布魯菌病患者外周血NK 細(xì)胞亞型及穿孔素蛋白的臨床分析

李宇璞，喬鵬飛，其其格，趙海珍，劉瑞軍，季曉磊

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院影像診斷科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染性疾病科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

布魯菌病（Brucellosis，簡稱布病）是由布魯氏菌屬（Brucella）細(xì)菌引起的全球性人畜共患變態(tài)反應(yīng)性傳染病，每年感染者超過50 萬[1]。布魯氏菌為胞內(nèi)寄生菌，在胞內(nèi)菌感染的機(jī)體抗感染免疫防御機(jī)制中，細(xì)胞殺傷效應(yīng)占主導(dǎo)地位[2]。自然殺傷細(xì)胞（naturel killer cell，NK）作為機(jī)體天然免疫細(xì)胞的主要成分，識別外來病原體，識別被病原微生物感染的細(xì)胞，如單核、巨噬細(xì)胞，并無需依賴抗體，無需預(yù)先致敏，通過穿孔素、顆粒酶等發(fā)揮細(xì)胞毒性作用；同時分泌大量干擾素、白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子、黏附分子受體及趨化因子的受體來發(fā)揮殺傷細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)作用。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)測定布病患者外周血NK 細(xì)胞表型及穿孔素蛋白、顆粒酶的表達(dá)，從而進(jìn)一步評估布病患者NK細(xì)胞功能狀態(tài)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例來源 選取內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科及內(nèi)蒙古地方病防治中心的布魯菌病患者，并將同期就診的健康人作為對照組。共納入65 例布魯菌病患者作為實驗組，按SAT 可分為兩組：將結(jié)果為SAT1：50（+～++）的30例，作為慢性布魯菌病患者組；將結(jié)果為SAT1：100（+～++++）的35例，作為急性布魯菌病患者組。并將同期體檢結(jié)果為BPT（-）、SAT（-）的30例作為健康對照組。故最終分組為RBPT（-）、SAT（-）組，SAT1：50（+～++）患者組和SAT1：100（+～++++）患者組。

1.1.2 疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)（同時符合以下項目者）流行病學(xué)史+典型的臨床癥狀體征+虎紅平板凝集試驗（RBPT）試管凝集試驗（SAT）和/或局部活組織病理檢查陽性或細(xì)菌學(xué)診斷陽性。

1.1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)（同時符合以下項目者） 門診/住院患者，年齡18～65 歲，符合布病診斷標(biāo)準(zhǔn)，自愿簽訂知情同意書。

1.1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 合并糖尿病、肺部感染、泌尿系統(tǒng)感染、風(fēng)濕病、腫瘤、心腦血管病及肝、腎、造血系統(tǒng)嚴(yán)重疾病及其他骨關(guān)節(jié)病，妊娠期或哺乳期，過敏體質(zhì)、精神病。

1.1.5 樣本量估算 病例數(shù)依據(jù)“樣本數(shù)須為變量數(shù)的5～10倍”的原則進(jìn)行調(diào)整

1.1.6 CD56brightCD16+、CD56dimCD16+、CD56brightNK 細(xì)胞穿孔素蛋白、顆粒酶B等均購自BD公司。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集符合納入標(biāo)準(zhǔn)患者治療前兩天采集人口學(xué)特征、流行病學(xué)調(diào)查，于清晨采集納入者空腹?fàn)顟B(tài)下外周血4 mL，并注入盛有EDTA 抗凝劑的抗凝管中低溫送至臨床試驗中心，6 h 內(nèi)處理樣本，進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記抗體和細(xì)胞毒效應(yīng)分子細(xì)胞內(nèi)染色，利用流式細(xì)胞儀檢測NK 細(xì)胞的表型、NK細(xì)胞穿孔素蛋白、顆粒酶B表達(dá)量。

1.2.2 實驗步驟（NK 細(xì)胞的表型、NK 細(xì)胞穿孔素蛋白、顆粒酶B表達(dá)）：

（1）樣品（全血）100 μL。

（2）胞膜標(biāo)記：樣品管依次加PerCP5 μL、FITC5 μL，渦旋混勻，室內(nèi)避光孵育20～30 min（25 min）。

（3）裂解：樣品管加1X 裂解液（10X 裂解液555899 1.5 mL+13.5 mL去離子水）2 mL，渦旋混勻，室溫避光孵育20～30 min（30 min），離心3000～5000 g/min（1600 r/min）5 min，棄上清液。

（4）PBS2 mL 重懸細(xì)胞，渦旋混勻，離心5 min（同上），棄上清液。洗2遍。

（5）固定：樣品管加固定液554722 250 μL，重懸細(xì)胞。4 ℃避光孵育20 min，離心5 min，棄上清液。

（6）洗滌：樣品管加1X 洗脫液（10X 洗脫液554723 1.5 mL+13.5 mL 去離子水）1 mL，渦旋混勻，離心5 min（同上），棄上清液。洗2遍。

