許有嬪　吉冰璇　王林葉　張啟軍

摘要：穗粒數是構成作物產量的三大要素之一，與作物產量具有顯著的正相關關系，定位、克隆與穗粒數有關的新基因為解析作物產量構成具有十分重要的意義。利用穗頸注射法將高粱基因組DNA導入水稻品種9311中，在后代篩選到1個稀穗突變體，暫定名為lax3。研究了該突變體的主要農藝性狀和稀穗的遺傳方式，并對該稀穗突變基因進行了精細定位。研究結果表明，該稀穗突變體lax3在株高、分蘗、枝梗和穗粒數上與受體9311相比存在顯著的差異。遺傳分析表明該突變體的稀穗性狀受1對隱性核基因控制，用lax3/02428 F₂群體將該基因初步定位在水稻第4染色體上，位于SSR標記RM16335和RM16424之間，交換單株分別為5株和3株。通過擴大遺傳群體和進一步開發標記，最后將該基因定位在RM16349和Indel標記In4-8之間，兩者之間的物理距離約為96.9 kb。本研究結果為進一步克隆該基因、解析水稻穗粒結構調控機制和分子輔助選育奠定一定的基礎。

關鍵詞：水稻；稀穗；lax3（t）基因；精細定位

中圖分類號：S511.032文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2023）11-0087-05

水稻作為全世界一半以上人口的主糧，其產量對保障全球糧食安全和維持世界社會穩定具有十分重要的作用。作物產量是由分蘗數、每穗粒數和粒質量三因素共同決定的［1］，水稻的穗分枝數則直接決定著穗粒數，因此，研究調控水稻穗分枝形成機制不僅能解決植物發育相關的基本問題，還對作物產量的提高有著重要作用［2-3］。水稻屬于圓錐花序，包含一個主穗軸、螺旋狀環繞在主軸上的一級枝梗、以兩行交錯方式著生在一級枝梗上的二級枝梗，以及一、二級枝梗末端著生的小花，每個小花則由退化穎殼、護穎、內稃和外稃、雌蕊和雄蕊構成［3-5］，任何一個影響水稻花序的因子都可能影響其最終產量。

參與水稻幼穗發育的基因可分為調控枝梗分生組織的形成、枝梗分生組織的大小、小穗分生組織的轉變時間以及枝梗的伸長這4類［3，5-6］，而枝梗分生組織的形成過程是整個水稻幼穗發育的基礎，后期水稻枝梗的有無、多少、空間布局都是由枝梗分生組織的發育決定的。目前報道的參與水稻枝梗分生組織起始的基因主要有LAX1、LAX2、SPA、FZP、MOC1和SPL基因家族。LAX1（Lax Panicle 1）編碼一個植物特有的bHLH轉錄因子，lax1突變體的穗部分枝和種子減少，嚴重時則只有穗軸，不產生枝梗，并且不結實［7-9］。LAX2也被稱為Gnp4 （Grain Number Per-Panicle 4），編碼1個核蛋白，該核蛋白含有植物特異的保守結構域，與LAX1互作一起參與調控水稻腋生分生組織的形成［10-11］。lax2突變體和lax1突變體的表型極為相似，穗部分枝減少，側生小穗消失［2，10］。而lax1/lax2雙突變體在前期內完全不分蘗，而后期二級枝梗及在一級枝梗上著生的小穗的發育則被完全抑制［10］。SPA（Small Panicle）雖是LAX1的功能冗余基因，但也控制水稻腋生分生組織的產生。spa突變體的穗分枝數、二級枝梗數和每穗小穗數都有所減少，且一級枝梗變短并缺失顯著［8］。MOC1（Monoculm 1）基因通過控制整個生育期內腋生分生組織的形成從而影響其分蘗數和穗部枝梗的數目。mocl突變體由于不能正常啟動腋芽的發育，導致其除主莖外完全沒有任何其他分蘗［12］。雖然LAX1、LAX2和MOC1三者之間存在功能冗余，但是任意2個基因同時缺失時均會嚴重抑制分蘗芽的起始［10］，其三者之間具體的調控機制還是不清楚，需要更多研究來進一步揭示；MOC3可能與前三者共同調控水稻分蘗芽的起始，但它主要在側生分生組織形成的早期表達，而在側生分生組織形成后消失，可能位于MOC1或LAX1的下游，也可能通過另外一條途徑參與分蘗芽形成的調控［13-14］。

