基于外泌體miR-30轉運探討益腎解毒法對尿毒癥小鼠心肌自噬的作用

童夢瑤， 江堅青， 羅富里， 晏子友

（1.江西中醫藥大學第二附屬醫院呼吸科，江西南昌 330006；2.江西中醫藥大學附屬醫院腎病科，江西南昌 330006）

尿毒癥心肌病（uremic cardiomyopathy，UCM）是慢性腎功能衰竭的主要并發癥，以心臟肥大、纖維化、炎癥和代謝重塑為特征，約占慢性腎病死亡人數的50%[1]。盡管包括代謝性酸中毒、炎癥、氧化應激增加和胰島素抵抗在內的許多因素可能導致UCM 的發展[2]，但確切的機制仍然未知。自噬是一種高度保守的機制，通過這種機制，真核細胞將潛在危險的細胞質物質輸送到溶酶體進行降解，最終實現物質循環[3]。最新研究[4]表明，自噬在心臟內穩態和功能中發揮重要作用，大多數報告支持自噬活性缺陷導致心衰的進展。然而，UCM 是否涉及自噬過程以及相關潛在機制尚未闡明。 哺乳動物細胞產生的微小RNAs（microRNAs，miRNAs，miRs）不僅調節基因表達，而且影響鄰近細胞甚至其他遠處器官中的細胞[5]。外泌體（exosome，Exos）來源于細胞內溶酶體微粒形成的多囊泡，攜帶各種信號分子從大多數細胞類型的表面膜穿梭[6]。越來越多的證據表明，Exos 在細胞內通訊和物質運輸中起著至關重要的作用[7]。Exos 可以攜帶miRs 并將其釋放到附近的細胞中。Exos中許多miRs介導心肌細胞損傷和心臟修復過程。研究[8]發現，miR-30可以靶向調控Beclin1基因，影響Beclin1-PI3KC3復合體的形成，進而促進細胞自噬，參與缺氧、糖尿病誘導的心肌病的進展。由于Exos 中的miRs 在心肌細胞通訊中至關重要的作用，因此成為藥物治療的靶點潛在。然而，很少有研究評價Exos的miRs在UCM中的作用。

臨床上，UCM 的胸悶、氣促、心悸、怔忡、水腫等癥狀主要與中醫“心腎不交”證有關[9]。因此，益腎解毒法通過益腎助陽、泄濁解毒，被廣泛應用于心腎不交證的防治。課題組前期臨床研究[10]結果表明，益腎解毒法可有效保護慢性腎病患者的腎功能，減輕或延緩心血管疾病的發生與發展。可見益腎解毒法有助于改善UCM，但其保護機制尚不清楚。因此，本研究假設益腎解毒法通過干預外周血Exos 中miR-30 轉運調控心肌自噬，通過體內以及體外實驗探討益腎解毒法對UCM 自噬的影響及對Exos 中miR-30 轉運的調控作用，以期為UCM 臨床管理的中醫治療策略提供新見解。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物益腎解毒法中藥復方（YSJD），由生黃芪30 g、生地10 g、黨參15 g、山萸肉10 g、淮山藥15 g、丹參20 g、澤瀉10 g、土茯苓20 g、白花蛇舌草20 g、六月雪20 g、生大黃10 g（后下）、淫羊藿15 g等共12味中藥組成，所有中藥材均由江西中醫藥大學中藥飲片廠楊明教授鑒定后提供。常規方法水煎，濃縮成每毫升含生藥2.00 g（含相當成人劑量/kg 的10 倍，給藥均按照沈映君教授主編的《中藥藥理學》中藥實驗用藥選擇換算小鼠用藥劑量，10 倍于臨床用藥劑量折算為等效劑量），真空密封包裝，每袋150 mL，4 ℃冰箱保存。由江西中醫藥大學附屬醫院藥劑科制備。

