15 g、柴胡10 g、郁金10 g、紅豆杉6 g、龍葵15 g、白花蛇舌草20 g。中藥材來源于深圳市中醫院中藥房。每劑制成400 mL 水煎劑，共3 劑，由深圳市中醫院中藥房提供。將藥液1 200 mL 使用濾紙過濾，收集濾液，使用高速離心機10 000 r/min（離心半徑4 cm）4 ℃離心15 min 進一步去除雜質，收集離心后的濾液，旋轉蒸發儀60 ℃旋轉濃縮至200 mL，置于真空凍干裝置中凍干，制備凍干粉。取固本方凍干粉1 g，精密稱定，加75%甲醇20 mL，稱定質量，再超聲30 min，放冷，用75%甲醇補足質量。

1.2 網絡藥理學分析

1.2.1 固本方潛在作用靶點收集 運用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得固本方化學成分的SMILE 結構， SwissTargetPrediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）預測靶點，去除重復值，利用UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org/）標準化靶點名稱。

1.2.2 TNBC 靶點檢索 以“triple-negative breast cancer”檢索以下數據庫：TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、Drugbank（https://www.drugbank.ca/）、OMIM（https://omim.org/）、KEGG（http://www.kegg.jp/）、PharmGkb（https://www.pharmgkb.org/）、GeneCard（https://www.genecards.org/）；以“basal-like breast carcinoma/triple-negative breast neoplasms” 檢索DisGeNET 數據庫（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）。匯總數據庫、去除重復項后得到TNBC疾病靶點。

1.2.3 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）分析 運用Venny 2.1 數據庫（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）得到固本方與TNBC 交集的靶點，利用STRING 數據庫（https://string-db.org/）構建交集靶點的PPI 網絡，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，“minimum required interaction score”設為0.90，Cytoscape NetworkAnalyzer插件展示PPI 網絡，用R 包（http://www.r-project.org/，version 3.6.0）計算基因頻數并繪制基于PPI的條形圖。

1.2.4 生物功能和通路分析 應用DAVID 工具（https://david.ncifcrf.gov/）對固本方治療TNBC 的靶點進行KEGG 富集分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

1.3 體外實驗

1.3.1 細胞株 人乳腺癌MDA-MB-231，購自上海細胞庫（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）。

1.3.2 試劑與儀器 DMEM 培養基（美國Gibco 公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測試劑盒（上海碧云天試劑公司）；兔抗蛋白激酶B（Akt）抗體、兔抗磷酸化Akt（p-Akt）抗體、兔抗磷酸化磷脂酰肌醇-3 激酶（p-PI3K）抗體、兔抗GAPDH 抗體、羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）偶聯IgG 二抗（美國Santa Cruz 公司）。低速離心機（江蘇金壇榮華儀器有限公司）；水平離心機（長沙湘智離心機有限公司）；凍干機（杭州東芝公司）；Western Blot電泳儀（上海博能公司）。

1.3.3 藥物制備 固本方溶液制備：稱取32 mg固本方凍干粉，加入DMEM 培養基100 mL，充分震蕩并超聲助溶，以6 000 r/min（離心半徑4 cm）離心10 min 后取上清，0.22 μm 濾器過濾，制備成320 μg/mL 的母液，4 ℃冰箱保存。卡培他濱片（瑞士Roche Laboratories 公司生產，批號：國藥準字J20030108）溶液制備：按文獻研究[8]方法，將卡培他濱500 mg/片研磨后用1 000 mL PBS 溶解，用DMEM培養基稀釋為1 μg/mL溶液。

1.3.4 觀察指標與方法

1.3.4.1 MTT法檢測MDA-MB-231細胞活力 按說明書操作。以固本方不同濃度（20、40、80、160、320 μg/mL）分別處理細胞，分別培養24、48、72、96 h，空白對照組用等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）處理。根據MTT實驗結果，分別使用48 h組的IC50的25%、15%、10%（132、79、 53 μg/mL）作為固本方高、中、低劑量。

1.3.4.2 Western Blot 法檢測MDA-MB-231 細胞Akt、p-Akt、p-PI3K 蛋白表達 將實驗共分為5 組：空白對照組，卡培他濱組（1 μg/mL）及固本方高、中、低劑量組。處理48 h 后收集各組細胞蛋白質樣本，二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度后分裝， 每個泳道上蛋白樣品30 μg。采用Bio-Rad標準濕式轉膜裝置，用聚偏氟乙烯（PVDF）膜，電流為300 mA，時間為90 min。使用封閉液稀釋一抗抗體（1∶1 000）、GAPDH 抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜。加入HRP 偶聯的IgG 二抗（1∶5 000）后搖床搖動室溫孵育1 h。TBST 洗膜。顯色，成像。以GAPDH 為內參對照，計算各個樣本目的蛋白條帶與GAPDH 條帶的灰度比值，作為目的蛋白的相對表達水平，應用Gel-Pro analyzer 4.0軟件進行數據分析。

