亞麻葉中活性物質(zhì)提取工藝優(yōu)化研究

郭亮 趙愛萍

摘要：為篩選制定出亞麻葉中五種活性物質(zhì)的最佳提取工藝，以亞麻葉中提取的葒草素、綠原酸、異葒草素、牡荊素、異牡荊素5種成分的含量作為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)研究含醇量、提取時(shí)間、固液比、提取次數(shù)、提取溫度對(duì)5種成分提取效果的影響；并利用L9（34）正交試驗(yàn)法方法，優(yōu)選最佳的提取工藝。確定的最佳提取工藝為乙醇溶液濃度75%、料液比1 ∶ 15（g/mL）、提取次數(shù)2次、提取時(shí)間1.5 h、溫度80 ℃。該提取工藝是一種適合于亞麻葉中有效成分提取的有效方法，可為亞麻葉研究和開發(fā)利用提供參考。

關(guān)鍵詞：亞麻葉；五種成分；提取工藝；正交試驗(yàn)法

中圖分類號(hào)：S563.2? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：2097-2172（2023）06-0553-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.06.014

Study on the Process Optimization of Active Substances Extraction

from Flax Leaves

GUO Liang 1， ZHAO Aiping 2

（1. Gansu Province Product Quality Inspection East Branch Centre， Tianshui Gansu 741000， China;

2. Tianshui Drug Inspection and Test Centre， Tianshui Gansu 741000， China）

Abstract： To optimize the extraction process of five active substances from flax leaves， taking the contents of orientin， chlorogenic acid， isoorientin， vitexin and isovitexin extracted from flax leaves as indicators， the effects of alcohol content， extraction time， solid-liquid ratio， extraction times， and extraction temperature on the extraction effects for the five substances were studied by single factor experiment， the optimum extraction process was selected by L9 （34） orthogonal method. Results showed that the optimum extraction process was determined as ethanol content at 75%， solid-liquid ratio at 1∶15 （g/mL）， extraction for 2 times and extraction time for 1.5 h at the temperature of 80 ℃. This extraction process is an effective method suitable for the extraction of effective substances from flax leaves， which can provide reference for the research， development and utilization of flax leaves.

Key words： Flax leaf; Five ingredient; Extraction process; Orthogonal method

亞麻（Linum usitatissimum）為亞麻科亞麻屬植物，為重要的纖維、油料和藥用植物［1 - 2 ］。其莖葉主治肝風(fēng)頭痛、刀傷出血，風(fēng)邪入竅，口不能? ? 言［3? ］。有研究表明，亞麻莖葉中含5種天然黃酮類物質(zhì)［4 ］，此類黃酮物質(zhì)具有抗氧化、抑制炎癥、抗腫瘤、抗糖尿病、抗肝損傷、抗病毒、舒張血管、抗心律失常等多種作用［5 - 9 ］。亞麻葉種植廣泛，較金銀花、牡荊等藥用植物，來源易得且價(jià)格低廉，將其作為葒草素等黃酮類活性成分的提取原料具明顯的經(jīng)濟(jì)效益，前期實(shí)驗(yàn)室對(duì)亞麻葉中5種活性物質(zhì)的提取研究采用室溫下甲醇超聲處理的方法［10 ］，這種提取方式具有局限性，面臨著甲醇?xì)埩袅窟^高的問題，不適宜大規(guī)模開發(fā)與利用。為此，我們改用乙醇進(jìn)行提取，同時(shí)引入乙醇濃度、提取溫度、提取次數(shù)、液料比等因素，使用C8色譜柱，以梯度洗脫的方法測(cè)定提取量，通過正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化［11 - 12 ］，獲得一種以綠原酸、葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素為指標(biāo)的最佳提取工藝，為亞麻葉進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供技術(shù)儲(chǔ)備。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料

1.1.1? ? 儀器? ? 島津LC-20AD高效液相色譜儀；電子天平（Precisa XR 205SM）用于稱量標(biāo)準(zhǔn)品；電子天平（Mettler Toledo EL204-IC）用于稱量樣品。GZX-GF-MBS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.1.2? ? 試劑? ? 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)110753-200413）和牡荊素（批號(hào)111687-200602）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；葒草素［批號(hào)must-15015042213，純度99.26%（HPLC）］、異葒草素［批號(hào)must- 15071112 純度99.61%（HPLC）］、異牡荊素［批號(hào)must-14122411 純度99.86%（HPLC）］均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司生產(chǎn)，批號(hào)JB087430）；分析純甲酸來自市售（天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑，批號(hào)20201108）。