1.2 試劑乳酸脫氫酶（LDH）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）ELISA 試劑盒（英國Abcam 公司）；ExoQuick-TC 試劑（美國Biomars 公司）；2，3-丁二酮一肟（BDM，美國Sigma-Aldrich 公司）；消化培養基（瑞士Roche公司）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen 公司）；pcDNA 載體、miR-30 過表達質粒（上海GenePharma 公司）；熒光染料PKH67（美國Sigma-Aldrich 公司）；4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美國Invitrogen 公司）；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（英國Abcam 公司）；mirVana miRNA 分離試劑盒、TaqMan miRNA 逆轉錄試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； LC3 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）；Alexa Fluor 594 偶聯的山羊抗兔IgG 二抗（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；抗CD9 抗體、抗CD63 抗體、抗TSG101 抗體、抗LC3 抗體、抗Beclin1 抗體、抗p62 抗體、抗β-肌動蛋白抗體、HRP 偶聯的山羊抗小鼠IgG 二抗、山羊抗兔IgG 二抗（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.3 儀器Vevo 3100 超聲系統（日本Fujifilm VisualSonics 公司）；光學顯微鏡（日本Nikon 公司）；Amicon Ultra-15 離心超濾裝置（美國Millipore公司）；電子顯微鏡（美國Electron Microscopy Sciences 公司）；H7500 透射電子顯微鏡（TEM，日本Hitachi 公司）；IX73 倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；共聚焦顯微鏡（德國Leica 公司）；ABI 7900HT Fast 實時熒光定量PCR 系統（美國Applied Biosystems 公司）；ChemiDoc MP 成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.4 體內實驗

1.4.1 動物 24 只SPF 級6 ～8 周齡雄性C57BL/6J小鼠，體質量22 ～25 g，購自江西中醫藥大學動物實驗中心，動物使用合格證號：SYXK（贛）2018-0085。

1.4.2 分組、造模與給藥 將小鼠隨機分為3組：Sham 組（假手術組）、UCM 組和UCM+YSJD 組。給予小鼠戊巴比妥麻醉，采用兩步法、5/6 腎切除術建立UCM 模型。在第1 周，切除2/3 左腎。經過1 周的恢復，切除右腎。第2 次手術后，所有小鼠給予喂食1%的鹽水。將血尿素氮水平超過35.60 mmol/L 的小鼠確定為尿毒癥。Sham 組僅與模型組同期進行2次手術，但不切除腎臟。手術后第3 天，UCM+YSJD 組小鼠按0.8 g/mL YSJD 濃縮劑給藥，即給藥劑量為8.0 g·kg-1·d-1灌胃，Sham組和UCM 組小鼠給予等體積生理鹽水灌胃。治療3 周后，通過超聲系統評估每組小鼠的心臟功能。在評估結束時，用戊巴比妥鈉麻醉處死小鼠，收集血液和心臟組織用于后續研究。

1.4.3 超聲心動圖檢查 應用Vevo 3100 超聲系統進行超聲心動圖檢查，使用30 MHz 線性陣列超聲換能器。以1.5%異氟醚麻醉后，小鼠接受二維超聲分析。M模式錄像用于測量以下心臟結構：射血分數（EF%）、縮短分數（FS%）、收縮期左室后壁厚度（LVPWs）、舒張期左室后壁厚度（LVPWd）。

1.4.4 組織學分析 心臟組織采用4%多聚甲醛溶液固定，進行石蠟包埋，制作5 μm 切片。采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察心臟組織病理學形態；采用Masson 三相染色法評估心臟纖維化含量。光學顯微鏡（放大200倍）下觀察染色圖像。

1.4.5 酶活性測定 使用ELISA 試劑盒檢測血清LDH、CK-MB酶活性。

1.4.6 免疫組織化學法檢測心臟組織LC3 表達將脫臘、水化、滅活、封閉后的心臟組織載玻片樣品與LC3 抗體（1∶100）4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，用二氨基聯苯胺（DAB）染色和蘇木素復染。然后將載玻片樣品進行梯度乙醇脫水和二甲苯透明，并用中性樹脂蓋玻片封固，在光學顯微鏡下觀察圖像。LC3抗體陽性表達位于細胞漿。

