微小RNA-18a 聯合胃泌素17 在早期胃癌中的診斷價值

梁 雄，趙貴君，汪 鋒，朱 虹，王清華

（內蒙古自治區人民醫院內鏡中心，內蒙古 呼和浩特 010017）

胃癌是常見的惡性腫瘤，病死率在惡性腫瘤中位居第二，我國胃癌新發病例和死亡病例約占全球的42.6%和45.0%[1]。胃癌的預后與腫瘤的分期密切相關，早期胃癌患者5年生存率超過90%[2]。常規內鏡觀察加組織活檢為金標準，但由于侵入性操作等原因，無法作為常規篩查手段。胃泌素作為重要的胃癌血清學篩查手段，操作簡單、成本低，但在臨床中單獨應用具有一定的局限性[3]。微小RNA（microRNA）作為內源性非編碼微小RNA 近年來被發現與胃癌的發生發展密切相關[4]。有研究表明早期胃癌中已有部分microRNA 特異性表達，且有研究表明[5]microRNA在血液中陽性檢出率要高于胃癌相關標記物CEA 等。這進一步表明microRNA 在早期診斷胃癌中有很大的潛力。本研究通過檢測早期胃癌外周血中的G-17 和microRNA-18a 水平變化，以明確其在早期胃癌中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年1 月至2020 年9 月在我院就診的320例患者，按照內鏡活檢和病理結果，納入慢性非萎縮性胃炎組98 例、慢性萎縮性胃炎組84 例、早期胃癌組76例（癌細胞局限于黏膜和黏膜下層）、進展期胃癌組62 例（癌細胞侵及肌層、漿膜層或漿膜外）。其中，早期胃癌組男性39 例、女性37 例，平均年齡（56.29±8.25）歲；進展期胃癌組男性37 例、女性25 例，平均年齡（59.22±8.86）歲；慢性非萎縮性胃炎組男性58 例、女性40 例，平均年齡（45.68±8.13）歲；慢性萎縮性胃炎組男性47 例、女性37 例。4組患者性別、年齡比較差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有病例排除消化道出血及消化性潰瘍等；在采集血液標本前均未經手術、放療以及化療；無特殊用藥史及無心、肝、腎等疾??；在采集樣本前均獲得患者或家屬的知情同意，并通過內蒙古自治區人民醫院倫理委員會審批。

2 方法

2.1 血microRNA-18a的測定

采集清晨空腹外周血5 mL，凝固后以3000 r/min離心15 min，分離血漿，置于-80 ℃冰箱中保存備用。按照試劑盒（TR-IZOL Reagent，美國Invitrogen公司）的說明書提取血漿總RNA，測定RNA提取液的總RNA 濃度并利用紫外分光光度計NanoDrop ND-1000 測定純度。利用1%變性瓊脂糖凝膠電泳對總RNA 質量進行分析。應用熒光定量PCR 儀檢測血漿microRNA-18a 的表達，選取U6 作為內參基因，microRNA-18a 和U6 的上游引物序列根據NCBI 上發表的基因序列使用Primer 5.0設計，microRNA-18a上游引物序列為：5′-GTGCTAAGGTGGATCTAGCAG-3′，U6 上游引物序列為：ACGATACAGAGAAGATTAGCATGG；下游引物為反轉錄試劑盒中的通用引物，引物序列為：GATCGCCCTTCTACGTCGTAT。所使用的試劑盒為TaKaRa 公司生產的TB Green?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）（具體反應體系見表1），反應條件為95 ℃30 sec、95 ℃5 sec、60 ℃30 sec，循環40 次，熒光信號在60 ℃時檢測。相對miRNA的表達水平用2－△△Ct表示。

表1 實時定量PCR反應體系

2.2 胃泌素-17測定

采用芬蘭Biohit 公司ELISA 試劑盒，采集清晨空腹外周血5 mL，凝固后以3000 r/min 離心15 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱中保存備用。使用酶聯免疫吸附實驗法檢測患者G-17。

3 統計學方法

所有數據采用SPSS 21.0統計學軟件進行分析，年齡、血清G-17 水平等計量資料以（±s）表示，采用t檢驗或F檢驗，應用受試者工作特征曲線下面積（ROC）評估診斷的敏感度和特異度。檢驗水準為α=0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

4 結果

4.1 血漿microRNA-18a和G-17的表達情況

早期胃癌組G-17 水平低于進展期胃癌組、慢性萎縮性胃炎組和慢性非萎縮性胃炎組，差異有統計學意義（P＜0.05）。早期胃癌組血漿microRNA-18a水平高于慢性萎縮性胃炎組和慢性非萎縮性胃炎組，但低于進展期胃癌組，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表2）。

表2 4組G-17及microRNA-18a檢測結果比較（±s）

表2 4組G-17及microRNA-18a檢測結果比較（±s）

注：與慢性非萎縮性胃炎組比較，aP ＜0.05；與慢性萎縮性胃炎組比較bP ＜0.05；與早期胃癌組比較cP ＜0.05。

組別例數G-17(pmol/L)miRNA-18a慢性非萎縮性胃炎組慢性萎縮性胃炎組早期胃癌組進展期胃癌組98 84 76 62 F P 8.53±8.78 7.33±7.54 3.14±1.92ab 14.92±7.05abc 20.178＜0.001 1.01±0.14 1.56±0.33a 2.55±0.49ab 3.13±0.54abc 873.263＜0.001

