三步止瀉治療小兒腹瀉調控腸微生態的機制研究

楊麗秋 龍鑫 彭強 楊陽 岳陽 楊永蘭 龍毅 楊宇 朱麗

摘要：目的? 通過本項目研究，了解三步止瀉法治療腹瀉乳兔的可能作用機制，明確三步止瀉法治療小兒腹瀉與腸微生態作用機制的強相關性。方法? 將乳兔制作脾虛證模型后，分為六組即：補脾組、摩腹組、推上七節骨組、三步止瀉手法組、益生菌組、模型組，經過治療周期后，處死乳兔后，將胃黏膜、腸黏膜組織切片進行HE染色，觀察乳兔胃、腸黏膜的組織學變化；檢測腹瀉兔血漿內毒素的表達水平；并收集各組大鼠糞便排泄物，進行微生物組總DNA提取，目標片段PCR擴增，擴增產物回收純化，擴增產物熒光定量，測序文庫制備，上機進行高通量測序，然后多元化對比，后統計分析。結果? 兔胃腸組織HE染色提示治療后三步止瀉手法組、補脾組、摩腹組及推上七節骨組、益生菌組能有效的改善兔胃腸組織水腫及炎癥情況；血漿內毒素的表達水平表明補脾組在降低兔血漿內毒素有較好的效果（P<0.05），三步止瀉手法組、摩腹組、推上七節骨組及益生菌組對降低兔血漿內毒素也有一定的作用；OTU/ASV分析、Alpha多樣性分析表明摩腹組及三步止瀉手法組可糾正菌群紊亂，提高菌群的豐富度及均勻性，使腸道內環境恢復穩態。結論? 三步止瀉手法組具有刺激宿主產生免疫及清除功能、減少內毒素的吸收、調整腸道菌群間及其與人體生理機能的平衡狀態，改善腹瀉癥狀，且研究表明，各手法組在治療中，針對性各有不同。

關鍵詞：三步止瀉；小兒推拿；小兒腹瀉；腸微生態

中圖分類號：R256.34????? 文獻標志碼：B????? 文章編號：1007-2349（2023）06-0070-06

Study on the Mechanism of Three-Step Antidiarrheal Therapy in the Treatment of Infantile Diarrhea by Regulating Intestinal Microecology

YANG Li-qiu， LONG Xin， PENG Qiang， YANG Yang， YUE Yang， YANG Yong-lan， LONG Yi， YANG Yu， ZHU Li

（Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650021， China）

【Abstract】Objective： Through this study， to understand the possible mechanism of action of three-step antidiarrheal therapy in the treatment of diarrhea in suckling rabbits， and to clarify the strong correlation between the three-step antidiarrheal therapy in the treatment of diarrhea in children and the intestinal microecological mechanism of action. Methods： After the spleen deficiency syndrome model of the suckling rabbits was made， the rabbits were divided into six groups： spleen tonifying group， abdominal massage group， seven-segment bone pushing group， three-step antidiarrheal technique group， probiotics group and model group. After the treatment cycle and the suckling rabbits were sacrificed， the gastric mucosa and intestinal mucosa tissues were sliced for HE staining， and the histological changes of the gastric mucosa and intestinal mucosa were observed. The expression level of plasma endotoxin of the diarrhea rabbits was detected. The feces and excrement of the rabbits each group were collected for total DNA extraction of microbiome， PCR amplification of target fragments， recycling and purification of amplification products， fluorescence quantification of amplification products， preparation of sequencing library， high-throughput sequencing on the computer， and then diversified comparison， and statistical analysis. Results： The HE staining of the rabbit gastrointestinal tissue suggested that after treatment， the three-step antidiarrhea manipulation group， the spleen tonifying group， the abdominal massage group， the seven-segment bone pushing group and the probiotics group could effectively improve the edema and inflammation of the rabbit gastrointestinal tissue. The expression level of plasma endotoxin showed that the spleen tonifying group had a good effect on the reduction of the rabbit plasma endotoxin （P<0.05）， and the three-step antidiarrhea manipulation group， the abdominal massage group， the seven-segment bone pushing group and the probiotics group also had a certain effect on the reduction of the rabbit plasma endotoxin. OTU/ASV analysis and Alpha diversity analysis showed that the abdominal massage group and the three-step antidiarrhea manipulation group could correct the flora disorder， improve the richness and uniformity of the flora， and restore the intestinal environment to a stable state. Conclusion： The three-step antidiarrheal manipulation group can stimulate the host to produce immunity and clearance function， reduce the absorption of endotoxin， adjust the balance between intestinal flora and human physiological function， and improve the symptoms of diarrhea. The study has shown that each manipulation group has different pertinence in the treatment.