1.4.7 TUNEL 法檢測心肌細胞凋亡 心臟組織石蠟切片用二甲苯脫蠟10 min。滴加1%蛋白酶K，加入增強型過氧化物酶封閉緩沖液后，將標本在室溫下孵育25 min。TBS 沖洗后，樣品用3% H2O2淬滅5 min。將淬滅的樣品用TdT 平衡緩沖液平衡30 min，與TdT 標記反應混合物在37 ℃下孵育1.5 h。加入終止溶液并與細胞一起孵育5 min。沖洗和封閉后，將樣品在室溫下浸入1 × 偶聯物中30 min，用DAB溶液覆蓋樣品15 min。洗滌后，樣品用甲基綠復染液染色3 min。最后，染色的細胞樣品再次在乙醇和二甲苯中脫水，應用IX73 倒置熒光顯微鏡捕獲圖像。1.4.8 透射電子顯微鏡（TEM）觀察 取心臟組織，經戊二醛、鋨酸固定，常規丙酮脫水、樹脂包埋，超薄切片，3%醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色，將制備好的樣品用H7500 透射電鏡觀察心肌超微結構。并應用ImageJ 軟件量化自噬囊泡占據的細胞面積。

1.5 體外實驗

他一動不動地仰面躺著，現在，他能夠聽到病狼一呼一吸地喘著氣，慢慢地向他逼近。它愈來愈近，總是在向他逼近，好像經過了無窮的時間，但是他始終不動。它已經到了他耳邊。那條粗糙的干舌頭正像砂紙一樣地磨擦著他的兩腮。他那兩只手一下子伸了出來——或者，至少也是他憑著毅力要它們伸出來的。他的指頭彎得像鷹爪一樣，可是抓了個空。敏捷和準確是需要力氣的，他沒有這種力氣。

1.5.1 小鼠外周血Exos 的分離和鑒定 將各組小鼠外周血以1 680 ×g離心10 min 后吸出上層血清成分，將血清3 000×g離心15 min以除去其中的細胞碎片以及血小板，在離心超濾裝置中以5 000×g離心30 min，將樣品與ExoQuick-TC 試劑混合，孵育過夜，然后于4 ℃1 500 ×g離心30 min，取沉淀并重懸于磷酸鹽緩沖（PBS）溶液中，儲存在-80 ℃。采用Western Blot 法檢測特定的Exos 表面標志物（CD9、CD63、TSG101）。對于形態學分析，將獲得的沉淀物洗滌并重懸于0.2%多聚甲醛中，取3 μL 重懸的沉淀物放置在Formvar-碳涂層的鎳電子顯微鏡格柵上，并在室溫下孵育5 min。用1.75%乙酸鈾酰染色，PBS 洗滌格柵，并使其在室溫下半干燥，然后在透射電子顯微鏡下觀察Exos。

1.5.2 小鼠原代心肌細胞的分離培養及分組 在戊巴比妥注射麻醉前30 min，C57/BL6 小鼠預先注射肝素（1 000 μL/kg 體質量）。打開胸腔快速解剖心臟，將其轉移到冰上。去除肺組織和大血管后，用含有20 mmol/L BDM 的PBS 清洗心臟以去除血液；再將心臟浸入24 孔板中的500 μL 隔離培養基中，用彎剪刀切成小塊（約1 mm3），把心臟組織收集在裝有10 mL 冷分離培養基的15 mL 管中，4 ℃輕輕攪拌過夜。第2 天，去除大部分上清液并加入5 mL 消化培養基，在37 ℃溫和攪拌下消化心臟組織碎片30 min，以300 r/min（離心半徑7 cm）離心5 min。吸出上清液后，將細胞沉淀重新懸浮在鋪板培養基（L-15 培養基中添加20 mmol/L BDM）中，培養3 h，去除成纖維細胞和附著在培養皿上的內皮細胞。收集上清液中未貼壁的心肌細胞、計數，并以2.0×105個/cm2重新接種到膠原涂層培養皿中。

