環狀RNA在急性缺血性腦卒中的研究進展

王孟可綜述, 程門雪, 蘇志強審校

急性缺血性卒中(acute ischemic stroke,AIS)是由于大腦動脈閉塞、腦灌注不足、栓塞(心源性栓子脫落、動脈-動脈栓塞)等引起腦血流量減少導致腦功能迅速喪失的結果。其病理機制涉及炎癥反應、氧化應激、免疫反應、細胞凋亡和自噬等,造成腦部神經功能不可逆損傷;全球每年腦卒中發生將近1 500萬人,據調查每4個成年人中就有1人在一生中經歷過卒中,其中85%以上是AIS[1,2]。AIS具有極高的致死、致殘、復發率,嚴重危害人民健康,給社會及家庭造成了沉重的經濟負擔。目前AIS治療主要是靜脈溶栓和機械取栓,但受到許多因素的限制,特別是治療窗口狹窄以及再灌注損傷等原因導致臨床療效不盡人意,重要的是腦缺血損傷的機制尚不清楚,還需要進一步深入研究。

環狀RNA(circular RNA,CircRNA)是近年興起的一類以共價鍵形成閉環結構的內源性RNA分子,與線性RNA不同的是,它們不是通過RNA剪接的規范模式產生的。CircRNA分子通過獨特的反向剪接將3′和5′端連接在一起而環化,由于其沒有5′帽子結構和3′poly(A)尾巴的極性結構,不易被核糖核酸外切酶R(RibonucleaseR,RNaseR)所識別,能逃脫RNaseR的脫帽效應而不被水解,具有高度穩定性、組織表達特異性和生物進化保守性等特點。自2013年以miR-7海綿為功能的CircCDR1as的里程碑式[3]發現以來,CircRNA已經成為各國學者研究的課題,近十年來,CircRNA陸續在癌癥、心血管疾病、神經系統疾病中被發現,已發現它們可以作為miRNA海綿、蛋白質腳手架,甚至翻譯模板在基因表達調控、細胞通訊及蛋白翻譯等方面發揮重要生物學功能。

1 環狀RNA的簡介

1.1 CircRNA的分類與生物發生機制 CircRNA于1976年(見圖1)被最早發現[4],根據其是否保留內含子可分為:外顯子CircRNA、保留內含子的CircRNA和內含子CircRNA;自然界以外顯子CircRNA為主,其主要位于細胞質,另外兩種通常位于細胞核[5]。CircRNA有3種主要的生物發生機制:(1)套索驅動環化:mRNA前體剪接時,依賴反式作用因子發生外顯子跳讀事件,導致從剪接供體的3′端到剪接受體的5′端的共價剪接,形成含外顯子的套索結構,套索通過剪接體連接后去除內含子后成環。(2)內含子反向互補序列驅動環化:外顯子兩端的側翼內含子反向互補序列促使內含子序列配對,在空間上縮小了剪接供體與剪接受體的距離,使得下游的剪接供體與上游的剪接受體靠近結合形成CircRNA。(3)RNA結合蛋白(RNA binding protein,RBP)驅動環化:環化外顯子兩端的側翼內含子含有RBP識別的基序,RBP分別與兩翼內含子特異基序結合后形成二聚體,促進兩翼內含子互相靠近,進而連接成環[6]。

圖1 從HeLa細胞細胞質中提取的環狀RNA分子電鏡照片[4]

1.2 CircRNA的功能 (1)CircRNA富含miRNA結合位點,可作為miRNA海綿調節miRNA的活性和基因轉錄,大多數CircRNA可以作為競爭性內源性RNA(ceRNA)與mRNA競爭地結合miRNA,并與miRNA相互作用,解除miRNA對其下游靶mRNA的抑制,提高細胞中mRNA的表達水平[7]。(2)CircRNA與蛋白質相互作用:①CircRNA作為蛋白質的海綿或誘餌,間接影響疾病的進展[8];②CircRNA與特定的蛋白質相互作用并增強其功能;③CircRNA作為蛋白質支架促進酶及其底物的共定位,從而影響反應動力學;④將多蛋白復合體的成分招募到特定的位置或亞細胞區域以調節基因水平[9];⑤CircRNA在mRNA調控作用下與RBP結合并相互作用,從而調節蛋白質活性并改變mRNA的剪接模式[10]。(3)CircRNA直接編碼蛋白質,盡管CircRNA被認為是特殊類型的非編碼RNA,但研究表明一些CircRNA可以作為翻譯模板編碼蛋白質,這種翻譯機制被稱為帽非依賴性翻譯。CircRNA編碼蛋白質的3種主要翻譯模式包括:①依賴于內部核糖體進入位點(IRES)的CircRNA翻譯。②依賴于m6A內部核糖體進入位點(MIRES)的CircRNA翻譯。③CircRNA的滾動翻譯機制(RCA)[11]。