1.1.3? ? 供試材料? ? 亞麻葉采自甘肅省天水市秦州區(qū)中梁鄉(xiāng)農(nóng)田，為本地油用型亞麻品種。

1.2? ?方法

1.2.1? ? 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制? ? 精稱葒草素等5種標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇超聲溶解，定容至50.00 mL容量瓶中，制成質(zhì)量濃度分別為400.8、190.0、394.8、170.0、374.8 μg/mL的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5.00 mL至25 mL容量瓶中，用甲醇定制成混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液；準(zhǔn)確吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，加甲醇定容至5.00 mL，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.2.2? ? 色譜測(cè)定? ? 色譜測(cè)定條件為：色譜柱Inertsil C8（4.6×250 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相A（乙腈），流動(dòng)性B（0.1%甲酸水溶液），梯度洗脫，0～30 min（13%A），30～50 min（13%～30%A），50～60 min（13%A）；柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品溶液測(cè)定，記錄色譜（圖1）。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液色譜圖中，亞麻中葒草素等5種成分的保留時(shí)間一致。理論塔板數(shù)、拖尾因子、分離度等各項(xiàng)指標(biāo)均符合《中國(guó)藥典》2020版通則系統(tǒng)適用性的要求。

1.2.3? ? 線性關(guān)系考察? ? 精準(zhǔn)吸取混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液10 μL，按1.2.2的色譜條件測(cè)定，以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程（表1）。

1.2.4? ? ?亞麻葉提取工藝流程及測(cè)定? ? 將采集所得新鮮亞麻葉置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，40 ℃干燥至干。提取工藝流程為：干燥→粉碎→稱重（精準(zhǔn)稱取3.5 g）→加入提取溶劑（乙醇35 mL）→稱重→回流提取→離心→定容。

將提取液稀釋至標(biāo)準(zhǔn)品線性范圍內(nèi)，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，按照1.2.2條件測(cè)定提取液中葒草素等5種成分的濃度，計(jì)算提取量。

提取量（含量）=（C×V）/M

式中，C為成分濃度；V為體積，M為樣品稱取量。

1.2.5? ? 單因素試驗(yàn)? ? 基礎(chǔ)試驗(yàn)條件為乙醇溶液濃度70%，料液比1∶20 g/mL，回流提取時(shí)間1.5 h，提取溫度75 ℃，提取1次（設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)試驗(yàn)條件，在后面單因素篩選計(jì)中，只改變單因素參數(shù)，其他參數(shù)未發(fā)生變化）。單因素篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)：乙醇溶液濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 g/mL）、提取次數(shù)（1、2、3次）、提取溫度（65、70、75、80、85、90 ℃），每個(gè)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)兩次平行試驗(yàn)，以提取物平均值之和篩選因素水平。

1.2.6? ? 正交試驗(yàn)? ? 綜合單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以濃度、時(shí)間、次數(shù)、料液比等4因素為變量，建立3水平正交試驗(yàn)L9（34），因素與水平設(shè)計(jì)見表2。從5個(gè)因素經(jīng)單因素試驗(yàn)選取了其中四個(gè)，因溫度對(duì)提取量影響不大，最終為4因素3水平，以各成分提取總量為指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)法，篩選出最佳提取工藝。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?單因素試驗(yàn)

2.1.1? ? 乙醇濃度對(duì)亞麻葉中各成分提取量的影響

由圖2可見，隨著乙醇濃度的增加，亞麻葉中綠原酸、異葒草素、葒草素的提取量均呈先增加后降低趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度達(dá)70%時(shí)，亞麻葉中綠原酸、異葒草素、葒草素的提取量達(dá)最大值，之后隨乙醇含量的增加而逐漸減小；而濃度對(duì)牡荊素、異牡荊素的影響不大。通過以上分析，可將含醇量因素水平設(shè)在65%、70%、75%。

2.1.2? ?提取時(shí)間對(duì)亞麻葉中各成分提取量的影響

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的增加，亞麻葉種綠原酸的提取量變化不大，而葒草素、異葒草素、異牡荊素的提取量均呈先上升后下降趨勢(shì)，在1.5 h達(dá)最大值。提取物分散到溶劑中需要一定時(shí)間，時(shí)間越長(zhǎng)，提取量越大，但當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡后，繼續(xù)增加時(shí)間對(duì)提取量的影響不大，且時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致其他雜質(zhì)溶出競(jìng)爭(zhēng)分散系，使提取量有所下降。通過以上分析，可將提取時(shí)間因素水平設(shè)在1.0、1.5、2.0 h。

2.1.3? ? 料液比對(duì)亞麻葉中各成分提取量的影響? ? 圖4表明，隨著料液比的增加，亞麻葉中綠原酸、異葒草素、葒草素的提取量均呈先增加后下降趨勢(shì)，此過程中在料液比1∶20 g/mL時(shí)提取量顯著增加，之后變幅不大，而濃度對(duì)牡荊素、異牡荊素的影響不大。通過以上分析，料液比因素水平設(shè)在1∶15、1∶20、1∶25 g/mL可保證提取量的同時(shí)節(jié)約溶劑。

2.1.4? ? 提取次數(shù)對(duì)亞麻葉中各成分提取量的影響

由圖5可知，隨提取次數(shù)增加，提取量明顯減少，第3次的提取量?jī)H為第1次的0.4%～0.7%，因此，提取次數(shù)以2次為宜，為全面考慮，將3次列入水平考察范圍內(nèi)。

