Akt、CCND1 通路相關蛋白在甲狀腺癌組織中的表達及與臨床病理特征的相關性研究

張福漢 管瑛瑛 陳桓 許建芳

（復旦大學附屬中山醫院廈門醫院 福建 廈門 361006）

甲狀腺癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，屬于一種起源于甲狀腺濾泡上皮或濾泡上皮細胞的惡性腫瘤。已有研究證實，甲狀腺癌的發生與發展受到不同的癌基因及多種生長因子影響，且發病機制與原癌基因序列的過度表達、突變或缺失等密切相關[1]。腫瘤的侵襲、轉移已被認為是致癌癥患者死亡的主要原因之一，其中細胞周期調控在腫瘤侵襲、轉移過程中發揮重要作用[2]。組織蛋白激酶B（Akt）是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在細胞增殖轉錄及細胞遷移等多種細胞過程中發揮重要角色。Akt可通過與多個信號通路的聯系，從而參加細胞周期進程、分化及遷移，也是重要的信號節點[3]。細胞周期素D1（CCND1）是細胞調控中重要的調控因子，是細胞周期中G1 期進入S 期調控細胞增殖的關鍵點，而該點調控異常被認為與腫瘤的發生、發展關系密切[4]。已有臨床研究表明，CCND1 在乳腺癌、肝癌、胃癌、鼻咽癌等惡性腫瘤中呈高表達，可能與治療療效及預后密切相關[5]。本研究前瞻性選取醫院收治的100 例甲狀腺癌患者為研究對象，測定甲狀腺癌組織與配對癌旁組織中Akt、CCND1 通路相關蛋白的表達水平，分析甲狀腺癌組織中Akt、CCND1通路相關蛋白表達水平與臨床病理特征的相關性。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻性選取醫院2019年8月至2022年8月收治的甲狀腺癌患者100 例為研究對象，其中男33 例，女67 例；年齡24～68 歲，平均（44.32±7.48）歲；體質量指數22.6～30.3 kg/m2，平均（24.76±2.31）kg/m2；病理類型：乳頭狀癌63 例，濾泡癌28 例，髓樣癌9 例；分化程度：高分化27 例，中分化48 例，低分化25 例；臨床分期：Ⅰ期21 例，Ⅱ期34 例，Ⅲ期28 例，Ⅳ期17 例。本研究經復旦大學附屬中山醫院廈門醫院醫學倫理委員會批準（批號：倫理字201800116 號）。

1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）符合甲狀腺癌診斷標準[6]，且經臨床實驗室檢查確診；（2）年齡≥18 歲；（3）對本研究內容知情，自愿參與并簽署知情同意書；（4）接受病理檢查。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤者；（2）嚴重心、肝、腎等臟器功能不全者；（3）合并嚴重自身免疫系統功能障礙者；（4）伴有凝血功能障礙者；（5）嚴重精神及認知功能障礙者。

1.3 Akt、CCND1 通路相關蛋白檢測 取患者甲狀腺癌及癌旁組織進行檢測：將甲狀腺癌組織及癌旁組織樣本經甲醛溶液固定后，用石蠟包埋，并將其切成4 μm 厚度的切片；經脫蠟處理后，使用梯度濃度酒精溶液進行脫水處理；使用pH 6.0 的枸櫞酸鹽緩沖液對切片進行浸泡修復抗原；再將切片放置在3%過氧化氫溶液中（室溫下）孵育10 min，孵育完成后使用磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline,PBS）進行3 次洗滌，使用封閉液封閉；將每份切面分別加入50 μl 鼠抗人Akt 抗體、CCND1 蛋白，放大倍數為1:2000，以4℃溫度進行孵育過夜，經PBS洗滌后加入抗體（兔抗鼠Akt、CCND1），放大倍數為1:5000，孵育1.5 h；使用DAB 顯色試劑盒進行顯色處理，采用中興樹膠進行封片，于顯微鏡下觀察。若陽性細胞數＜10%則記0 分，10%≤陽性細胞數≤25%記1 分，25%＜陽性細胞數≤50%記2 分，50%＜陽性細胞數≤75%記3 分，陽性細胞數＞75%則記4 分；染色情況，無著色記0 分，淡黃色記1 分，棕黃色記2 分，褐色記3 分。將上述得分相乘，若結果為0 分則為陰性，1～4 分為弱陽性，5～8 分為中陽性，9～12 分則為強陽性。

1.4 臨床病理特征分析 統計所有患者的性別、年齡、分化程度、病理類型、臨床分期及有無淋巴結轉移等。1.5 觀察指標 分析患者甲狀腺癌組織與配對癌旁組織中Akt、CCND1 通路相關蛋白表達水平，分析上述指標與臨床病理特征的相關性。

1.6 統計學方法 采用SPSS23.0 軟件處理數據。計量資料以（±s）表示，行t檢驗；計數資料以%表示，采用χ2檢驗；多因素分析采用Logistic 回歸分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Akt、CCND1 通路相關蛋白表達情況 甲狀腺癌組織中Akt、CCND1 通路相關蛋白陽性表達率明顯比甲狀腺癌旁組織高（P＜0.05）。見表1。

表1 甲狀腺癌組織及癌旁組織中Akt、CCND1 通路相關蛋白表達情況對比[例（%）]

