大豆GmGRAS69基因過表達增強擬南芥的耐旱性

張 斌

(湖南科技學院 化學與生物工程學院,湖南省銀杏工程技術研究中心,湖南 永州 425199)

植物作為固著生物,在其整個生命周期經常會受到不利的環境因素影響,如鹽、干旱等都能影響植物正常發育過程,嚴重時則導致作物減產或絕產。為了適應不利的生存條件,在不斷地自然選擇和進化過程中,植物形成了多種策略提高自身對環境的適應能力。植物對環境脅迫適應的調控機制主要是通過激活或抑制脅迫響應途徑中的基因表達來實現的[1]。已有研究指出,多種轉錄因子家族成員在脅迫響應基因的表達調控方面發揮功能,從而調節植物對不利環境的適應能力[2]。如WRKY、AP2/ERF、MYB、NAC、bZIP和GRAS等家族成員在植物對鹽、干旱等脅迫中的功能和分子機制已被報道[3-5]。

GRAS是植物中特有的轉錄因子家族,至今在其他物種中未見有關該家族成員的報道。通常GRAS蛋白的C端高度保守,被稱為GRAS結構域,該保守結構域由SAW、RVER、PFYRE、V/IHIID等基序組成。到目前為止,已有多種植物GRAS家族成員被鑒定出來,如擬南芥(Arabidopsisthaliana)[6]、水稻(Oryzasativa)[6]、煙草(Nicotianatabacum)[7]、玉米(Zeamays)[8]、胡楊(Populuseuphratica)[9]、甘薯(Ipomoeatrifida)[10]、棉花(Gossypiumhirsutum)[11]和大豆(Glycinemax)[12]等。研究顯示,GRAS基因在信號轉導、腋生分生組織發育和根細胞伸長調節等過程發揮重要功能[13-14]。GRAS基因正調控植物對生物和非生物脅迫的耐受功能也已被報道,如番茄SlGRAS6沉默的植株表現出更高的抗病能力,而過表達SlGRAS40基因的轉基因番茄植株則表現出對鹽和干旱脅迫更強的耐受性[15]。結縷草(ZoysiajaponicaSteud.)GRAS家族成員ZjCIGR1,其表達水平在冷凍脅迫下顯著上升,其過表達可增強轉基因材料耐冷性[16]。山葡萄(Vitisamurensis)GRAS家族基因VaPAT1在擬南芥中異源表達可增強AtSIZ1、AtCBF1、AtATR1/MYB34、AtMYC2、AtCOR15A、AtRD29A和AtRD29B等逆境相關基因的表達;在寒冷、干旱和鹽脅迫下,過表達株系通過積累較高水平的脯氨酸和可溶性糖含量增強脅迫耐受性[17]。Yang等[18]在甘藍型油菜中鑒定到一個GRAS家族LAS亞族基因BnLAS,該基因過表達可通過激活蠟質合成相關基因(CER1、CER2、KCS1和KCS2)的表達,增加蠟質在蓮座葉表皮的積累,進而賦予轉基因擬南芥更強的耐旱能力。白菜型油菜GRAS家族基因BrLAS也具有類似的功能,其過表達擬南芥植株的發育受到抑制,如抽薹和開花時間延遲、育性降低和衰老延遲等;干旱脅迫下,BrLAS可通過增強擬南芥SOD、POD、CAT2和APX等基因表達水平,提高抗氧化酶活性,清除過量的ROS,最終使過表達植株表現出更強的耐旱性[19]。Ma等[20]研究發現,干旱和鹽處理能夠導致楊樹PeSCL7基因(屬于GRAS家族)的表達水平顯著上調,同時過表達PeSCL7基因的擬南芥耐旱和耐鹽性均明顯增強。而Wang等[2]發現大豆GmGRAS37基因的表達水平在干旱和鹽脅迫處理下顯著上調,過表達GmGRAS37的大豆毛狀根對干旱和鹽脅迫的抗性明顯增強,且非生物脅迫相關的基因(GmDREB1、GmNCED3、GmCLC1、GmSOS1、GmSOD1和GmSOD2)的表達水平較EV植株顯著上調。大豆是一種原產于中國的重要豆科植物,為人類生產生活提供大量的蛋白質和植物油,也是動物飼料的主要原材料,但其生長和產量易受到干旱脅迫影響。探究大豆耐旱的機理,尋求調控耐旱的關鍵基因對增強大豆抗旱性至關重要。前期研究中,在栽培大豆中鑒定到78個GRAS家族成員;通過轉錄組測序和熒光定量PCR檢測,發現大豆GmGRAS14、GmGRAS33和GmGRAS69的相對表達水平在鹽處理后顯著增加[12]。本研究發現,GmGRAS69的表達水平受干旱誘導上調,過表達GmGRAS69的轉基因擬南芥的耐旱性明顯增強,這些結果可為解析大豆耐旱機理和培育耐旱品種提供理論支持和重要的候選基因。