【Key words】Three-Step Antidiarrheal Therapy; Pediatric Massage; Infantile Diarrhea; Intestinal Microecology

小兒腹瀉亦稱小兒泄瀉，是小兒常見的消化系統疾病，發病年齡3歲以下多見，一年四季均可發病，尤以季節更替時明顯。它主要表現為大便次數增多并且糞質改變，病情較重者可出現脫水及電解質紊亂或危及生命。三步止瀉法是本課題組小兒推拿治療腹瀉的特效推拿療法，取穴簡單，操作簡單，無副作用，療效明確^［1］。本項目從腸微生態作用機制著手，通過對血漿檢測內毒素，動物胃腸組織形態學改變，糞便腸道菌群改變來了解三步止瀉手法治療小兒腹瀉的可能作用機制，現報道如下。

1? 材料與方法

1.1? 實驗材料

1.1.1? 動物取健康的日本大耳乳兔70只，體重3.0～3.5 kg，雌雄各半，重量分布均一。（由云南中醫學院實驗動物中心提供），動物實驗飼養環境：飼養于IVC動物實驗室，溫度20～25℃（日溫差≤3℃）；濕度40%～70%；照明12h：12h明暗交替，照度150～300lx；噪音≤60dB。

1.1.2? 實驗試劑? HE 染色試劑盒（Solarbio，生產編號：G1121）；ELISA 試劑盒（江蘇酶標生物科技有限公司，生產編號：MB-3113A）。

1.2? 實驗方法

1.2.1? 實驗分組與造模? 將日本大耳乳兔70只隨機分為7組，每組10 只分別為空白組、模型組、補脾組、摩腹組、推上七節骨組、三步止瀉手法組，益生菌組。

1.2.2? 造模方法? 采用通過喂服生大黃粉（與飼料拌食）續灌服14 d，每天3次。模型標準為出現腹瀉癥狀，大便性狀變為稀便或水樣便，次數增多，體重下降，毛色光澤雜亂，神情呆滯，四肢乏力等脾虛的癥狀。

1.2.3? 治療方法? 手法治療組（40只），專人操作，手法、操作步驟及時間固定。操作方法如下：如三步止瀉手法組10只；三步止瀉法每天治療1次，連續治療1周，其它手法組同前。對照組乳兔予喂服益生菌藥物治療，每天1次，治療1周；空白組為模型制作后不予任何治療，予正常飼料喂養觀察。模型組繼續喂服生大黃粉（與飼料拌食）。

1.2.4? 取材和指標檢測? （1）組織切片：在無菌的條件下，從動物的腸和胃上取下組織塊（厚度不超過0.5厘米）投入預先配好的固定液中（10％福爾馬林，Bouin氏固定液等）使組織、細胞的蛋白質變性凝固，通過脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟染色、封固等步驟制作切片標本待觀察分析。（2）血漿：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心10 min將血清和紅細胞迅速小心分離。用ELISA法檢測血漿內毒素的表達水平。（3）糞便：分別收集空白對照組，模型組，治療組6組，各組兔治療7 d后的新鮮糞便保存在印P管中，做好編號和記錄，-70℃保存備用。通過糞便樣本總DNA提取、目標片段PCR擴增、擴增產物回收純化、擴增產物熒光定量等方法，分析腸道菌群的多樣性及種類。

1.2.5? 統計學方法? 應用SPSS26.0統計學軟件進行統計，計量資料用t檢驗，計數資料用卡方檢驗，實驗結果中的數值表示以均數±標準差（x±s）表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 ?結果

