復發性流產婦女凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T多態性研究

郭躍麗，湯麗云，鄭溫潔瑩，陳孟權，孔萬仲，王明山

復發性流產的病因十分復雜，受遺傳、內分泌、免疫、感染及子宮解剖結構等多種因素影響[1-2]。近年來研究發現，孕婦血栓前狀態也是導致復發性流產的重要影響因素[3-4]。血栓前狀態又稱為易栓癥，是一種血液高凝狀態，引起全身彌漫性血栓形成，并進一步造成孕婦子宮胎盤或臍帶血栓形成、梗死，引發流產[5-6]。對于復發性流產婦女，臨床推薦進行血栓性基因突變篩查，以明確病因，并進行針對性治療。目前研究發現，凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多態性與血漿中凝血因子Ⅻ活性改變密切相關[7-8]，但具體的機制尚不明確。本研究分析復發性流產婦女凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多態性特點，為復發性流產的臨床基因診斷提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2022 年1—6 月溫州市中醫院收治的138 例復發性流產患者（觀察組）。納入標準：（1）符合復發性流產的診斷標準[9]；（2）連續3 次及以上妊娠28 周前發生自然流產；（3）進行凝血因子Ⅻ基因Exon1 測序；（4）病例資料完整。排除標準：（1）生殖道病原體感染；（2）子宮結構異常，如先天性子宮畸形、子宮頸機能不全、宮腔粘連及子宮肌瘤等；（3）內分泌疾病，如多囊卵巢綜合征、甲狀腺功能疾病及黃體功能不全等；（4）夫妻任何一方染色體異常；（5）自身免疫抗體檢查異常。同期選取69 例妊娠史良好的健康女性（對照組），納入標準：至少有1 次成功分娩，無流產史、早產史、產后出血史及妊娠合并癥史。

觀察組年齡25 ～41 歲，平均（31.3±3.5）歲；孕前 體 質 量 指 數 19.35 ～ 32.86 kg/m2，平 均（26.10±2.04）kg/m2；文化程度：初中24例，高中49例，大專及以上65 例。對照組年齡23 ～38 歲，平均（30.5±3.2）歲；孕前體質量指數18.96 ～31.05 kg/m2，平均（25.45±1.88）kg/m2；文化程度：初中10 例，高中24 例，大專及以上35 例。兩組一般資料差異無統計學意義（P ＞0.05）。本研究經溫州市中醫院倫理委員會審批通過。

1.2 方法 所有受檢者均采集空腹靜脈血，一支采血管為乙二胺四乙酸抗凝，用于提取單個核細胞D NA 分析凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多態性；另一支采血管為0.109 mol/L 枸櫞酸鈉抗凝，用于分離血漿檢測凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、纖維蛋白原（FIB）及D-二聚體。

1.2.1 凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多態性分析 使用苯酚-氯仿法提取血液中的單個核細胞DNA，干燥DNA 沉淀物置于-20 ℃保存待檢。采用實時熒光定量PCR 擴增技術分析凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T，PCR 引物使用Primer Premier 5 軟件 設 計，上 游引 物：5’-CCA GTCCCACTATCTAGAAAAG-3’，下 游 引 物：5’-CTATCAC AGCCATGAGCCAT-3’，產物長度594bp。反應條件：95℃預變性5 min，95 ℃變性40 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃延伸10 min，總循環30 個，4 ℃冷卻結束。檢測儀器為伯樂CFX Connect Real-Time 實時定量PCR 儀（美國BioRad 公司）。使用Chromas 軟件將測序結果與GenBank 基因庫中公布的凝血因子Ⅻ基因序列比對，分析基因型和等位基因型。

1.2.2 凝血指標 采用法國Stago STA-R 全自動血凝儀（配套試劑由法國STAGO 公司提供）及凝固法檢測PT、APTT 和FIB，采用SEKISUI CP-3000 全自動血凝儀（配套試劑由SEKISUI 公司提供）及免疫比濁法檢測D-二聚體。

1.3 統計方法 采用SPSS 22.0 統計軟件進行分析，采用Hardy-Weinberg 遺傳平衡對樣本的群體代表性進行分析，計量資料以均數±標準差表示，采用獨立樣本t 檢驗；多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗；計數資料采用2檢驗。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 分布特點兩組凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（均P ＞0.05），具有群體代表性。在基因型分布上，兩組CC、CT、TT 基因型頻率差異有統計學意義（2=7.888，P ＜0.05），觀察組CT基因型頻率高于對照組（2=4.696，P ＜0.05），TT 基因型頻率低于對照組（2=7.749，P＜0.05），而兩組CT 基因型頻率差異無統計學意義（2=1.660，P ＞0.05），見表1。在等位基因分布上，觀察組的C 等位基因頻率高于對照組（P ＜0.05），T 等位基因頻率低于對照組（P ＜0.05），見表2。