2 環狀RNA與AIS

CircRNA具有組織器官特異性并在神經系統顯著富集[12,13],其不僅參與人類大腦發育過程,并在AIS腦損傷中發揮重要作用。大量研究發現AIS會引起CircRNA的表達水平和功能顯著改變,調節CircRNA水平可以顯著改善腦損傷。AIS后腦細胞缺血缺氧,驅動炎癥反應和氧化應激,導致神經細胞壞死、凋亡以及血腦屏障破壞。當血腦屏障受損時,下調或者上調表達的CircRNA從大腦釋放到循環系統并在外周測量,從而使患者體內的CircRNA水平通過外周血液檢測到并用來判斷預后,幫助臨床醫生監測AIS患者的治療進展。本文將從神經細胞凋亡、自噬、血管生成、人腦微血管內皮細胞(human brain microvascular endothelial cell,HBMEC)凋亡與神經元可塑性5個方面來討論CircRNA在AIS中的作用機制。

2.1 CircRNA與神經細胞凋亡 凋亡又稱為程序性細胞死亡,是細胞死亡的一種形式,即在一定的生理或病理條件下,機體為維護內環境的穩定,遵循自身程序,通過一定的信號傳導途徑,激活DNA內切酶,使細胞主動死亡的過程,細胞凋亡是缺血性卒中后神經元丟失的重要機制[13]。研究發現,體外腦缺血再灌注(Oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)處理的小鼠海馬神經元細胞HT22和體內大腦中動脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)小鼠中,CircCDC14A的表達顯著上調;敲低CircCDC14A可提高細胞存活率,抑制OGD/R引起的細胞活力降低、細胞損傷和細胞凋亡以及MCAO誘導的腦梗死、腦組織損傷;CircCDC14A作為miR-23a-3p的海綿,通過負性調節miR-23a-3p促進趨化因子基質細胞衍生因子CXCL12的表達而促進神經元缺血再灌注損傷[14]。在OGD誘導的HT22細胞和MCAO小鼠模型中,Circ-HECTD1顯著上調,敲低Circ-HECTD1可上調miR-133b,抑制miR-133b靶基因腫瘤壞死因子受體作用因子3(TRAF3)表達,體外緩解了OGD引起的神經細胞凋亡,體內減少了MCAO小鼠的腦梗死體積[15]。在MACO模型小鼠中,CircUCK2水平上調顯著減少梗死體積和神經元損傷,改善神經功能缺損;CircUCK2作為miR-125b-5p分子的海綿,吸引結合并抑制miR-125b-5p分子的功能,使小鼠腦組織生長分化因子11(GDF11)表達顯著增加,從而減少氧葡萄糖剝奪(OGD)誘導的細胞凋亡;過表達CircUCK2通過調節miR-125b-5p/GDF11表達激活下游TGF信號通路,從而提高神經細胞存活率,減輕神經元損傷,從而發揮神經保護功能[16]。在AIS患者血液標本和OGD處理的HCN-2細胞模型中,Circ_0007290的表達顯著增加,Circ_0007290作為海綿結合miR-496,從而解除對其靶基因PDCD_4的抑制,敲低Circ_0007290可減輕神經細胞凋亡[17]。Circ-0012397通過海綿miR-200a-3p調控Corin表達,高表達水平的Corin通過下調裂解的半胱天冬酶-5、BCL-3相關死亡啟動子、細胞外調節蛋白激酶(ERK)和蛋白2的表達,增強了OGD誘導的SHSY38Y神經母細胞瘤細胞增殖并抑制凋亡[18]。

2.2 CircRNA與神經細胞自噬 自噬是真核細胞的一個維持自我穩定的生物學過程。在缺血性卒中過程中,神經細胞自噬狀態的激活可以消除細胞中功能失調的蛋白質,從而使神經細胞活性增加。而自噬的作用具有兩面性,適度的自噬雖可以保持神經細胞活性,但如果神經細胞一直保持在高水平的自噬,則會導致神經細胞死亡[13]。CircRNA被證實廣泛參與AIS的神經元自噬調節,且多發揮積極作用,多種CircRNA被發現可作為分子海綿顯著縮小腦梗死面積,減輕神經元損傷,抑制星形膠質細胞的激活和自噬。在MCAO小鼠的星形膠質細胞和腦組織中,Circ_0025984作為miR-143-3p的海綿直接靶向TET1并降低其表達,Circ_0025984治療顯著降低MCAO小鼠的星形膠質細胞自噬、腦損傷和神經元丟失[19]。在AIS血漿樣本和MCAO模型小鼠腦組織中,CircCDC14A和CircHECTD1顯著增加;體內、外,通過敲低CircCDC14A和CircHECTD1基因,抑制星形膠質細胞的激活和自噬,可顯著縮小腦梗死面積和神經元損傷;CircHECTD1/miR-142軸通過調節下游的TIPARP來促進星形膠質細胞的激活和自噬[20,21]。CircCELF1在OGD/R誘導的星形膠質細胞中上調,敲低CircCELF1可抑制星形膠質細胞自噬。使用tMCAO模型進行的體內研究還顯示,CircCELF1下調有助于抑制神經損傷[22]。