2.1? HE觀察兔腸組織和胃組織病理改變

2.1.1? HE觀察兔腸組織病理改變? 正常對照組兔腸組織可見結構清晰完整，表面絨毛排列規則且整齊，隱窩結構清晰，未見炎細胞浸潤；模型組可見腸絨毛明顯腫脹、紊亂、脫落，黏膜上皮可見大量散在炎細胞浸潤，隱窩深度變淺，固有層炎細胞浸潤明顯，且可見明顯疏松、水腫；益生菌組、三步止瀉手法組、補脾組、摩腹組及推上七節骨組可見腸絨毛腫脹較模型組減輕，腸絨毛形態較完整，黏膜層少量淋巴細胞浸潤，腺體明顯增多，水腫減輕，其中摩腹組、推上七骨組、補脾組改善作用稍好于益生菌組及三步止瀉手法組。見圖1。

2.1.2? HE觀察兔胃組織病理改變? 正常組兔胃組織可見胃黏膜光滑完整，無腺狀結構紊亂或丟失，無出血或黏膜下水腫，模型組可見胃黏膜胃腺結構紊亂、丟失明顯，局部可見潰瘍灶，大量黏膜下水腫、炎癥細胞浸潤和散在出血點；益生菌組、三步止瀉手法組、補脾組、摩腹組及推上七節骨組可見部分胃腺體紊亂，丟失，但均較模型組減輕，組織間炎細胞數量減少，無明顯浸潤，出血有所減少，其中摩腹組、推上七骨組、補脾組改善作用稍好于益生菌組及三步止瀉手法組。見圖2。

2.2? ELISA檢測腹瀉兔血漿內毒素的表達水平

2.3? 腹瀉兔腸道微生物多樣性結果

2.3.1? 稀釋性曲線? 稀釋性曲線（Rarefaction Curve）的速率表示：在一定范圍內，隨著測序條數的加大，若曲線表現為急劇上升則表示群落中有大量物種被發現；當曲線趨于平緩，則表示此環境中的物種并不會隨測序數量的增加而顯著增多。稀釋曲線可以作為對各樣本測序量是否充分的判斷，下圖說明樣品序列充分，可以進行數據分析。結果提示各組中菌群豐富且相對穩定，無新菌群的出現和大量菌群的缺失，而模型組的菌群豐富度較其它組的低。見圖 3。

2.3.2? 等級豐度曲線? 等級豐度曲線主要用于同時解釋樣品所含物種的豐富度和均勻度，物種的豐富度由曲線在橫軸上的長度來反映，曲線越寬，表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻度由曲線的形狀來反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高，下圖提示腸道菌群物種豐富度較高且均勻分布。見圖4

2.3.3? OTU/ASV分析? OTU即分類操作單元，按最樣本序列數抽平后 OTU 物種分析顯示，測序數據7 組共70個樣本，菌群序列長度分布在 839～873bp，使用Usearch軟件對Reads在97.0%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU。通過下面OTU圖像得出，與模型組相比，各治療組的菌群序列長度與正常組接近，說明各種治療方法，都可以改善腹瀉兔的菌群，使腹瀉兔的失衡菌群，盡快恢復。其中三步止瀉手法組、推下七節骨組、益生菌組在改善菌群失衡方面，效果更明顯。見圖5。

2.3.4? 腸道菌群Alpha多樣性分析? Alpha多樣性反映的是單個樣品物種豐度及物種多樣性，Chao1和Ace指數衡量物種豐富度及多樣性。模型組ace指數明顯降低，摩腹組及三步止瀉手法組ace指數較模型組顯著升高，其余組較模型組具升高趨勢；模型組chao指數降低，摩腹組較模型組chao指數顯著升高，三步止瀉手法組較模型組具升高趨勢。提示在提高腹瀉兔腸道菌群的豐富度及多樣性方面，摩腹組及三步止瀉優勢更加明顯。見圖6。

3? 討論

腸道菌群是按一定的比例組合，各種菌群在質量和數量上形成穩態平衡，個菌群之間相互制約與依賴，腸道菌群通過影響能量代謝、炎癥反應、促進或抑制細胞的增殖分化，從而對人類健康產生了很大的影響，任何導致腸道菌群失調的因素都可能導致各種胃腸道疾病和腸外疾病。成熟穩定的腸道菌群可以協助人體能量攝取與代謝，促進免疫系統的發育、成熟和平衡，并且清除宿主腸道內的病原體，防止致病菌引起宿主感染。腸道菌群的失調可以直接影響著機體的免疫。