2.2 Akt、CCND1 通路相關蛋白表達與臨床病理特征單因素分析 Akt、CCND1 通路相關蛋白陽性表達與性別、年齡無關（P＞0.05），但可能與分化程度、病理類型、臨床分期、淋巴結轉移有關（P＜0.05）。見表2。

表2 Akt、CCND1 通路相關蛋白表達與臨床病理特征的單因素分析[例（%）]

2.3 Akt、CCND1 通路相關蛋白表達與臨床病理特征多因素分析 多因素Logistic 回歸分析結果顯示，甲狀腺癌組織Akt、CCND1 通路相關蛋白表達陽性率高表達與甲狀腺癌低分化、髓樣癌、Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移存在密切相關性（OR＞1，P＜0.05）。見表3 至表5。

表3 賦值表

表4 Akt 通路相關蛋白表達與臨床病理特征的多因素分析

表5 CCND1 通路相關蛋白表達與臨床病理特征的多因素分析

3 討論

甲狀腺癌是我國發病率增長速度較快的惡性腫瘤之一，隨著腫瘤的不斷增長，可能壓迫或侵犯鄰近器官或組織，導致患者出現呼吸困難、吞咽困難等臨床癥狀，嚴重影響患者的正常生活質量及生命安全。臨床有研究表明，Akt、CCND1 通路異常表達與細胞的增殖與凋亡等諸多生物學行為密切相關，可能參與腫瘤的發生發展[7～8]。因此，分析Akt、CCND1 蛋白通路與甲狀腺癌患者臨床病理特征的相關性具有重要意義。

Akt 為組織蛋白激酶B，其在磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）下游被激活，也是細胞存活與增殖的關鍵調控因子，可經磷酸化多種底物發揮重要作用[9]。CCND1 屬于高度保守的細胞周期蛋白家族，其成員在整個細胞周期內具有顯著的蛋白質豐度周期性，可調節細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）。同時，該細胞周期蛋白與CDK4 或CDK6 形成的復合物能夠對亞單位起發揮調節作用[10]。有研究表明，CCND1 蛋白與腫瘤抑制蛋白Rb 相互作用，該基因在發生突變、擴增與過表達時可能會改變細胞周期的進程，且利于腫瘤的發生[11]。本研究結果顯示，甲狀腺癌組織中Akt、CCND1 通路相關蛋白陽性表達率明顯比甲狀腺癌旁組織高，提示甲狀腺癌組織中Akt、CCND1 通路相關蛋白陽性過表達。分析原因可能是，Akt 在與細胞膜上的磷脂酰肌醇相結合后可在細胞膜上聚集，經活化后形成p-Akt 進入細胞質與細胞核內，可作用于Akt 下游基因。p-Akt 可發揮抑制細胞凋亡相關蛋白與信號通路的作用，且能夠阻滯細胞凋亡，并促進細胞的存活，再經下游分子缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）誘導血管內皮生長因子（VEGF）的表達，從而促進腫瘤血管的形成[12]。裴小娟等[13]采用組織芯片免疫組織化學SP 法檢測p-Akt、c-Myc、E-cad 及VEGF 在甲狀腺癌中的臨床表達，分析其病理意義，發現p-Akt 的陽性高表達可能參與甲狀腺癌的發生，且與調控腫瘤新生血管有關，這與本研究結果近似。

本研究進一步行Logistic 回歸分析，結果顯示低分化甲狀腺癌組織Akt、CCND1 通路相關蛋白表達陽性率較中/ 高分化高，髓樣癌甲狀腺癌Akt、CCND1 通路相關蛋白表達陽性率較濾泡癌及乳頭狀癌高，Ⅲ～Ⅳ期甲狀腺癌Akt、CCND1 通路相關蛋白表達陽性率較Ⅰ～Ⅱ期高，有淋巴結轉移甲狀腺癌組織Akt、CCND1 通路相關蛋白表達陽性率較無淋巴結轉移高，提示Akt、CCND1 通路相關蛋白在甲狀腺癌組織中的陽性表達與分化程度、病理類型、臨床分期、淋巴結轉移等具有一定關系。分析原因，Akt、CCND1 通路相關蛋白在特殊的環境或疾病影響下被激活，導致細胞的增殖、侵襲與遷移能力加強，可提高甲狀腺癌的發生率，且增加腫瘤的惡性程度，加快病情進展。前者可通過調節細胞的增殖、凋亡等參與甲狀腺癌的發生與發展；后者可促進細胞的增殖，并能夠通過激活G1期特有蛋白CDK4 致使細胞周期異常，促成腫瘤細胞增殖等[14～15]。陳志峰等[16]通過對86 例甲狀腺癌患者癌組織與癌旁組織中Akt/CCND1 通路相關蛋白表達的檢測，發現甲狀腺癌患者癌組織Akt、CCND1 蛋白陽性表達率高于癌旁組織，且與臨床病理特征（分期、分化程度、病理分型及淋巴結轉移）密切相關，這與本研究結果一致。

綜上所述，Akt、CCND1 通路相關蛋白在甲狀腺癌組織中的陽性表達率較癌旁組織高，且與臨床病理特征（分化程度、病理類型、臨床分期、淋巴結轉移等）有一定關系。