1 材料和方法

1.1 序列多重比對和系統進化樹構建

使用氨基酸序列構建不同植物GRAS家族成員的系統進化樹。首先將所需的GRAS成員氨基酸序列整理成FASTA格式,然后利用多序列比對分析軟件(Clustal X)進行多重比對[21],保存比對結果。使用MAGA-X軟件再次分析氨基酸多重比對結果,然后基于鄰接法和泊松模型構建不同植物GRAS家族成員的進化樹[22]。

1.2 植物材料培養和干旱處理

本研究使用的植物材料包括栽培大豆Williams 82和擬南芥(Col-0)。將大豆和擬南芥種子直接播種于營養土和蛭石混合(1∶1)基質中,用Hoagland營養液澆灌,在植物培養室生長,培養室條件:長日照(16 h晝/8 h夜),溫度22～25 ℃,空氣濕度60%～70%。用30%的PEG溶液模擬干旱條件,處理生長14 d的大豆幼苗,分別在0,1,3,6,9,12 h取大豆的根和葉,用于RNA提取和基因表達水平檢測,每種處理均包含3個獨立的生物重復樣品。

1.3 總RNA提取和熒光定量PCR檢測

為了檢測大豆GmGRAS69基因是否參與干旱脅迫響應,研究使用30% PEG溶液模擬干旱條件處理大豆植株,分別檢測基因在根和葉中的表達水平變化。使用液氮將植物組織磨成粉末,然后提取總RNA,并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取質量,同時測定RNA濃度。取2 μg RNA使用反轉錄試劑盒(ThermoFisher scientific,美國)獲得cDNA第1條鏈作為PCR模板。使用實時熒光定量PCR儀(CFX96,Bio-Rad,美國)進行基因表達量檢測。熒光定量PCR體系包括10 μL 2×SYBR Green Mix,定量PCR引物(10 μmol/L)1.0 μL,cDNA模板(10 mg/μL)1.0 μL,加入超純水至總體積20 μL。PCR儀程序設置為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性20 s,60 ℃退火和延伸30 s(40個循環)。以大豆UBI3和擬南芥ACT基因作為內參基因,利用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。本研究使用的定量PCR引物序列見表1。

表1 用于熒光定量PCR試驗的引物序列Tab.1 Primer sequences for Real-time quantitative PCR experiments

1.4 大豆GmGRAS69基因過表達載體構建和擬南芥遺傳轉化

以大豆cDNA為模板,使用高保真DNA聚合酶克隆GmGRAS69基因的CDS片段,用T4DNA連接酶將克隆得到的片段連至雙元表達載體pFGC5941的35S啟動子下游。利用根癌農桿菌介導的浸花法轉化野生型擬南芥[23],將收獲T0種子播種,噴灑草銨膦篩選抗性植株。此外,使用CTAB法提取葉片總DNA用于轉基因擬南芥PCR鑒定,提取RNA進行半定量PCR檢測外源基因是否成功高表達,選取外源基因高表達的株系,篩選到T3、獲得純合材料用于后續試驗。

