李翔　杜雙林　朱文平　張毅

摘要：在粳稻品種中花11的組培后代中發現了1個無花粉型雄性不育突變體osnp3。該突變體花藥細長且呈白色半透明狀，花藥中無成熟花粉粒，但其株高、有效穗數、穗粒數等農藝性狀與野生型中花11無明顯差異。花藥半薄切片觀察表明，突變體osnp3在花藥發育過程中其絨氈層細胞延遲降解，小孢子細胞淀粉未充實，最終小孢子細胞退化降解，花藥亦不能開裂。用突變體osnp3雜合株后代分離群體研究其遺傳規律，表明突變體osnp3受1對隱性核基因控制。利用秈稻明恢63（MH63）與突變體osnp3雜交的F₂定位群體將突變基因定位于第4染色體長臂C04D1、C04D3這2個標記之間，并與標記04008、C04D2共分離，物理距離約為0.96 Mb。測序表明，在定位區間內，1個編號為LOC_Os04g51070的基因第3外顯子中插入了約4 kb的逆轉座子，導致其功能缺失突變。該基因編碼1個含有bHLH結構域的轉錄因子，推測其通過轉錄調控參與花藥絨氈層細胞的降解；而其突變后絨氈層細胞未能正常降解，從而引起花粉敗育。

關鍵詞：水稻；隱性雄性不育；基因定位；osnp3

中圖分類號：S511.035.1文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2023）11-0106-07

水稻雄性不育是指水稻花藥無法產生正常功能的花粉，而其雌性生殖器官功能正常，異花授粉可以正常結實的現象。水稻花藥的發育歷程極其復雜，小孢子在此階段經歷減數分裂、有絲分裂，雄蕊原基不斷分裂分化，形成表皮層、內皮層、中間層、絨氈層，隨后又不斷降解。有學者對擬南芥花藥發育進行詳細研究，結合水稻花藥發育過程形態變化，對水稻花藥發育的時期作了新的14期劃分［1-3］。水稻花藥在發育的14個時期中，均受到一系列相關基因的精準調控，任何關于小孢子發育的調控基因、減數分裂基因、絨氈層發育調控因子、花粉囊和花粉外壁調控因子、花藥開裂調控因子等基因發生突變，均會引起花藥發育異常，最終導致水稻雄性不育［4］。

目前已鑒定出大量與水稻雄性不育有關的基因［5］，包括與絨氈層細胞發育和降解相關的基因Undeveloped Tapetum1（UDT1），該基因調節與控制花藥最內層絨氈層細胞的基因表達以及花粉母細胞的減數分裂［6］。UTD1突變體的絨氈層在減數分裂期時空泡化，中間層的降解并未正常進行，出現延遲，由此引起性母細胞不能發育成花粉，導致花粉的完全敗育。Tapetum Degeneration Retardation（TDR）在絨氈層細胞PCD過程和形成花粉壁過程起到正向調控的作用，其內在機制是直接結合到PCD基因OsCP1和OsC6啟動子區，在TDR突變體中，絨氈層細胞核中間層細胞的降解均出現延遲現象，小孢子從四分體中釋放后被迅速降解，因此導致雄性不育［7］；Eternal Tapetum1（EAT1）［8］是作用在TDR的下游，兩者共同調節絨氈層的降解與花粉發育。EAT1還可以通過直接調控位于其下游的天冬氨酸蛋白酶基因OsAP25、OsAP37的表達，正向調控絨氈層PCD。Tdr Interacting Protein2（TIP2）通過作用在UDT1、GAMYB的下游和TDR、EAT1的上游，直接調控兩者的表達［9-10］。GAMYB4基因通過編碼赤霉素誘導的MYB轉錄因子，調控水稻絨氈層PCD以及花粉發育的過程，同時也影響花粉囊和糊粉層發育過程中淀粉酶的表達［11］。API5（Apoptosis Inhibitor 5）基因通過編碼1個動物抗凋亡蛋白的同源蛋白，正向調控絨氈層PCD，API5突變體抑制PCD過程，延遲絨氈層細胞的降解，引起小孢子發育受阻，最終導致花粉敗育［12］。Persistent Tapetal Cell1（PTC1）基因通過編碼PHD-finger轉錄因子，調控絨氈層細胞發育與花粉粒的形成［13］，在花粉發育的第8至第9時期［1］，PTC1基因主要是在絨氈層細胞和小孢子細胞中表達，在ptc1突變體中，絨氈層細胞出現了降解延遲，并且呈炭疽狀壞死現象，花粉壁細胞與花粉發育也出現了異常，由此導致典型的花粉敗育。OsNP1是通過編碼一種葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶，在絨氈層和小孢子中特異表達，調節絨氈層PCD及花粉外壁形成［14］。BayMax1（BM1）［15］、Earlier Degraded Tapetum1（EDT1）［16］、OsALDH2b［17］、Tdr Interacting Protein3（TIP3）［18］、GAMYB5［19］、Microspore and Tapetum Regulator1（MTR1）［20］等一系列相關轉錄調控基因分別通過直接激活目標基因，或通過彼此之間的間接調節，并同時協同調控共同靶基因的表達等不同方式，直接或者間接調控水稻絨氈層PCD，其隱性突變則會導致絨氈層降解提前或者延遲，最終導致小孢子發育受阻，出現雄性不育。