表1 兩組凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 基因型分布 例（%）

表2 兩組凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 等位基因分布 例（%）

2.2 兩組不同基因型的凝血因子Ⅻ活性比較兩組凝血因子Ⅻ活性差異無統計學意義（P ＞0.05），且兩組CC、CT、TT 基因型的凝血因子Ⅻ活性差異均無統計學意義（均P ＞0.05）。同組內3 種基因型的凝血因子Ⅻ活性比較，CC 基因型凝血因子Ⅻ活性高于CT 和TT 基因型，且CT基因型凝血因子Ⅻ活性高于TT 基因型（均P ＜0.05），見表3。

表3 兩組不同基因型的凝血因子Ⅻ活性比較 %

2.3 觀察組不同基因型患者的凝血指標及凝血因子Ⅻ活性比較 觀察組CC 基因型患者的APTT水平低于CT 和TT 基因型患者，且CT 基因型患者的APTT 水平低于TT 基因型患者（均P ＜0.05）。觀察組CC、CT、TT 基因型的PT、FIB、D-二聚體水平差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表4。

表4 觀察組不同基因型患者的凝血指標及凝血因子Ⅻ活性比較

3 討論

復發性流產一直是婦產科研究的重點，近年來研究發現，復發性流產孕婦具有血栓形成傾向，纖溶功能降低而凝血功能增強，血液呈高凝狀態[10-11]。凝血因子Ⅻ是一種由肝臟合成的絲氨酸蛋白酶，具有促進纖溶、抗血栓的作用[12-13]。目前分子基因學研究發現，不明復發性流產可能與凝血因子Ⅻ基因啟動子區DNA 甲基化水平升高相關[14]。也有研究表示，凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 表達與凝血因子Ⅻ基因的翻譯效率密切相關，進而影響凝血因子Ⅻ在血漿中的表達水平和活性狀態[15]。

本研究分析復發性流產婦女凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多態性特點，結果顯示觀察組的CT基因型頻率高于對照組，觀察組的TT 基因型頻率低于對照組；且觀察組的C 等位基因頻率高于對照組，T 等位基因頻率低于對照組（均P ＜0.05）。上述結果說明凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 為CT 基因型可能與復發性流產有關。國外有關凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多態性的研究也證實CT 基因型可能是孕齡期婦女發生復發性流產的重要發病原因[16]。本研究進一步研究發現兩組人群的凝血因子Ⅻ活性并無明顯差異，但深入對比不同基因型的凝血因子Ⅻ活性，可以發現CC 基因型患者的凝血因子Ⅻ活性高于CT 和TT 基因型，并且CT 基因型患者的凝血因子Ⅻ活性高于TT 基因型，TT 基因型患者的凝血因子Ⅻ活性最低。這可能是因為凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 的T 等位基因發生突變，可使原始的起始密碼子死亡堿基重新配對，形成新的起始密碼子，并使下游的終止密碼子也發生改變，使得凝血因子Ⅻ基因翻譯提前結束，故攜帶C 等位基因的患者凝血因子Ⅻ活性明顯上升，而T 等位基因的患者凝血因子Ⅻ活性明顯下降。另外，本研究比較不同基因型的復發性流產婦女的血漿凝血指標發現，CC 基因型患者的APTT 水平低于CT和TT 基因型患者，且CT 基因型患者的APTT 水平低于TT 基因型患者，即CC 基因型患者的APTT水平最低，而TT 基因型患者的APTT 水平最高。這說明復發性流產婦女凝血因子Ⅻ活性越高與APTT 縮短存在關聯。目前已有研究證實APTT與復發性流產密切相關，APTT 反映內源性途徑凝血因子的缺陷，APTT 縮短，血液處于高凝狀態，提示凝血亢進，會使子宮局部組織形成微血栓，造成胚胎缺血、缺氧，進而導致流產。胚胎死亡后發生自溶，激活內源性凝血途徑，進而影響凝血功能。另外，妊娠期孕婦本身會出現生理性的血液高凝狀態，加上凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 遺傳病變，APTT 縮短，凝血因子Ⅻ活性增高，易發生血栓形成，梗塞子宮-胎盤，影響血流循環，胎兒在子宮內缺血缺氧，未得到及時供氧，造成胎兒死亡，引起流產[17]。本研究發現其他的凝血指標如PT、FIB、D-二聚體水平，不同基因型患者無明顯差異，這可能是因為APTT是反映內源性凝血途徑的指標，臨床常用于測定內源性途徑的凝血因子Ⅷ、Ⅺ、Ⅻ等[18]。

綜上所述，凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 為CT 基因型可能與復發性流產有關，T 等位基因突變為C，引起凝血因子Ⅻ活性增高，APTT 縮短，導致血液高凝狀態和血栓形成，梗塞子宮-胎盤，誘發流產。對于復發性流產婦女，臨床可檢測凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多態性，進行基因診斷，明確病因，為妊娠保胎治療提供參考。