2.1.5? ? 提取溫度對(duì)亞麻葉中各成分提取量的影響

圖6表明，隨著提取溫度的增加，亞麻葉中5種成分的提取量總體變化不顯著。故提取溫度因素水平不再進(jìn)行正交試驗(yàn)考察。綜合5種物質(zhì)的提取量，為了使有毒成分生氰糖苷充分水解，考慮提取溫度定為80 ℃［13 - 14 ］。

2.2? ?正交試驗(yàn)

綜合以上單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用4因素3水平L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以確定最佳工藝條件。因素與水平設(shè)計(jì)見表2，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，方差結(jié)果見表4。

采用正交試驗(yàn)直觀分析法，由表3中R值可知，影響亞麻葉中綠原酸、異葒草素、葒草素、牡荊素、異牡荊素成分提取的因素主次為B ＞ C ＞ A ＞ D，即料液比 ＞ 提取次數(shù) ＞ 乙醇濃度 ＞ 提取時(shí)間，最佳提取條件為A3B1C3D2，且B因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，其余各因素?zé)o顯著影響。因第3次的提取量?jī)H為第1次的0.4%～0.7%，資源利用率低，考慮最佳工藝為乙醇溶液濃度75%、料液比1∶15 g/mL、提取時(shí)間1.5 h、提取次數(shù)設(shè)定為2次。

2.3? ?重復(fù)性試驗(yàn)

精準(zhǔn)稱取1.2.4工藝流程制備的亞麻葉樣品5 份 ，按1.2. 2下色譜條件測(cè)定，計(jì)算亞麻葉中綠原酸、異葒草素、葒草素、牡荊素、異牡荊素提取量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值（n=5）分別為1.36%、1.82%、0.99%、1.42%、1.71%，表明該提取工藝重復(fù)性良好。

2.4? ?回收率試驗(yàn)

精確稱取已知提取量的亞麻葉樣品6份，按提取量100% 精準(zhǔn)加入稀釋后的對(duì)照品溶液，換算加入的量為：綠原酸80.16 mg、葒草素76.00 mg、異葒草素39.48 mg、牡荊素3.40 mg、異牡荊素4.69 mg，按優(yōu)化工藝流程制備供試品，1.2.2下色譜條件測(cè)定提取量，計(jì)算回收率，RSD值結(jié)果見表5，結(jié)果表明，該提取工藝穩(wěn)定可靠。

3? ?討論與結(jié)論

亞麻葉中含有的葒草素、綠原酸、異葒草素、牡荊素、異牡荊素等5種成分是很多中藥材質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，具有多方藥理活性［15 ］。前期研究發(fā)現(xiàn)，亞麻葉中這幾種成分含量相對(duì)較多，且相比于金銀花、竹葉、牡荊等藥用植物，亞麻在我國(guó)種植廣泛，其葉價(jià)格低廉，來源易得；而乙醇回流提取法提取率和安全性高［16 - 17 ］，用乙醇回流提取法提取亞麻葉中葒草素、綠原酸、異葒草素、牡荊素、異牡荊素具有實(shí)用性好、可操作性強(qiáng)的特點(diǎn)，易于實(shí)現(xiàn)亞麻葉活性成分提取的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。本試驗(yàn)建立亞麻葉中這5種活性成分提取工藝，對(duì)亞麻葉的進(jìn)一步開發(fā)利用具有現(xiàn)實(shí)意義，為其進(jìn)一步分離、純化這些活性成分，研究提取物其他藥理和生物活性提供技術(shù)儲(chǔ)備。通過正交試驗(yàn)得出，工藝中料液比是影響亞麻葉中葒草素、綠原酸、異葒草素、牡荊素、異牡荊素5種成分提取率的主要因素，其余因素影響相對(duì)較小；其提取工藝最佳參數(shù)為乙醇溶液濃度75%、溫度80 ℃、料液比1∶15、提取次數(shù)2次，提取時(shí)間為1.5 h。該研究獲得了亞麻中中葒草素、綠原酸、異葒草素、牡荊素、異牡荊素5種成分提取的粗品，但其各自的分離純化工藝以及不同采收時(shí)間、不同產(chǎn)地的亞麻葉中這5種活性物質(zhì)的含量變化都有待繼續(xù)研究。

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收稿日期：2023 - 03 - 13

基金項(xiàng)目：甘肅省天水市科技支撐計(jì)劃（2020-NCK-7969）。

作者簡(jiǎn)介：郭? ?亮（1983 — ），男，甘肅天水人，工程師，碩士，主要從事藥物分析方面的工作。Email： 2956857401@qq.com。

通信作者：趙愛萍（1971 — ），女，甘肅天水人， 副主任藥師，主要從事藥物分析方面的工作。Email： 49542356@qq.com。