水稻的雄性不育在雜種優勢利用中具有重要的應用價值，我國最早的三系雜交水稻育種技術用核質互作雄性不育創造了不育系和保持系，實現了三系配套［21］；隨后進一步利用光溫敏雄性核不育，實現了不育系和保持系的一系兩用，創造了兩系雜交水稻育種技術［22］，為我國雜交水稻育種作出了貢獻。隨著分子設計育種的進一步深入，鄧興旺等也進一步提出水稻智能不育分子設計育種——第3代雜交育種技術（G3育種技術）［23-24］，解決了雜交稻育種過程中資源利用率低、育種周期長等瓶頸問題。這樣的新型不育系兼具三系法的穩定性和兩系法不受恢保關系影響、配組靈活的優點，比三系和二系雜交水稻育種技術又進了一步，使得更多的水稻普通隱性雄性不育材料的有了應用前景。

本研究在粳稻品種中花11組培后代中鑒定出1個無花粉型雄性不育突變體，命名為osnp3，遺傳分析表明該性狀受1對隱性核不育基因控制。以該突變體為研究對象，進行了花藥發育過程的初步觀察，并對osnp3基因進行了定位和候選基因分析，旨在深入了解水稻雄配子發育的分子機理，以及為隱性雄性核不育及相關基因在雜交水稻育種中的應用提供種質資源和理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

osnp3是從粳稻品種中花11組培后代中鑒定出的一個無成熟花粉粒的雄性不育突變體。用秈稻明恢63（MH63）與突變體osnp3雜交后產生的F₂代作為定位群體。所有材料于2019—2021年種植在云南省西雙版納傣族自治州景洪市嘎灑鎮試驗基地，種植和管理同大田生產。

1.2遺傳規律分析及基因定位群體的構建

以突變體osnp3雜合株后代作為分離群體，統計表型正常和不育株的分離比例，用于遺傳分析。以秈稻明恢63（MH63）作為父本、突變體osnp3作為母本雜交，其F₂代作為定位群體。

1.3花粉碘染觀察

開花期，在田間分別隨機選取野生型中花11和突變體osnp3植株各3株，每株隨機采集主穗中上部3朵穎花，用1.5% I2-KI溶液染色后，在光學顯微鏡下觀察花粉育性。

1.4突變體osnp3花藥的半薄切片觀察

取野生型中花11和突變體osnp3不同發育時期的穎花，于戊二醛固定液中（3.5%，用0.2 mol/L的PBS配制，PBS最終濃度為0.1 mol/L） 固定；利用真空泵抽氣，緩慢放氣，重復至樣品全部沉底，然后放入4 ℃冰箱保存備用；用0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗，沖洗完成后盡量吸干磷酸緩沖液后再用1%的鋨酸固定1～2 h；0.1 mol/L磷酸緩沖液置換2次，每次10 min左右；梯度乙醇脫水和無水丙酮脫水；再用包埋劑和丙酮混合液預包埋浸透2 h，換純包埋劑滲透2 h，60 ℃恒溫箱中烘烤4 d左右。用Leica RM2265半薄切片機橫切花藥，切片厚度為 3 μm。甲苯胺藍染色后用Leica DM200光學顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.5DNA的提取和基因定位

在F₂定位群體中，隨機選取15株野生型單株和15株突變體單株，各剪取適量葉片混合，液氮研磨后，CTAB抽提，構建可育基因池和不育基因池；F₂群體則單株提取。利用實驗室預先設計好的137對InDel引物在基因池間篩選多態性標記。對在基因池間呈多態性的標記進行連鎖驗證，用連鎖標記對F₂群體的不育單株進行基因型分析。根據不同連鎖標記的交換子數量及分布，結合標記的物理位置確定初步定位區間。