2.3 CircRNA與神經血管生成 血腦屏障(BBB)是維持腦內的動態平衡、保護大腦的獨特屏障。人腦微血管內皮細胞(HBMEC)是BBB的最主要構成部分。在AIS中,血腦屏障的結構以及完整性破壞,導致腦損傷和有害物質進入大腦。作為構成BBB的重要組成部分,HBMEC在AIS中發揮著重要功能。經OGD/R處理后,HBMEC的存活、遷移和血管生成減少,釋放炎癥因子,導致細胞死亡和凋亡,誘導內皮細胞間充質轉化(endothelial mesenchymal transformation,EndoMT),破壞血腦屏障的完整性。血管生成是缺血性腦損傷的關鍵修復機制,有助于功能恢復。增強的血管生成可以觸發軸突生長,這是促進神經元重塑的方法之一,環狀RNA是參與血管生成的重要調節因子[23]。研究證實,在AIS患者外周血和OGD處理的HBMEC中,CircFunc1的表達增加;敲低CircFundc1基因,miR-375抑制解除,減輕了OGD誘導的細胞凋亡,促進了OGD阻斷的HBMEC的細胞活力、遷移和血管生成,然而PTEN的過表達消除了miR-375的恢復作用;CircFundc1基因敲低通過豐富miR-375和抑制PTEN來減輕OGD誘導的細胞損傷[24]。AIS患者外周血中CircPHKA2表達下調,體外OGD模型中,CircPHKA2通過結合、抑制miR-574-5p從而上調SOD2的表達來保護HBMEC免受腦缺血后糖氧剝奪導致的損傷,過表達CircPHKA2促使OGD后HBMEC增殖、遷移和新生血管形成[25]。Circ_0006768通過抑制miR-222-3p上調VEZF3減弱OGD/R對細胞活力、遷移和血管生成的抑制作用,減輕OGD/R導致的HBMEC損傷[26]。

2.4 CircRNA與HBMEC凋亡 缺血缺氧條件下可導致強烈的氧化應激,產生大量自由基以及氧化中間產物,HBMEC是其攻擊的主要目標,HBMEC是構成BBB的重要結構,作為腦組織與外周循環之間的屏障,HBMEC完整性對維持腦部的穩態至關重要,HBMEC損傷則進一步驅動腦部炎癥反應和氧化應激,導致壞死和細胞凋亡[27]。通過調節CircRNA表達抑制HBMEC細胞凋亡、改善神經功能對于未來AIS治療具有潛在研究價值。Circ-Memo1沉默通過調節miR-17-5p/SOS1軸抑制ERK/NF-κB信號通路,減輕HBMEC細胞的缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)損傷、提高HBMEC細胞存活率、抑制HBMEC凋亡[28]。ACVR2B是miR-18a-5p的直接靶標,Circ_0000566作為miR-18a-5p海綿,通過調節miR-18a-5p/ACVR2B軸,促進OGD/R誘導的HBMEC損傷[29]。沉默Circ_0010729可上調miR-5,從而抑制靶基因ING665表達,促進OGD/R誘導的HBMEC細胞增殖并抑制凋亡[30]。下調Circ_0006459通過miR-940/FOXJ2途徑保護HBMEC免受OGD引起的損傷,減少HBMEC凋亡[31]。

2.5 CircRNA與神經元可塑性 CircRNA通過增強短期或長期的神經元可塑性可以顯著改善疾病發生發展。小鼠缺血腦組織和AIS患者外周血漿中的CircSCMH1顯著降低;卒中后注射外泌體CircSCMH1可明顯促進小鼠和猴子神經功能恢復;CircSCMH1進入細胞核,與轉錄因子MeCP2機械結合,解除了對MeCP2下游靶基因(mobP、IGFBP3、Fxyd1、Prodh)轉錄的抑制,增強了神經元的可塑性,抑制了膠質細胞的激活和外周免疫細胞的侵襲,從而促進AIS的功能恢復[32]。而Yu等也通過生物信息學中基因本體(GO)和京都基因組百科全書(KEGG)分析研究中發現CircARHGAP3和CircLPHN為神經元突觸可塑性調節的關鍵CircRNA[33]。

3 小結與展望

隨著近十年來CircRNA的相關報道不斷增加,人們對CircRNA的了解也不斷深入,既往研究雖未能對CircRNA在AIS發生發展中的作用機制進行統一表征和權威論證,但文中提及的研究確實可作為有力的經驗證據證明CircRNA參與了AIS病因發生及病理變化等過程,并在其中起重要作用,甚至證明CircRNA可作為腦梗死潛在診斷生物標志物和腦血管保護的新型治療靶標。但是目前大部分數據是從細胞和動物水平得到,從理論過渡到試驗再到臨床診療方式的推廣仍然需要一個漫長的過程。CircRNA在AIS發生發展過程中的作用及其對AIS臨床診斷和治療方面的潛在作用仍需要開展大量深入研究。