FZP（Frizzy panicle）是玉米BD1基因在水稻中的同源基因［15］，它通過抑制小穗分生組織內腋生分生組織的過度生長來維持從小穗分生組織到終端小穗的轉換。由于fzp2突變體的終端小穗分生組織和側生小穗分生組織退化的時間點被阻斷，導致原本應發育的小穗及花器官無法起始生長，本應該形成小穗的部位被二級枝梗代替，最終表現為穗軸過度分枝［16-17］。雙突變體lax1/fzp2則表現為二級和二級以上枝梗、終端小穗等結構完全消失，表明LAX1基因和FZP2基因分別作用于2條獨立的通路來完成對水稻穗型的控制［7］。

SPL（squamosa promoter binding protein like）基因家族是植物特有的轉錄因子，其中SPL7、SPL14和SPL17這3個在穗部高表達的基因都是通過RCN（reduced culm number）來調控穗型結構［18］。SPL14和SPL17的RNAi干擾株系表現出穗枝梗數和小穗數明顯下降，說明SPLs能正向調控花序和分枝分生組織的活性；進一步研究顯示，SPL14能夠直接調控PAP2（panicle phytomer 2），即OsMADS34基因［19］，OsMADS34的轉錄起始于花序發育第一期，在花序分生組織和枝梗分生組織的發育早期開始積累［20］，其突變體表現為一次枝梗數目增加，二次枝梗上的籽粒變小，結實率降低［21］。最近被鑒定的基因CPB1（Clustered Primary Branch 1），為D11（DWARF11）新的等位基因，其突變體cpb1表現為穗部一級枝梗簇生，小穗數減少［22］。而D11屬于細胞色素P450家族，參與油菜素內酯的生物合成途徑，該激素如何調控水稻的枝梗分化和發育還不是很清楚［22］。

盡管目前已經報道了一些調控水稻枝梗分生組織形成的基因，然而，穗粒數的形成不但受前期營養生長期的發育限制，其營養生長轉向生殖生長本身也是一個十分復雜的生物學過程，受到很多因素協作調控［3-6，23］，部分基因的作用機理還不清楚，比如雖然LAX1在生長素介導的花序形態發生中起著重要作用，但其作用方式仍不清楚，僅知其在新的分生組織形成時以非細胞自主性的方式行使功能［7］，故要完全解析水稻枝梗形成的調控機理還需要不斷發掘新的更多相關的基因。

1材料與方法

1.1試驗材料

本研究中使用的水稻材料稀穗突變體、9311和02428材料均由筆者所在單位保存。在水稻葉枕平期，將來源于雜交高粱吉雜123的基因組總DNA從穗頸處直接注射到優良恢復系9311的幼穗中［24］，從其后代M₄群體中選育出穩定遺傳的稀穗突變體，暫命名為lax3。

分別構建lax3與9311和02428正反交制備F₁，并套袋自交繁衍為F₂群體，播種、單株移栽都在江蘇省農業科學院南京水稻試驗田中進行，并按水稻常規栽培管理。

1.2試驗方法

1.2.1突變體與野生型部分農藝性狀調查按照文獻［25］的記載方法和要求在水稻成熟期分別對突變體lax3和野生型9311進行株高、分蘗數、有效分蘗數、穗粒數、一次枝梗數和二次枝梗數進行調查、統計，然后采用卡方檢驗二者在這些農藝性狀上是否具有顯著差異。

1.2.2遺傳分析利用lax3/02428 F₂群體中186個隱性單株作為初定位群體，同時在整個分離群體的齊穗末期選取正常穗和稀穗各10株提取基因組總DNA各自等量混合，分別構建正常穗和稀穗近等基因池。隨后選取多態性豐富且均勻分布在水稻12條染色體的160對SSR引物對親本02428與稀穗lax3的基因組總DNA進行多態性分析，篩選出在這2個材料之間具有多態性的引物；用這些在親本間具有多態性的引物進一步篩選出在正常穗和稀穗近等基因池上具有多態性的引物用于該稀穗突變體基因的初定位。

在初定位的基礎上通過擴大定位群體，即選用lax3/02428 F₂群體中697株稀穗單株來進行該基因的精細定位。在初定位區域內進行引物加密合成，同時開發目標區域內新的InDel標記。InDel標記的開發是根據已公布的水稻測序品種9311和日本晴在初定位區間內存在的插入或缺失位點信息進行設計新的SSR引物，即選取某差異位點兩端各200 bp左右的一段日本晴基因組DNA序列，再利用Primer Primer 5.0軟件設計能完全覆蓋差異位點新的SSR分子標記。

在開發出新的InDel標記的基礎上，先在2個親本間篩選出具有多態性差異的InDel標記，然后在近等基因池上進一步驗證其多態性差異，最后選擇在近等基因池上具有差異的分子標記在擴大的隱性單株群體上進行PCR和聚丙烯凝膠電泳分析，統計各個分子標記在群體上的單交換數量，用于基因的連鎖遺傳分析。