1.3.5 統計方法 Graphpad Prism 7.0 軟件作圖。采用SPSS 24.0 統計軟件進行數據分析。計量資料滿足正態分布及方差齊性時，以均數± 標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），進一步采用LSD 法進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 固本方質譜分析基于ESI-LC-MS/MS 條件對固本方成分進行檢測，得到固本方正離子模式、負離子模式總離子流圖，見圖1 ～圖2。測定固本方化學成分含量，列出其來源中藥，見表1。固本方主要化學成分為：黨參炔苷、靈芝酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、柴胡皂苷A、芒柄花苷、澳洲茄堿、貝母素甲、毛蕊異黃酮、熊果酸、齊墩果酸、芒柄花素、紫杉醇。

表1 固本方化學成分含量Table 1 Chemical composition content of Guben Prescription

圖1 固本方正離子模式總離子流圖Figure 1 Total ion flow diagram for positive ion mode of the Guben Prescription

圖2 固本方負離子模式總離子流圖Figure 2 Total ion flow diagram for negative ion mode of the Guben Prescription

2.2 固本方化學成分-TNBC交集靶點運用TCMSP、PubChem 數據庫獲得固本方12 種化學成分的SMILE結構，SwissTargetPrediction 數據庫預測其作用靶點，共獲得1 231 個靶點，去除重復值后獲得575個靶點。去除重復項、標準化后共收集到TNBC靶點2 256個。

運用Venny 2.1 數據庫繪制維恩圖，得到236 個固本方與TNBC 交集的靶點，繪制交集靶點的PPI 網絡圖，前30 位靶點見圖3。絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、sarcoma 基因（SRC）、磷脂肌醇3-激酶相關基因（PIK3CA、PIK3R1）、Akt1、信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）等為固本方治療TNBC 的潛在核心靶點。

圖3 固本方治療三陰性乳腺癌（TNBC）的核心靶點Figure 3 Core targets of Guben Prescription in the treatment of triple-negative breast cancer（TNBC）

2.3 固本方治療TNBC的基因功能和通路富集分析KEGG 富集通路共得到161 條通路，圖4 顯示據基因數值（count）排序富集顯著的前20 條通路，其中，PI3K/Akt信號通路富集結果顯著且靶點數最多，提示固本方治療TNBC 中PI3K/Akt信號通路可能發揮重要作用。

圖4 固本方治療三陰性乳腺癌（TNBC）KEGG通路富集分析Figure 4 Enrichment analysis of KEGG pathway in triple-negative breast cancer（TNBC）treated with Guben Prescription

2.4MTT法測定固本方對MDA-MB-231細胞增殖的影響隨著作用時間的延長，不同濃度固本方的細胞增殖抑制率呈遞增趨勢，于96 h，各濃度固本方組的細胞增殖抑制率與空白對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.001），見圖5-A；隨著給藥濃度的增加，固本方作用不同時間后的細胞增殖抑制率遞增，固本方濃度為320 μg·mL-1時，72 h組和96 h 組的細胞增殖抑制率與24 h 組比較，差異有統計學意義（P＜0.001），見圖5-B。

圖5 不同濃度固本方對MDA-MB-231細胞增殖能力的影響Figure 5 The effect of different concentrations of Guben Prescription on the proliferative capacity of MDA-MB-231 cells

結果表明，固本方對細胞增殖的抑制時間從48 h開始趨于明顯，因此，選擇48 h時間點進行進一步研究，故以48 h 組IC50的25%、15%、10%（132、79、53 μg/mL）作為固本方高、中、低劑量組用藥濃度。

2.5 固本方對Akt、p-Akt、p-PI3K蛋白表達的影響網絡藥理學分析結果提示，固本方通過PI3K/Akt通路發揮作用。為驗證該結果，本實驗采用Western Blot 法檢測固本方作用乳腺癌細胞MDA-MB-231 后PI3K/Akt 通路中Akt、p-Akt、p-PI3K 的蛋白表達情況。圖6、表2 結果顯示，與空白對照組比較，固本方各劑量組、卡培他濱組細胞Akt、p-Akt、p-PI3K 表達蛋白水平下降（P＜0.001）；與卡培他濱組比較，固本方各劑量組細胞Akt、p-Akt、p-PI3K蛋白表達水平升高（P＜0.001）。

表2 固本方對MDA-MB-231細胞Akt、p-Akt、p-PI3K蛋白表達水平的影響Table 2 Effects of Guben Prescription on the protein expression levels of Akt，p-Akt and p-PI3K in MDA-MB-231 cells（±s，n=3）

表2 固本方對MDA-MB-231細胞Akt、p-Akt、p-PI3K蛋白表達水平的影響Table 2 Effects of Guben Prescription on the protein expression levels of Akt，p-Akt and p-PI3K in MDA-MB-231 cells（±s，n=3）