在初步定位的區間內用Premier 5.0軟件進一步設計開發InDel標記，對突變基因進行精細定位。所用引物（表1）均由Tiangen生物科技有限公司合成。

PCR擴增采用12.5 μL反應體系：ddH2O? 8.875 μL；Buffer 1.25 μL；dNTPs 0.25 μL；Primer 1 μL；Polymerase 0.125 μL；模板DNA 1 μL。PCR程序如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴增產物經8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，0.1% AgNO3染色，甲醛和NaOH顯色。

1.6候選基因分析

用突變體osnp3雜合株后代分離群體作為測序群體，在開花期取可育、不育個體各30株的葉片分別提取DNA，混合成可育基因池、不育基因池，送到天津諾禾致遠公司進行基因組重測序。利用IGV分析定位區間內發生突變的位點，在水稻基因組注釋計劃數據庫（http//rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）中進行比對和查閱，以確定目的基因及相關信息。

2結果與分析

2.1突變體osnp3表型分析

突變體osnp3在株高、有效穗、穗粒數等株型性狀（圖1）和穗部性狀較野生型中花11（圖2-A、圖2-B）無明顯差異。野生型中花11的花藥飽滿呈黃色，而突變體osnp3的花藥瘦小呈白色（圖2-C至圖2-F）。花粉鏡檢結果顯示，野生型中花11的花粉粒全部被I2-KI染成黑色，而突變體osnp3花藥無花粉粒釋放出來，完全敗育 （圖2-G、圖2-H）。該結果表明，相關基因對重要的農藝性狀、花器官形態無明顯影響，但對花藥形態和花粉發育有嚴重影響。

通過花藥半橫切來觀察野生型和突變體osnp3在花藥發育過程中的差異。將花藥發育劃分為14個階段［1］，在第10期之前，野生型和突變體osnp3的花藥發育過程無明顯差異。在野生型中，第10期（圖3-A）絨氈層繼續退化，呈山丘狀，小孢子液泡變大，呈圓球形；第11期（圖3-B），絨氈層降解成為薄薄一層，附著在內壁上，小孢子呈鐮刀型；在第12期（圖3-C），此時已經見不到絨氈層細胞的痕跡，小孢子也因為內部飽含淀粉和脂質等物質而變圓；在第13、14期，花粉因為營養物質的不斷積累而

更充實，花藥壁變得更薄，最后花藥開裂，完成散粉。而在突變體osnp3中，在第10期（圖3-F）的時候能夠觀察到正常的絨氈層，且與野生型并無明顯差異，小孢子發育也正常；但是在第11期（圖3-G），絨氈層并未降解，小孢子發育未見異常；在第12期（圖3-H），絨氈層細胞依然存在，小孢子開始皺縮，在正常情況下，此時的小孢子內部應該充斥淀粉脂質等物質，正是因為絨氈層未能降解，不能為小孢子的成熟提供營養物質及騰出空間，導致在第12期時小孢子的皺縮及隨后的降解，也導致第13期（圖3-I）和第14期（圖3-J）沒有成熟的花粉粒。上述觀察結果表明，突變體osnp3的花藥絨氈層細胞降解異常，小孢子細胞在有絲分裂階段無法積累淀粉，不能完成花粉充實，小孢子細胞退化，最終不能發育出成熟的花粉粒，導致敗育。

2.2突變體osnp3不育性的遺傳規律分析

osnp3和野生型的雜交F₁育性正常，F₂育性分離，正常株與不育株的比例經χ2檢驗，符合3 ∶1（表2），表明正常表型對突變表型為顯性，該突變體的雄性不育受一個隱性核基因控制。

2.3目的基因的定位

選取平均分布于12條染色體上的137對InDel標記，在osnp3×MH63的F₂群體可育基因池和不育基因池之間篩選多態性標記，最終在第4染色體（圖4-A）上篩選到9對在基因池間呈現多態性的標記04007、04010、0413、0420、0421、0424、0425、0426、0429 （表1）。將4對（0420、0424、0426、04010）在基因池間表現差異的標記用F₂定位群體中的15株可育株與15株不育株進行單株驗證，均呈現連鎖。用這4個標記對F₂中35株不育株進行群體篩選，標記0420單交換株數為7，雙交換株數為2，重組配子數為11；標記0424單交換株數為4，雙交換株數為0，重組配子為4；標記0426單交換株數為0，雙交換株數為0，重組配子數為0；標記04010單交換株數為3，雙交換株數為0，重組配子數為3。其中標記0424的交換株與標記0420完全重合，標記0420與0424交換株與標記04010完全不重合，最終得出該突變位置位于標記0424與04010之間，與標記0426共分離（圖4-B）。