心肌細胞以4×104個/孔接種于96 孔板，分成Sham-Exos 組、UCM-Exos 組、UCM+YSJD-Exos組、UCM+YSJD-Exos+pcDNA 組和UCM+YSJDExos+miR-30 組，每組設3 個平行復孔。Sham-Exos 組、UCM-Exos 組、UCM+YSJD-Exos 組分別用從動物實驗中Sham 組、UCM 組和UCM+YSJD 組小鼠外周血中分離得到的含50%Exos 培養液處理48 h。UCM+YSJD-Exos+pcDNA 組和UCM+YSJDExos+miR-30 組心肌細胞分別使用Lipofectamine 2000將pcDNA 載體或miR-30過表達質粒轉染細胞24 h，然后用從UCM+YSJD 組小鼠外周血中分離得到的含50%Exos培養液處理48 h。

1.5.3 Exos 進入小鼠原代心肌細胞的內在化 用綠色熒光染料PKH67 標記純化的Exos。將小鼠原代心肌細胞接種到8孔室載玻片，8×103個細胞/孔，與5 μL PKH67 孵育24 h 以允許Exos 內化。將小鼠原代心肌細胞用DAPI 染色5 min 以顯示細胞核。使用共聚焦顯微鏡捕獲圖像。

1.5.4 TUNEL 法檢測心肌細胞凋亡 心肌細胞在二甲苯和乙醇梯度中脫水，1%蛋白酶K 中透化20 min后，其他步驟同組織檢測。

1.5.5 免疫熒光染色法檢測心肌細胞LC3 表達取在聚-L-賴氨酸包被的蓋玻片上培養的細胞，于室溫下用4%多聚甲醛固定15 min。洗滌后，細胞在室溫下用0.1%Triton X-100透化15 min。將細胞用2% BSA 封閉30 min，用兔抗人LC3 抗體（1∶200）4 ℃孵育6 h。PBS 洗滌后，用Alexa Fluor 594偶聯的山羊抗兔IgG（1∶200）4 ℃孵育細胞1 h。應用100 μg/mL DAPI 與細胞在室溫下孵育15 min 以顯示細胞核。洗滌后，將細胞置于IX73 倒置熒光顯微鏡進行成像。應用ImageJ軟件量化細胞中LC3斑點。

1.5.6 RT-qPCR 法分析Exos 中miR-30 水平 通過mirVana miRNA 分離試劑盒從Exos 中提取總RNA。使用TaqMan miRNA 逆轉錄試劑盒對分離的RNA 進行逆轉錄。在ABI 7900HT Fast 實時熒光定量PCR 系統中使用SYBR 試劑盒進行實時PCR。反應條件：95 ℃擴增5 min；95 ℃10 s、55.7 ℃30 s，40個循環。miR-30和U6的引物由上海GenePharma公司合成。miR-30 正向引物序列為5’-GGCCCAA CACTTCCCTCAAA-3’，反向引物序列為5’-GGA CACAATGGATTGCAAGG-3’；U6 正向引物序列為5’-CAGGGAGAAACGACCTGGAG-3’，反向引物序列為5’-TAACCACTGCTCCACTCTGG-3’。通過2-ΔΔCt方法計算靶基因的相對表達。U6為內參基因。