（7）胞質(zhì)標(biāo)記：樣品管加1X 洗脫液50 μL，重懸細(xì)胞。依次加APC 5 μL、PE 5 μL，4 ℃避光孵育20～30 min（20 min）。

（8）PBS1 mL，重懸細(xì)胞，渦旋混勻，離心5 min（同上），棄上清液，洗1遍。

（9）PBS500 μL重懸細(xì)胞，上機(jī)，進(jìn)行流式分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件包分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用snk-q 檢驗；計數(shù)資料以例n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，以P＜0.05 表示組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

納入布病患者65 例，包括慢性布魯菌病患者SAT1：50（+～++）30 例和急性布魯菌病患者SAT1：100（+～++++）35 例，其中男性40 例、女性25 例，平均年齡48.84 歲，職業(yè)分布以農(nóng)民、獸醫(yī)為主；主要接觸牛羊，以接觸羊為主（見表1）。

表1 布魯菌病及對照組一般情況（n，±s）

表1 布魯菌病及對照組一般情況（n，±s）

一般資料RBPT(-)、SAT(-)組SAT1：50(+～++)患者組SAT1:100(+～++++)患者組例數(shù)性別（男/女）年齡（歲）職業(yè)接觸史30 15/15 52.43±10.85農(nóng)民羊30 17/13 50.86±12.25農(nóng)民羊35 23/12 48.03±15.24農(nóng)民羊

2.2 患者外周血NK細(xì)胞表型特點

應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)對布病患者（SAT1：100+～++++、SAT1：55+～+++）和對照組（SAT 陰性）外周血NK細(xì)胞（CD56brightCD16+/-+CD56dimCD16+）細(xì)胞進(jìn)行檢測。急、慢性布魯菌病患者外周血淋巴細(xì)胞中CD56dimCD16+和CD56brightNK 細(xì)胞細(xì)胞比率與RBPT（-）、SAT（-）組比較有所減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見表2）。

表2 3組外周血外周血NK細(xì)胞比例

2.3 穿孔素在急性布魯菌病患者（SAT1：100+～++++）外周血NK細(xì)胞的表達(dá)

流式細(xì)胞技術(shù)檢測了穿孔素、顆粒酶B 在NK細(xì)胞兩亞群CD56dimCD16+和CD56brightCD16+/-NK 細(xì)胞上的表達(dá)頻率。實驗結(jié)果表明急性布魯菌病患者（SAT1：100+～++++）外周血NK 細(xì)胞顆粒酶B 的表達(dá)率與RBPT（-）、SAT（-）組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而急性布魯菌病患者（SAT1：100+～++++）組外周血NK 細(xì)胞穿孔素蛋白的表達(dá)率與RBPT（-）、SAT（-）組NK 細(xì)胞穿孔素蛋白表達(dá)率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表3）。

表3 3組外周血外周血NK細(xì)胞顆粒酶B、穿孔素蛋白的表達(dá)

3 討論

NK 細(xì)胞作為人體抗感染免疫防御系統(tǒng)抵御外來病原微生物侵入的第一道防線，具有強(qiáng)大的溶解細(xì)胞的能力，其具備激活不受MHC 限制、不依賴抗體、無需預(yù)先致敏、快速非特異性地識別病原微生物、識別被感染的靶細(xì)胞、殺傷作用效果早等特性，在機(jī)體抗腫瘤和抗病毒的早期發(fā)揮重要作用[3]。同時也參與機(jī)體獲得性免疫調(diào)節(jié)功能。