1.5 轉基因擬南芥耐干旱分析

野生型擬南芥和過表達株系(T3)的種子經75%乙醇表面消毒后,均勻播種于濕潤的營養土和蛭石混合(1∶1)基質上,在4 ℃冷藏箱放置3 d后轉移至植物培養室。14 d后取大小一致的擬南芥用于干旱處理,首先將培養擬南芥的基質吸水飽和,然后停止供水,使其自然干旱,觀察野生型和過表達株系的表型變化。測定葉片相對含水量時取葉片稱質量即鮮質量(Fresh weight,FW);將葉片浸沒在去離子水中,放置在4 ℃冷藏箱12 h,擦干表面水后再次稱質量即吸水后的總質量(Total weight,TW);將葉片在75 ℃烘箱烘干,再稱質量即干質量(Dry weight,DW);葉片相對含水量=(FW-DW)/(TW-DW)×100%[24]。葉片可溶性糖含量的測定參考Yuan等[17]描述的方法。SOD、POD和CAT活性參考Li等[19]描述的方法測定,利用熒光定量PCR檢測對應的SOD、POD和CAT基因在野生型和過表達植株中的表達水平,方法同前述,引物序列見表1。其中,測定鮮質量、葉片相對含水量和可溶性糖含量時均取6個生物重復樣品進行試驗;SOD、POD和CAT活性及對應的基因表達水平測定時均取3個生物重復樣品。

2 結果與分析

2.1 大豆GmGRAS69的結構域和系統進化分析

根據已有報道,本研究整理了植物中參與植物干旱脅迫調控的GRAS家族成員的氨基酸序列,包括大豆GmGRAS37[2]、水稻OsGRAS23[25]、番茄SlGRAS40[15]、山葡萄VaPAT1[17]、白菜型油菜BrLAS[19]、紫花苜蓿MsGRAS51[26]和楊樹PeSCL7[20]與GmGRAS69進行序列多重比對。結果顯示,C端氨基酸非常保守、相似度很高,其包含高度保守的IHIID、PFYRE、RVER和SAW基序(圖1-A)。根據這些氨基酸序列構建進化樹,顯示大豆GmGRAS69和MsGRAS51、GmGRAS37、VaPAT1具有較近的進化關系(圖1-B)。前期已有報道指出GmGRAS37和VaPAT1在干旱脅迫響應中發揮正調控作用,因此,推測大豆GmGRAS69可能具有類似的功能。

A.大豆GmGRAS69和其他GRAS蛋白的氨基酸序列比對;B.GRAS家族的系統進化樹。A.Amino acid sequence alignment of soybean GmGRAS69 and other GRAS proteins;B.Phylogenetic tree of the GRAS family.

2.2 干旱處理下GmGRAS69基因表達變化

熒光定量PCR結果顯示,GmGRAS69基因的表達水平在大豆根和葉中均受PEG誘導上調;PEG處理6 h,在葉中的表達水平達到最高(上調約3.4倍),然后逐漸下降,在12 h與對照(0 h)無顯著差異(圖2)。GmGRAS69基因的表達水平在根中受PEG誘導上調更顯著;處理3 h上調約5.5倍,隨后表達水平逐漸下降,但12 h仍顯著高于0 h(圖2)。這一結果說明GmGRAS69基因能夠響應干旱脅迫,導致表達水平發生改變。

不同小寫字母表示差異顯著。圖4—5同。Different lowercase letters indicate significant difference.The same as Fig.4—5.