4.2 血漿microRNA-18a聯合G17對早期胃癌的診斷價值

血漿microRNA-18a 水平對EGC 的診斷價值根據ROC 分析，最佳的microRNA-18a 相對表達量的臨界值為2.55，診斷敏感度76.7% ，特異度83.2%。G-17 水平對EGC 的診斷價值根據ROC 分析，最佳的G-17 相對表達量的臨界值為3.14，診斷敏感度71.7%，特異度75.8%。G-17聯合microRNA-18a水平對EGC 的診斷價值根據ROC 分析，診斷敏感度81.5%，特異度88.9%（見圖1）。

圖1 早期胃癌患者miR-18a和G17表達的ROC曲線

5 討論

胃癌（GC）是我國常見的惡性腫瘤之一，發病率及病死率均排在前列[1]。由于胃癌早期特異性癥狀不顯著，又缺乏有效的篩查和早診手段，很多患者在確診時已屬中晚期，錯過治療最佳時期，患者5年的生存率不足30%[6]。晚期胃癌患者生活質量差，給家庭及社會帶來沉重的負擔。而如果能夠及時發現，大部分早期胃癌（early gastric cancer，EGC）乃至癌前病變在內鏡下即可獲得根治性治療，大大節約了醫療資源和社會成本，對改善患者愈后具有重要意義[2]。因此，尋找一種簡單、可靠、敏感度及特異度較高的診斷方法成為臨床上亟需解決的問題。

目前臨床上確診胃癌的金標準為胃鏡活檢。由于其操作給患者帶來痛苦等原因，該方法不適合作為篩選普查的手段。血清腫瘤標志物的檢測已作為胃癌篩查的有效手段，然而，這些標記物如CEA、CA724 等缺乏足夠的敏感性和特異性以促進早期檢測[7]。

胃泌素17是一種多肽類激素，由胃竇G細胞合成和分泌，用來調節胃酸的分泌和胃黏膜生長功能，是近年來早期胃癌篩查的新手段[8]。當胃竇出現萎縮時，胃泌素17 分泌水平會出現下降[9]。本研究對慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、早期胃癌和胃癌血中的G-17 水平進行了比較。結果顯示，早期胃癌組G-17 水平低于進展期胃癌組、慢性萎縮性胃炎組和慢性非萎縮性胃炎組。其原因是早期胃癌在發生發展上伴隨著G-17 分泌減少和消耗；而進展期胃癌組G-17 水平顯著高于慢性非萎縮性胃炎組和慢性萎縮性胃炎組。其原因可能是胃泌素促進腫瘤生長，在一定程度上表現出高胃泌素血癥[10]。通過本研究的ROC曲線可以發現，G-17診斷早期胃癌敏感度高達71.7%，但是特異度僅是75.8%，考慮其分泌到血循環中受到一些因素的影響，比如飲食結構、胃酸、藥物、感染等，本研究在試驗前要求患者清淡飲食，戒煙，停用抑制胃酸藥物及抗生素1周以上，并采集空腹血等，從而確保G-17在血液中的分泌水平，故從本研究中可以看出單獨應用G-17作為手段篩查早期胃癌不夠理想。

microRNA 是一組非編碼小分子RNA，它們通過抑制mRNA 的穩定性和翻譯而參與基因表達的翻譯后調控。最近的研究已經表明，特定microRNA的異常表達參與了各種人類惡性腫瘤，還有一些的microRNA已被證明具有重要作用，包括致癌和腫瘤抑制功能[11]。研究顯示[12]microRNA-18a是一種致癌基因，通過負調節PIAS3從而調節STAT3靶基因，在胃癌發展中起著至關重要的作用。此外，研究表明[13]microRNA在血清和血漿中也有穩定的表達，在常溫、強酸強堿環境以及反復冰凍及融解樣本，其穩定性不受影響；血漿中microRNA 耐核糖核酸酶非常穩定，并且血漿和血清中的樣本檢測有很好的相關性，這些特點都很適合作為腫瘤診斷的生物學標記物。有研究提示[14]，與正常組織相比，胃癌組織中MiR-17-92 簇過度表達，能夠促進腫瘤的發生，microRNA-18a是MiR-17-92簇編碼7個microRNA中表達最高且最頻繁的microRNA。本研究通過PCR熒光定量方法檢測慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、早期胃癌和進展期胃癌患者血漿中的microRNA-18a表達水平。結果提示早期胃癌組和進展期胃癌組血漿microRNA-18a 表達水平顯著上調，且高于慢性萎縮性胃炎組和慢性非萎縮性胃炎組。這提示血漿microRNA-18a 可能是胃癌的一個重要分子標志物，對早期胃癌的診斷有一定指示作用。本研究ROC曲線結果分析提示，早期胃癌中microRNA-18a具有較好的敏感度及特異度，分別為76.7% ，83.2%。進一步聯合G-17 監測，診斷早期胃癌的敏感度和特異度分別為81.5%、88.9%。這也進一步說明二者聯合后對早期胃癌的診斷有一定的指示作用，且兩者聯合可大大提高診斷的敏感度和特異度。

本研究的不足在于樣本量較少，對于胃泌素17及microRNA-18a的最佳臨界值確定，臨床上仍需要大量樣本的研究來共同探討。血漿microRNA-18a濃度與外周血細胞的相關性仍有待進一步大樣本研究確定。

綜上所述，胃泌素17、microRNA-18a 對早期胃癌的診斷具有一定的臨床價值。二者聯合診斷早期胃癌的敏感度和特異度較高，并且為非侵入性，能夠為早期胃癌的診斷提供可靠參考，值得進一步推廣應用。