1.6 統計方法采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，所有結果代表3 個獨立實驗中產生的數據，以均數±標準差（±s）表示。采用未配對的雙尾學生t檢驗比較2 組之間的差異，采用單向方差分析和Tukey’s 事后檢驗進行多重比較。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 益腎解毒法改善UCM小鼠的心臟功能障礙與Sham 組比較，UCM 組小鼠在實驗結束時存在嚴重的心臟功能障礙，包括EF%和FS%的急劇下降（P＜0.05），以及LVPWd 顯著增加（P＜0.05）。與UCM 組比較，UCM+YSJD 組EF%和FS%上升（P＜0.05）、LVPWd顯著減小（P＜0.05）。表明益腎解毒法可明顯改善UCM 誘導的心臟功能障礙。結果見表1。

表1 動物實驗結束時各組小鼠經胸超聲心動圖檢查結果Table 1 Transthoracic echocardiographic findings in each group of mice at the end of the animal experiment（±s）

表1 動物實驗結束時各組小鼠經胸超聲心動圖檢查結果Table 1 Transthoracic echocardiographic findings in each group of mice at the end of the animal experiment（±s）

注：Sham組為假手術組，UCM組為尿毒癥心肌病組，UCM+YSJD組為尿毒癥心肌病+益腎解毒法中藥復方組，下同。①P＜0.05，與Sham組比較；②P＜0.05，與UCM組比較

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HE 染色結果顯示，與Sham 組比較，UCM 組小鼠表現出嚴重的心肌紋理和纖維排列紊亂，心肌絲破裂和炎癥細胞浸潤。同時，Masson 三相染色結果顯示，UCM 組小鼠膠原沉積較Sham 組顯著增加。超聲心動圖顯示，UCM 組小鼠左心室質量和心臟質量/體質量比值較Sham 組增加（P＜0.05），表明UCM 存在心臟肥大。此外，UCM 組小鼠血清CK-MB 和LDH 含量較Sham 組顯著增加（P＜0.05 或P＜0.001），表明UCM 存在心臟損傷。而與UCM 組比較，UCM+YSJD 組上述指標均得到逆轉（P＜0.05 或P＜0.001），表明益腎解毒法治療可明顯改善UCM 誘導的心臟形態變化和重塑，并可降低血清CK-MB和LDH水平。見表1、圖1。

圖1 益腎解毒法中藥復方（YSJD）對尿毒癥心肌病（UCM）小鼠心功能不全、心臟病理改變及重構的影響Figure 1 Effect of Yishen Jiedu Chinese herbal compound（YSJD）on cardiac insufficiency，cardiac pathological changes and remodeling in mice with uremic cardiomyopathy（UCM）

2.2 益腎解毒法通過抑制心肌細胞的自噬和凋亡減輕UCM誘導的心肌損傷TUNEL 法測定結果顯示：與Sham 組比較，UCM 組心肌細胞凋亡率升高（P＜0.001）；與UCM 組比較，UCM+YSJD 組心肌細胞凋亡率降低（P＜0.01）。表明益腎解毒法有效地抑制了UCM 小鼠心肌細胞凋亡。見圖2-A。此外，TEM 成像可見，UCM 組出現明顯的心肌空泡化，而YSJD 組心肌空泡化較UCM 組減輕。表明益腎解毒法治療可顯著改善UCM 小鼠心肌空泡化損傷。見圖2-B。使用TEM 數據量化自噬囊泡占據的細胞面積，結果顯示，UCM 組自噬囊泡占據的細胞面積較Sham 組增加（P＜0.001），UCM+YSJD組自噬囊泡占據的細胞面積較UCM 組減小（P＜0.001）。表明UCM 誘導了自噬囊泡形成的有效上調，并被益腎解毒法治療抑制。見圖2-C。免疫組織化學結果顯示：與Sham 組比較，UCM 組小鼠心肌組織中自噬標記蛋白LC3 表達升高（P＜0.005）；與UCM 組比較，UCM+YSJD 組LC3 表達降低（P＜0.001）。表明UCM 誘導了心肌組織中自噬標記蛋白LC3 的表達，并被益腎解毒法治療抑制，證實了上述結果。見圖2-D。