2結果與分析

2.1突變體lax3的農藝性狀表現

在水稻的營養生長期，突變體與野生型9311之間的農藝性狀差異不大，主要差異表現株高和分蘗上，突變體lax3較9311的株高矮些，分蘗也少些。在水稻的抽穗灌漿期，突變體的株高比野生型9311平均矮9.3 cm，而播抽期相差不大；從后期室內考種結果看，突變體lax3無論是在（有效）分蘗數、一、二次枝梗數上還是每穗總粒數上都顯著低于野生型9311（圖1和表1）。該突變體整個生育期農藝性狀表現類似于已經報道過稀穗突變體lax1-1［26］和lax2-1［10］，三者的共同點都是單株分蘗數、二級枝梗數和每穗粒數顯著減少，其主要區別在于本研究中的突變體其一級枝梗數較野生型也是顯著減少的，而突變體lax1-1的一級枝梗數相對于野生型是不變的或者差異不顯著，lax2-1的一次枝梗數反而是增加的，且二級枝梗上不著生小穗［10，26］。

2.2基因定位

通過觀察lax3/9311正反交和lax3/02428正反交F₁的穗部表型均為正常穗型，說明該突變體穗部性狀受隱性核基因控制；進一步分別統計lax3/9311和lax3/02428 F₂群體正常穗與稀穗的分離比例基本上是3 ∶1（表2），符合1對基因的遺傳規律，故此推斷本研究中突變體lax3的稀穗性狀受1對隱性核基因控制。

選取均勻分布在水稻12條染色體的160對SSR引物對親本02428與稀穗的DNA進行多態性分析，結果篩選出在lax3與02428之間具有多態性的引物68對，其多態性頻率為42.5%；進一步用lax3/02428的F₂分離群體構建的正常穗與稀穗近等基因池進行驗證，結果位于水稻第4染色體上的引物RM16335和RM16963仍然具有良好多態性，初步認為該基因位于水稻第4染色體上。

隨機選取lax3/02428 F₂群體的186個稀穗單株作為初級定位群體。在SSR引物RM16335與RM16963之間按照一定的間隔距離合成新的引物，驗證、選取新合成的在親本間和近等基因池間都具有多態性的引物進行初級定位群體的標記分析，進一步將lax3（t）基因定位在SSR標記RM16335和RM16424之間，各自的單交換單株數分別為5株和3株。隨后根據已測序水稻品種9311和日本晴在基因組DNA上堿基差異，重新設計一系列的InDel標記（表3），并選用lax3/02428 F₂群體的697個稀穗單株進行精細定位，最終將lax3（t）基因定位在InDel標記In4-8與SSR標記RM16349之間，二者在日本晴基因組上的物理距離約為96.9 kb（表3和圖2）。

3討論與結論

已經克隆的lax2基因雖然同樣被定位在水稻第4染色體上［10］，而且二者的農藝性狀也具有一定的相似性，但二者還是存在一定的性狀差異：lax2-1相對于野生型其一級枝梗數是增加的，lax3相對于野生型9311的一級枝梗數卻是顯著減少的；而且突變體lax2與野生型之間沒有堿基差異，只是在lax2預測基因啟動子的CpG島區域，其胞嘧啶的甲基化水平在突變體和野生型存在差異［11］，故要從核苷酸序列上很難確定lax3（t）是否是lax2的等位基因。

從前面lax3（t）基因的定位結果看（以日本晴基因組作為參考），lax3（t）被定位在水稻第4染色體短臂的1 808 228～1 905 169區域（表3），而lax2基因（19 564 239～19 566 320）位于第4染色體的長臂上，二者之間物理間隔約17.66 Mb，從這個意義上來講，lax3（t）不大可能是lax2的等位基因。另外，通過對突變體lax3基因組重測序發現，lax3（t） 基因與野生型9311在定位區間內存在堿基替換與插入的情況，如部分堿基替換發生在基因BGIOSGA015671的外顯子區域，通過堿基翻譯模擬發現，該堿基替換可能導致該基因的終止子缺失，從而產生比野生型基因更長的蛋白質鏈（另文報道），至于其功能與作用還有待于更進一步的研究。故此，本研究認為lax3（t）不是lax2的等位基因，而是水稻稀穗類型的一個新基因。

參考文獻：

［1］馬洪麗，溫嬋，呂巧香，等. 水稻稀穗突變體的遺傳分析及其基因的初步定位［J］. 分子植物育種，2016，14（8）：2106-2112.

［2］盧寰，時振英. 水稻穗發育的分子生物學研究進展［J］. 植物生理學報，2013，49（2）：111-121.