在人體，NK 細(xì)胞主要分布于外周血循環(huán)和淋巴器官，在外周血中占單核細(xì)胞的5%～20%。NK細(xì)胞表型為CD3-CD56+，根據(jù)其功能不同按細(xì)胞表面CD56 和CD16 的表達(dá)水平不同分為CD56brightCD16+和CD56dimCD16+/-兩個不同的細(xì)胞亞群，它們在裂解靶細(xì)胞的功能上和產(chǎn)生細(xì)胞因子的功能上有所不同。外周血和炎癥組織中90%的NK 細(xì)胞為CD56dim，具有細(xì)胞毒性作用，而不足10%為CD56bright細(xì)胞，細(xì)胞毒活性低于CD56dim細(xì)胞，具有分泌免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子作用[4，5]。賴瀚鈴等[6]研究中提示在SLE患者外周血CD3-CD56+NK、CD16+NK、CD107a+NK細(xì)胞比例均顯著低于對照組，活動亞組SLE 患者CD3-CD56+NK、CD16+NK 細(xì)胞比例均顯著低于非活動亞組（P＜0.05）。張偉等[7，8]研究中梅毒患者與正常對照比較外周血中NK 細(xì)胞比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。梅毒患者NK細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)水平明顯上調(diào)，特別是CD56dimNK細(xì)胞，且Tim-3的表達(dá)與血清中IFN-γ 水平呈負(fù)相關(guān)性（P＜0.05，r=-0.4506）。潘招軍[9]認(rèn)為在EV71 感染和重癥手足口病患兒外周血NK 細(xì)胞顯著減少，主要表現(xiàn)為CD56dimNK 細(xì)胞的減少，而CD56brightNK 細(xì)胞無明顯變化，外周血CD56dimNK 細(xì)胞在手足口病患兒病情較輕時，細(xì)胞毒性作用（GL 和GB，CD107a）增加可能與病毒清除相關(guān)。EV71 感染患兒中，CD56brightNK 細(xì)胞增加，炎性細(xì)胞因子與抗炎因子分泌功能嚴(yán)重紊亂，可能參與了EV71 感染的手足口病的重癥化。劉貝貝等[10]在艾滋病的研究中得出Siglec-7+NK 細(xì)胞亞群功能優(yōu)于陰性亞群，但在HIV感染中本群發(fā)生明顯下降，Siglec-7+CD56dimNK細(xì)胞亞群數(shù)量與CD95的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。EBVcHL 患者與EBV-cHL 患者相比，CD56dimCD16 NK 細(xì)胞亞群頻率降低[10]。COVID-19患者NK CD57 和CD56dimNK 細(xì)胞比例較高，NKT 和CD56bright細(xì)胞比例較低[11]。我團(tuán)隊在前期研究中得出布魯菌病患者外周血NK 細(xì)胞計數(shù)下降的結(jié)論[12]。在本研究中，急、慢性布魯菌病患者外周血淋巴細(xì)胞中CD56dimCD16+和CD56brightNK 細(xì)胞細(xì)胞比例與RBPT（-）、SAT（-）組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

NK 細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷有多種途徑，如細(xì)胞毒性顆粒，其中含有穿孔素蛋白、顆粒酶A/B 和Fas配體等蛋白定向胞吐、特異性分泌溶酶體[13]；NK 細(xì)胞在與易感性靶細(xì)胞接觸后分泌干擾素-γ（IFN-γ），IFN-γ 可增強(qiáng)NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。黃崇剛等[14]認(rèn)為手足口病患兒存在NK 細(xì)胞穿孔素表達(dá)過高，危重型組、重癥組、普通型組患兒NK 細(xì)胞數(shù)低于對照組，其中危重型組、重癥組低于普通型組，穿孔素、顆粒酶B 反之，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。然而姜濤等[15]研究則認(rèn)為普通型手足口病組和重型手足口病組急性期比較，NK細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；重型組EV71 手足口病恢復(fù)期患兒較急性期明顯升高（P＜0.05）；普通型組EV71 手足口病恢復(fù)期患兒較急性期雖稍升高，但差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在HBV 相關(guān)性失代償期肝硬化（HBV-DLC）患者NK 細(xì)胞（包括CD56dimNK 和CD56brightNK 細(xì)胞）的功能特性的研究中提示[16]HCs 和HBV-CLC 患者相比，HBV-DLC 患者循環(huán)CD56brightNK 細(xì)胞頻率明顯升高，而循環(huán)CD56dimNK 細(xì)胞明顯降低。HBV-DLC 患者外周活化的CD56brightNK 細(xì)胞可能表達(dá)較低水平的抑制性受體CD158b1/2 和較高水平的活化受體NKG2D，其穿孔素和顆粒酶A/B 的表達(dá)也較HCs 明顯增加，提示HBV-DLC患者外周CD56brightNK細(xì)胞具有較高的免疫激活狀態(tài)。在HBV-DLC患者中，循環(huán)CD56dimNK細(xì)胞中CD107a 和穿孔素的表達(dá)與細(xì)胞溶解能力呈正相關(guān)，而循環(huán)CD56dimNK細(xì)胞中CD107a和穿孔素的表達(dá)顯著降低，提示循環(huán)CD56dim NK 細(xì)胞的溶解能力受損。此外，我們還發(fā)現(xiàn)循環(huán)CD56dimNK細(xì)胞穿孔素表達(dá)與HBV-DLC 患者的Child-pugh 分級呈負(fù)相關(guān)。實驗組中分泌IFN-γ 細(xì)胞數(shù)（SFU）較健康對照組增高（F= 25.413，P＜0.01）。登革熱患者NK 細(xì)胞內(nèi)穿孔素和顆粒酶B 的表達(dá)水平發(fā)生顯著上調(diào)，細(xì)胞脫顆粒水平也顯著增加[17]；同時表達(dá)穿孔素或顆粒酶B 的NK 細(xì)胞比例顯著高于CD8+T 細(xì)胞。布魯菌病患者血清中的IgG 抗體、穿孔素和顆粒酶B的濃度也增加（F=13.653，P＜0.01）[18]。本研究中急性布魯菌病患者，即（SAT1：100+～++++）患者組外周血NK細(xì)胞穿孔素蛋白的表達(dá)率與RBPT（-）、SAT（-）組比較有顯著下降。