有研究表明，腸道微生態紊亂導致局部炎癥反應，破壞腸道黏膜正常的屏障功能，進而可導致腸道內致病菌增殖并釋放內毒素，進一步破壞腸道黏膜屏障^［1］。腹瀉最易導致腸黏膜的受損，而腸黏膜損傷則會促使大量炎性促炎因子的釋放，引發炎性反應，進而導致組織的炎癥、水腫^［2］。通過圖1、2發現，治療后三步止瀉手法組、補脾組、摩腹組及推上七節骨組、益生菌組能有效的改善組織水腫及胃腸的炎癥情況；說明上述治療組，均能降低腹瀉兔胃腸組織損傷，緩解炎癥狀，從而改善腹瀉癥狀。益生菌是治療腹瀉的常用微生態制劑，其在腸道形成生物菌膜，分泌腸道調節因子，起到生物學屏障保護作用，改善腹瀉癥狀^［3］。促進胃腸道微環境改變，提升抵御細菌、病毒等病原體的能力，調節細胞因子表達，降低腸黏膜的炎癥反應和氧化應激損傷^［4］。兔胃、腸病理切片染色提示，補脾組、摩腹組及推上七節骨組在改善兔胃腸組織時效果優于益生菌組、三步止瀉手法組，說明各手法組在降低組織損傷，緩解炎癥狀，降低腸黏膜的炎癥反應和氧化應激損傷的功效等同甚至優于益生菌。

通過表1發現，與正常組比較，模型組腹瀉兔血漿內毒素的表達水平明顯升高（P<0.05）；經過手法治療后，與模型組比較，補脾組兔血漿內毒素的表達水平明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，三步止瀉組、補脾組、摩腹組、推上七節骨組及益生菌組，兔血漿內毒素的表達水平也有不同程度的降低（P>0.05）。結果提示補脾法在降低兔血漿內毒素有良好的效果，而三步止瀉組、補脾組、摩腹組、推上七節骨組及益生菌組對降低兔血漿內毒素也有一定的作用。

當腸道遭受病原微生物侵襲時發生發炎性反應，導致腸道上皮細胞損傷及腸道菌群紊亂，從而使內毒素升高，本研究表明三步止瀉組、補脾組、摩腹組、推上七節骨組及益生菌組可降低腸道對毒素的吸收，增強腸道屏障功能的作用機制，抑制內毒素的釋放而誘發炎性反應，有效避免炎性反應擴大而加重腸黏膜損傷。

從腸道菌群的OTU/ASV分析、Alpha多樣性分析中，我們可以發現摩腹組及三步止瀉可糾正菌群紊亂，提高菌群的豐富度及均勻性，使腸道菌群盡快恢復穩態，恢復腸道內環境的平衡。豐富度及均勻性的增強能提升腸道黏膜生物屏障的作用，促進腸道蠕動，抑制致病菌群的生長，分解有害物質，激活免疫系統等，抵御病原體的繼續入侵，同時修復受損的腸黏膜組織，抑制炎性反應，從而恢復腸道固有的健康狀態。

參考文獻：

［1］楊麗秋.推拿止瀉三法治療小兒腹瀉的臨床體會［J］.云南中醫中藥雜志，2011，32（9）：53-54.

［2］Bron PA，Kleerebezem M，Brummer ＲJ，et al.Can probiotics modulate human disease by impacting intestinal barrier function［J］.British Journal of Nutrition，2017，117（1）：93-107

［3］張燕.蒙脫石散聯合雙歧桿菌四聯活菌片治療小兒腹瀉110例療效分析［J］.中國藥物與臨床，2018，18（9）：1582-1583.

［4］趙愛玲.醒脾養兒顆粒聯合雙歧桿菌四聯活菌片治療小兒輪狀病毒腹瀉的臨床效果［J］.臨床醫學研究與實踐，2021，6（24）：139-141.

［5］蔡學寧，馮素詩，宋多靈，等.鹽酸小檗堿聯合雙歧桿菌四聯活菌治療小兒感染性腹瀉的效果及對腸道菌群的影響［J］.中國醫院用藥評價與分析，2020，20（1）：66-68.

（收稿日期：2022-08-25）