在初步定位的區間內用Premier 5.0軟件及在Gramene（http：//www.gramene.org）Blast分析，進一步設計開發多態性標記，其中C04D1、C04D2、C04D3、C04D5、04008在親本（秈稻明恢MH63和突變體osnp3）間呈現多態性。用這5對引物對F₂定位群體中65株不育株進行群體篩選，其中標記C04D1單交換株數為17，雙交換株數為1，重組配子數為19；標記04008單交換株數為0，雙交換株數為0，重組配子數為0；標記C04D2單交換株數為0，雙交換株數為0，重組配子數為0；標記C04D3單交換株數為2，雙交換株數為0，重組配子數為2；標記C04D5單交換株數為21，雙交換株數為0，重組配子數為21，且標記C04D3交換株與標記C04D5完全重合，與標記C04D1完全不重合。因此將目標基因定位于標記C04D1和標記C04D3之間，與標記04008和標記C04D2共分離 （圖4-C）。

2.4重測序確定候選基因

根據重測序的結果（圖5-A），在定位區間內，發現突變體osnp3中，注釋基因LOC_Os04g51070第3外顯子上有大約4 kb的逆轉座子插入（圖5-B）。根據以上結果，將LOC_Os04g51070確定為osnp3的候選基因。

根據水稻基因組注釋數據庫（Rice Genome Annotation Project）提供的水稻基因組注釋序列，該候選基因LOC_Os04g51070編碼1個bHLH轉錄因子，可能通過轉錄調控參與水稻花藥絨氈層細胞的降解。此前有報道闡述了EAT1基因編碼1個控制絨氈層表達的bHLH轉錄因子，該報道中的EAT1基因［8］與本研究中的突變基因為同一基因。由于逆轉座子的插入導致該基因的功能缺失，從而使絨氈層細胞PCD失敗，引起花粉敗育。

3討論

本研究中，突變體osnp3表現出花藥瘦小呈白色透明，經I2-KI染色壓片后，藥室中并未觀察到花粉粒，完全敗育。花藥半薄切片顯示突變體osnp3絨氈層細胞降解異常，最終導致小孢子發育失敗，形成無花粉型雄性不育。遺傳分析和基因定位表明，突變體osnp3由1對隱性核基因控制，位于第4染色體長臂的C04D1、C04D3這2個標記間， 與04008、

C04D2標記共分離，物理距離約為0.96 Mb。經過基因組重測序分析發現，該區域中編碼bHLH轉錄因子基因LOC_Os04g51070的第3外顯子有大約 4 kb 的逆轉座子插入，最終導致絨氈層細胞PCD失敗，由此導致突變體osnp3敗育。

本研究中的突變體osnp3是雄性不育基因EAT1＼DTD的一個等位突變體EAT1［8］，EAT1表現為絨氈層細胞的延遲死亡，通過末端脫氧核苷酸轉移酶介導的 dUTP末端標記（TUNEL）檢測和透射電鏡（TEM）檢測，發現在eat1絨氈層細胞中，直到花藥發育第10期，均未觀察到明顯的DNA碎片信號。在第11期，突變體eat1花藥的所有4層均可見微弱的DNA片段信號，提示PCD延遲和異常。本研究的突變體osnp3花藥半薄切片發現的敗育特征與eat1的敗育特征一致。

Ono等的研究表明，EAT1是一種bHLH轉錄因子，是減數分裂后花藥絨氈層程序性細胞死亡（PCD）的關鍵，其他bHLH蛋白TIP2和UDT1也在這一過程中發揮了重要作用［25］。

水稻隱性核不育對改進水稻種群有積極的作用，利用雜交、回交、測交等育種方法，使優勢基因聚集，從而使表型更優良，創造出更具競爭力的雜交水稻品種。本研究以中花11組培后代中的突變體osnp3為對象，觀察了其表型及研究了遺傳規律，并且利用不育突變體osnp3與MH63雜交衍生的分離群體，成功地將osnp3定位于水稻第4染色體上C04D1、C04D3這2個標記間，與04008、C04D2標記共分離，通過重測序確定了候選基因。下一步需要設計相關引物，通過PCR擴增測序驗證，進一步證實可能的插入突變，還需構建互補表達載體驗證OsNP3基因的功能等，以進一步了解改基因的功能，旨在為其在雜交稻選育中的利用奠定基礎。

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