2.3 GmGRAS69基因過表達擬南芥轉化和鑒定

本研究克隆了大豆GmGRAS69基因的CDS序列,片段長度為1 638 bp(圖3-A);回收片段后插入植物表達載體pFGC5941,再利用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切驗證片段成功插入目的位點(圖3-B),最終獲得構建成功的重組載體(圖3-C)。利用根癌農桿菌介導的浸花轉化法將重組載體轉化野生型擬南芥,利用草銨膦篩選T0抗性植株(即對草銨膦有抗性、葉片呈綠色且可正常生長的幼苗)(圖3-D)。進一步進行PCR驗證顯示,編號1,2,3,5號植株都能擴出目的條帶,說明這些植株為轉基因材料(圖3-E)。進一步提取RNA檢測基因表達水平,顯示野生型材料中未檢測到GmGRAS69基因的表達;轉基因植株#1、#2和#3中外源基因GmGRAS69則能夠表達(圖3-F),說明成功獲得GmGRAS69基因過表達株系,這些株系可用于下一步功能分析。

A.GmGRAS69基因CDS片段克隆;B.重組載體酶切驗證;C.過表達載體示意圖;D.抗草銨膦的擬南芥植株篩選;E.轉基因擬南芥PCR鑒定;F.GmGRAS69基因異源表達的半定量PCR檢測。A.Cloning of CDS fragment of GmGRAS69;B.Enzyme digestion verification of recombinant vector;C.Schematic diagram of overexpression vector;D.Screening of Arabidopsis plants resistant to glufosinate;E.PCR identification of transgenic Arabidopsis;F.Semi-quantitative PCR detection of heterologous expression of GmGRAS69.

2.4 GmGRAS69基因過表達擬南芥耐旱性分析

選取2個過表達株系(OE#1和OE#2)純合植株(T3)進行耐旱性分析。野生型和過表達植株正常培養14 d后,分成對照組和干旱處理組,其中對照組營養基質吸水飽和后仍正常澆水,處理組營養基質吸水飽和后停止供水。處理14 d后,發現對照組植株長勢正常,植株大小和單株鮮質量無顯著差異;而處理組植株生長雖然都受到了抑制、葉片失綠,但是WT受抑制更嚴重,其蓮座葉萎蔫,單株鮮質量顯著低于過表達株系OE#1和OE#2(圖4-A、B)。干旱處理后,擬南芥WT、OE#1和OE#2植株葉片相對含水量都顯著下降,但是,在OE#1和OE#2植株中顯著高于WT;干旱處理導致葉片中可溶性糖含量顯著上升,在過表達植株中的積累量比WT更高(圖4-C、D)。這些植株生長表型和生理指標表明大豆GmGRAS69基因異源表達增強了擬南芥的耐旱性。

圖4 GmGRAS69基因過表達擬南芥的耐旱性分析Fig.4 Analysis of drought tolerance of Arabidopsis overexpressing GmGRAS69

2.5 GmGRAS69基因過表達植株中抗氧化途徑被激活

為了探究GmGRAS69基因調控植物耐旱的可能機理,測定擬南芥葉中SOD、POD和CAT活性。結果顯示,正常生長的擬南芥WT和過表達植株中的酶活性無顯著差異;干旱處理后,野生型WT和過表達植株的SOD、POD和CAT活性均顯著增強,且在過表達植株中顯著高于WT(圖5)。檢測對應的SOD、POD和CAT基因表達水平,發現干旱處理后3個基因在擬南芥WT和過表達植株(OE#1和OE#2)中的表達水平都顯著上調,并且在OE#1和OE#2植株中上調倍數顯著高于WT(圖5)。說明GmGRAS69可以通過上調抗氧化酶編碼基因的表達、增強抗氧化酶的活性賦予轉基因擬南芥更強的耐旱性。

圖5 GmGRAS69基因過表達對抗氧化酶活性和抗氧化酶基因表達水平的影響Fig.5 Effects of overexpression of GmGRAS69 on antioxidant enzyme activity and expression level of antioxidant enzyme genes