［3］淳雁，李學勇. 水稻穗型的遺傳調控研究進展［J］. 植物學報，2017，52（1）：19-29.

［4］董皓，李懿星，宋書峰，等. 水稻穗粒數相關基因研究進展［J］.分子植物育種，2021，19（18）：6045-6050.

［5］梁彥，王永紅. 水稻株型功能基因及其在育種上的應用［J］.生命科學，2016，28（10）：1156-1167

［6］吳迪，袁政，張大兵. 水稻小穗器官發生分子調控機制的研究進展［J］. 生命科學，2018，30（11）：1173-1183.

［7］Komatsu M，Maekawa M，Shimamoto K，et al. The LAX1 and FRIZZY PANICLE2 genes determine the inflorescence architecture of rice by controlling rachis-branch and spikelet development［J］. Developmental Biology，2001，231（2）：364-373.

［8］Komatsu K，Maekawa M，Ujiie S，et al.? LAX and SPA：Major regulators of shoot branching in rice［J］.? Proceedings of the National Academy of Sciences，2003，100（20）：11765-11770.

［9］Oikawa T，Kyozuka J. Two-Step Regulation of LAX PANICLE1 protein accumulation in axillary meristem formation in rice［J］. The Plant Cell，2009，21（4）：1095-1108.

［10］Tabuchi H，Zhang Y，Hattori S，et al.? LAX PANICLE2 of rice encodes a novel nuclear protein and regulates the formation of axillary meristems［J］. The Plant Cell，2011，23（9）：3276-3287.

［11］Zhang Z Y，Li J J，Yao G X，et al.? Fine mapping and cloning of the grain number Per-Panicle Gene （Gnp4） on chromosome 4 in rice （Oryza sativa L.）［J］.? Journal of Integrative Agriculture，2011，10（12）：1825-1833.

［12］Li X，Qian Q，Fu Z，et al. Control of tillering in rice［J］. Nature，2003，422：618-621.

［13］Tanaka W，Ohmori Y，Ushijima T，et al. Axillary meristem formation in rice requires the WUSCHEL ortholog TILLERS ABSENT1［J］. The Plant Cell，2015，27：1173-1184.

［14］Lu Z，Shao G，Xiong J，et al. MONOCULM 3，an ortholog of WUSCHEL in rice，is required for tiller bud formation［J］. Journal of Genetics and Genomics，2015，42：71-78.

［15］Chuck G，Muszynski M G，Kellogg E A，et al. The control of spikelet meristem identity by the branched silklessl gene in maize［J］. Science，2002，298：1238-1241.

［16］Komatsu M，Chujo A，Nagato Y，et al. FRlZZY PANICLE is required to prevent the formation of axillary meristems and to establish floral meristem identity in rice spikelets［J］. Development，2003，130：3841-3850.

［17］Zhu Q H，Hoque M S，Dennis E S，et al. Ds tagging of BRANCHED FLORETLESS 1 （BFL1） that mediates the transition from spikelet to floret meristem in rice （Oryza sativa L.）［J］. BMC Plant Biology，2003，3：6.

［18］Wang L M，Xie W B，Chen Y，et al. A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice［J］. Plant Journal，2010，61：752-766.

［19］Wang L，Sun S Y，Jin J Y，et al. Coordinated regulation of vegetative and reproductive branching in rice［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，2015，112：15504-15509.

［20］Zhu W W，Yang L，Wu D，et al. Rice SEPALLATA genes OsMADS5 and OsMADS34 cooperate to limit inflorescence branching by repressing the TERMINAL FLOWER1-like gene RCN4［J］. New Phytologist，2022，233（4）：1682-1700.

［21］Zhang Y，Yu H P，Liu J，et al.? Loss of function of OsMADS34 leads to large sterile lemma and low grain yield in rice （Oryza sativa L.）［J］.? Molecular Breeding，2016，36：147.

［22］Wu Y Z，Fu Y C，Zhao S S，et al. CLUSTERED PRIMARY BRANCH 1，a new allele of DWARF11，controls panicle architecture and seed size in rice［J］. Plant Biotechnology Journal，2015（14）：377-386.

［23］Wang B，Smith S M，Li J Y. Genetic regulation of shoot architecture［J］. Annual Review of Plant Biology，2018，69：437-468.

［24］袁隆平. 超級雜交稻研究［M］. 上海：上海科學技術出版社，2006：199-202

［25］申宗坦. 作物育種學實驗［M］. 北京：中國農業出版社，1992：112-114，127-128

［26］Futsuhara Y，Kondo S，Kitano H，et al. Genetical studies on dense and lax1 panicles in rice. Ⅰ. Character expression and mode of lax1 panicle rice［J］. Japan Journal of Breeding，1979，29：151-158.