圖2 益腎解毒法中藥復方（YSJD）通過抑制心肌細胞的自噬和凋亡減輕尿毒癥心肌病（UCM）誘導的心肌損傷Figure 2 Yishen Jiedu Chinese herbal compound（YSJD）reduces uremic cardiomyopathy（UCM）-induced myocardial injury by inhibiting autophagy and apoptosis of cardiomyocytes

2.3 益腎解毒法對外周血Exos中miR-30的影響從各組外周血中分離Exos，并通過TEM 成像觀察到直徑在40 ～100 nm 之間的圓形結構，具有細胞膜狀結構，見圖3-A。根據Western Blot 分析Exos 和總細胞裂解物中的蛋白質，觀察到Exos 中CD9、CD63 和TSG101 均呈高表達，而β-actin 僅在細胞裂解物中表達，見圖3-B。為了確定Exos 是否可以被小鼠原代心肌細胞吸收，用PKH67 染料標記Exos，該染料具有強烈的綠色熒光，結果顯示，與PKH67 標記的Exos 一起孵育的原代心肌細胞胞質呈綠色熒光，見圖3-C，表明Exos 可以被原代心肌細胞吸收。

圖3 Exos的鑒定Figure 3 Identification of Exos

為了考察YSJD 對外周血Exos 中miRs 變化的影響， 采用高通量基因表達數據庫（Gene Expression Omnibus database，GEO）的GSE47420 數據集篩選各組小鼠外周血Exos 中變化的miRs。以FDR＜0.05 和|logFC|＞1 作為篩選條件。然后將篩選出的27個miRs顯示在熱圖中，結果發現，miR-30在UCM 組小鼠外周血Exos 中上調，而在UCM+YSJD 組外周血Exos 中下調，見圖4-A。RT-qPCR證實了上述結果，與Sham 組比較，UCM 組小鼠外周血Exos 中miR-30 表達顯著上調（P＜0.001）。UCM+YSJD 組Exos中miR-30表達較UCM組顯著下調（P＜0.001），見圖4-B。這些數據表明，miR-30可能參與YSJD對UCM誘導心肌損傷的保護作用。

圖4 益腎解毒法中藥復方（YSJD）抑制尿毒癥心肌病（UCM）小鼠外周血Exos中miR-30表達Figure 4 Yishen Jiedu Chinese herbal compound（YSJD）inhibits the expression of miR-30 in peripheral blood Exos of uremic cardiomyopathy（UCM）mice

2.4Exos中miR-30下調與益腎解毒法減輕UCM誘導的心肌損傷有關為了確定Exos 中miR-30 是否參與YSJD 對UCM 誘導的心肌損傷的調節，我們體外觀察各組Exos 處理原代心肌細胞凋亡與自噬情況。結果顯示，與Sham-Exos 組比較，UCMExos 組TUNEL 陽性細胞以及自噬體形成顯著增加（P＜0.001），而與UCM-Exos 組比較，UCM+YSJD-Exos組則對心肌細胞凋亡和自噬體的形成不產生影響（P＞0.05）。當在UCM+YSJD-Exos與原代心肌細胞共培養系統中向心肌細胞轉染miR-30后，心肌細胞的凋亡率和自噬體形成顯著增加。見圖5-A、-B。一致地，心肌細胞中Beclin1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達在UCM-Exos處理后增強，而在UCM+YSJD-Exos 處理后未發生明顯變化。當在UCM+YSJD-Exos 與心肌細胞共培養系統中向心肌細胞轉染miR-30 時，心肌細胞中Beclin1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達明顯增強，見圖5-C。這些實驗結果表明，Exos 中miR-30 下調與YSJD 減輕UCM誘導的心肌損傷和自噬增強有關。