3 結論與討論

研究表明,植物GRAS蛋白,如大豆GmGRAS37、山葡萄VaPAT1、白菜型油菜BrLAS、楊樹PeSCL7等在植物干旱脅迫響應過程發揮重要作用[2,17,19-20]。本研究通過氨基酸結構分析表明,大豆GmGRAS69蛋白與上述蛋白在C端具有共同的保守結構域。對基因家族或同源基因進行系統進化分析時,一般認為屬于同一亞家族或同一進化分支的基因同源性較高、可能具有類似的生物學功能[10]。本研究中構建的系統進化樹顯示GmGRAS69與MsGRAS51、GmGRAS37、VaPAT1具有更近的進化關系,表明其在大豆干旱脅迫響應和適應過程也發揮特定功能。前期研究表明,GmGRAS69基因在大豆根中受鹽脅迫誘導表達上調[12]。本研究顯示PEG處理的大豆根和葉中GmGRAS69基因的表達水平都顯著上調,且在根中上調倍數更高,這種干旱誘導的表達特性可能與其對干旱脅迫的適應有關。為了探究GmGRAS69參與植物耐旱的功能,獲得了GmGRAS69基因過表達擬南芥植株。有研究顯示,外源基因的表達會對抑制轉基因擬南芥的正常生長、延緩發育過程[19]。比較正常培育和干旱處理后的擬南芥野生型WT和GmGRAS69過表達株系(OE#1和OE#2)生長表型發現,正常條件下過表達植株和WT的表型無顯著差異,說明大豆基因的異源表達未對擬南芥的生長發育產生不利影響;而在干旱處理后,所有植株均表現為生長受到抑制,葉片失氯、萎蔫,但是過表達植株的長勢明顯由于WT,主要體現在單株鮮質量和葉片相對含水量均顯著高于WT,說明GmGRAS69基因過表達增強了轉基因擬南芥的耐旱性。可溶性糖是一種十分重要的滲透調節物質,多種非生物脅迫(干旱、鹽、冷脅迫等)都會導致植物體內的可溶性糖含量變化;一般認為脅迫條件下可溶性糖含量積累越多,植物抗逆性越強[17]。干旱脅迫下,WT和過表達植株中的可溶性糖含量都顯著增加,但是過表達植株中的可溶性糖含量顯著高于WT;因此,相比于WT,OE#1和OE#2植株受到的傷害減輕,長勢優于WT。干旱脅迫能夠直接引起氧化損傷,植物中的ROS清除酶(包括SOD、POD、CAT、APX和GST)能夠減輕氧化損傷,增強植物的耐旱性[20,27]。為了進一步解析GmGRAS69參與耐旱的分子機制和調控途徑,測定了正常培育和干旱處理的WT和過表達植株中SOD、POD和CAT活性,發現干旱處理的所有植株中上述酶活性均顯著增強,而在過表達植株中顯著高于WT。檢測擬南芥葉中SOD、POD和CAT對應編碼基因的表達水平發現,干旱脅迫下過表達植株中的SOD、POD和CAT基因表達水平也顯著高于WT。以上結果說明,大豆GmGRAS69蛋白可以通過激活抗氧化途徑,增強抗氧化酶活性,清除干旱脅迫導致的ROS,以緩解對植物的損傷。類似的,已有研究證明白菜型油菜GRAS家族成員BrLAS也可以通過增強SOD、POD和CAT活性、清除干旱脅迫下過量積累的ROS,提高對應的SOD、POD和CAT2基因的表達水平,增強BrLAS基因過表達擬南芥的耐旱性[19]。本研究從大豆GRAS家族中篩選到一個受干旱誘導的成員GmGRAS69,通過序列比對和進化分析以及對轉基因擬南芥的表型分析,初步證明了GmGRAS69通過抗氧化途徑和增加滲透調節物質可溶性糖的積累,增強轉基因植株的耐旱性。但是轉錄因子GmGRAS69是如何參與調控抗氧化酶的活性,通過哪種機制調控下游基因的表達,這是一個復雜的調控過程,值得進一步探究,也是接下來的研究方向。