注：①P＜0.001，與空白對照組比較；②P＜0.001，與卡培他濱組比較

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圖6 固本方對MDA-MB-231細胞Akt、p-Akt、p-PI3K蛋白表達的影響Figure 6 Effect of Guben Prescription on Akt，p-Akt and p-PI3K protein expression in MDA-MB-231 cells

3 討論

三陰性乳腺癌（TNBC）患者術后易早期復發轉移，具有不同于其他類型乳腺癌的特點，歸屬于中醫學“乳巖”的范疇。TNBC 患者以絕經前年輕女性居多，存在氣機郁滯、肝郁痰凝的病機[9]。氣機郁滯致氣機升降失常，氣血津液運行不暢，內生痰瘀，積而成塊。縱觀文獻研究[10-17]所示，中醫對TNBC 術后、放化療后病機的認識以正虛邪實為主。手術、放化療損傷致臟腑虧虛、機體氣機升降失調，癌毒易停留郁結于體內，在臟氣失攝的情況下則可流竄停留于他臟導致邪毒內停，易致復發轉移。名老中醫張代釗、郁仁存治療乳腺癌常用龍葵、白花蛇舌草清熱解毒，浙貝母化痰散結；樸炳奎教授治療乳腺癌常用薏苡仁祛濕化痰，白花蛇舌草清熱解毒抗癌；孫桂芝教授常用浙貝母軟堅散結，白花蛇舌草抗癌。本課題組還總結了深圳市名中醫歐陽郴生教授治療乳腺癌的用藥規律，其認為肝脾失和、氣機升降失常為乳腺癌發病之本，以疏肝健脾、調和氣機為主要治則，常選用柴胡、郁金藥對調節氣機升降，并指出TNBC 患者術后易復發轉移與氣機升降失常、正虛邪毒內停有關，治療中除了扶正抗癌外，還應重視調和氣機、調暢情志[18-19]。固本方正是基于文獻研究、名老中醫經驗及臨床經驗成方，以扶正抗癌、調和氣機為基本治則，用于TNBC 術后、放化療后預防復發轉移。方中：黨參、黃芪為君藥以健脾益氣；臣藥以靈芝補氣安神，白術健脾益氣、燥濕利水，山藥健脾補腎，枸杞子滋補肝腎；佐藥以薏苡仁健脾滲濕，浙貝母化痰散結，紅豆杉散結抗癌，龍葵、白花蛇舌草清熱解毒；使藥以柴胡、郁金疏肝行氣、調和氣機。全方扶正與祛邪兼顧，重視氣機升降失調病機、調和氣機治法。臨床觀察固本方可改善患者生活質量，延長DFS。部分現代藥理學研究亦顯示，黃芪、黨參、山藥、龍葵可增強免疫、抗腫瘤、抑制TNBC 細胞增殖、誘導凋亡[20-22]。

PPI 網絡顯示，磷脂肌醇3-激酶相關基因（PIK3CA、PIK3R1）、Akt1 等為固本方治療TNBC的潛在核心靶點，PI3K/Akt 信號通路發揮主要作用。PI3K/Akt 通路是TNBC 疾病進程中的重要通路[23]。早期乳腺癌及轉移性乳腺癌常見PIK3CA 激活突變、抑癌基因PIK3R1 失活，PIK3CA 突變與化療耐藥及不良預后相關。PIK3CA 抑制劑正在進行實驗及臨床研究，與CDK4/6 抑制劑、抗Her-2治療、免疫治療、PARPi聯合或許可獲得更好的療效[24]。TNBC 中Akt1 表達高于癌旁組織，Akt1 與TNBC 發生、發展和轉移密切相關[25]。敲減Akt1后，乳腺癌MDA-MB-231 細胞的遷移能力明顯增強，Akt1對乳腺癌細胞遷移起負性調控作用[26]。

本研究結果顯示，固本方呈時間和濃度依賴性抑制MDA-MB-231 細胞增殖。經質譜分析獲得固本方化學成分后進一步網絡藥理學分析顯示，PI3K/Akt 信號通路在固本方治療TNBC 中發揮主要作用，細胞實驗結果顯示：固本方可下調乳腺癌細胞MDA-MB-231 中Akt、p-Akt、p-PI3K 的蛋白表達。表明Akt和PI3K 為固本方治療TNBC 的關鍵靶點。

綜上所述，在臨床療效基礎上，本次細胞實驗結果驗證了固本方對TNBC 細胞系的抑制作用，并論證了網絡藥理學的結果，后續擬以PI3K/Akt通路為靶點開展進一步研究。由于經費限制，本研究僅用1種細胞株，未進行動物實驗驗證，未進行固本方與卡培他濱聯合用藥的研究，未進行過表達或沉默（rescure）操作，對機制的闡明有待深入加強，下一步可開展多細胞株平行驗證，并擬通過臨床擴大樣本研究觀察固本方臨床療效及不良反應。