3 討論

尿毒癥心肌病（UCM）是終末期腎病患者中廣泛流行的心血管疾病，超過50%的透析患者死于心血管疾病。心臟肥大是UCM 最關鍵的特征之一，大約75%的成年患者在透析開始時出現，并且幾乎100%的患者在透析5 年后出現[11]。因此，迫切需要尋找更好的方法來緩解UCM 癥狀，提高患者的生活質量。本課題組前期臨床觀察顯示，益腎解毒法可明顯降低慢性腎臟疾病（CKD）患者血清肌酐、尿素氮，提高患者內生肌酐清除率水平，同時可改善尿毒癥患者心臟彩超左室射血分數（LVEF、EF 斜率），提示益腎解毒法有助于改善UCM[12]。本研究通過體內外實驗研究了益腎解毒法對UCM 的心臟保護作用及其對自噬的調控機制。主要研究結果如下：（1）益腎解毒法改善了UCM 小鼠的心功能和心肌結構；（2）益腎解毒法通過抑制心肌細胞的自噬和凋亡減輕了UCM 誘導的心肌損傷；（3）Exos 中miR-30 轉運下調與益腎解毒法減輕UCM誘導的心肌損傷有關。

凋亡和自噬是UCM 損傷病理機制中程序性細胞死亡的2 個關鍵事件[13]。研究報告稱，自噬在心臟病中起雙重作用，而UCM 長期的心肌壓力和容量負荷過重，代謝毒素的毒性作用，炎癥及某些營養物質的缺乏（如白蛋白、微量元素）等綜合作用導致的過度自噬可能引起細胞死亡和心臟功能障礙[14]。因此，降低細胞凋亡和自噬程度有助于防止心肌細胞損傷。目前，關于UCM 自噬的發生情況及其對心功能影響的研究較少。有研究[15]證實，壓力負荷所致的慢性心功能不全2周后小鼠心肌自噬明顯增加伴有心肌細胞的重塑，加重心功能不全的進展。心肌細胞自噬導致大量細胞外基質蓄積并誘發心肌纖維化是UCM 的重要病理機制。鑒于心肌細胞自噬在UCM 中的重要作用，調控心肌細胞自噬可能是治療UCM 的關鍵所在。本研究結果表明，益腎解毒法治療可顯著削弱體外和體內的細胞凋亡和過度自噬，減輕UCM 誘導的心肌細胞損傷。

細胞微環境的變化可能是UCM 進展的關鍵決定因素[16]。既往研究揭示了來自各種細胞的Exos通過介導細胞之間的通訊來調節多個過程的潛在功能，如免疫反應、腫瘤細胞發育和心肌細胞存活等[17]。直徑為50 ～150 nm 的Exos 以誘導方式從心肌細胞中分泌出來，通過攜帶和釋放細胞因子、營養因子和心血管疾病中的信號分子，在彌合心肌細胞之間的聯系中發揮關鍵作用[18]。Ribeiro-Rodrigues 等[19]確定心肌細胞在缺血條件下分泌的Exos 促進心臟血管生成。Liu 等[20]證實，源自脂肪干細胞的Exos 可以保護心肌細胞免受氧化應激。因此，調節Exos 釋放的藥物可能是治療UCM 的一種有前景的選擇。據報道，Exos 可以將內容物（包括miRs）轉移到宿主細胞內環境中，調節受體細胞活動[21]。本研究在體外表征了源自UCM 和/或益腎解毒法中藥復方（YSJD）處理小鼠的外周血Exos，并采用GEO 的GSE47420 數據集篩選確定miR-30 在UCM 小鼠中上調，而在YSJD 干預組中明顯下調。進一步通過體外研究證實，miR-30過表達逆轉了YSJD 對UCM 誘導的心肌細胞凋亡、自噬的抑制作用。這些數據表明，miR-30 可能參與益腎解毒法對UCM誘導心肌損傷的保護作用。

綜上所述，益腎解毒法通過干預外周血Exos中miR-30 轉運可抑制UCM 誘導的心肌細胞凋亡、自噬，發揮心臟保護作用。