不同規格鱟試劑對人血白蛋白熱原進行檢測的對比分析

佘姣姣，張寶獻，龔志明，何小鋒，劉澤彬，高 語，譚 娜，劉 利，楊 柳

（華蘭生物工程重慶有限公司，重慶 408100）

熱原是人血白蛋白質量檢測的重點項目之一。在人血白蛋白的整個生產過程中，包括采漿融漿、分離純化、超濾濃縮、制備原液、稀配半成品和分裝成品等生產環節。其中越接近最終成品的環節越容易引入細菌內毒素，可以直接進入成品的成分、分裝成品的內包材和環境為檢查重點。制備半成品所使用的原液、制備原液前相關環節（如純化環節、超濾環節）的取樣、原輔料（如稀配成品的溶液、穩定劑）、半成品和分裝用的內包材均為重點檢測樣品。目前，各生產單位多以細菌內毒素檢查法對人血白蛋白進行熱原檢查。由于鱟試劑的特異性，相關人血白蛋白生產過程pH 值的變化較大，這可能對內毒素的檢測造成影響，從而引起假陰性；鱟試劑靈敏度改變、檢查用水中內毒素含量超標、反應條件（空氣流動性、pH）及內毒素工作標準品的穩定性差均可影響檢測結果；人血白蛋白中組成成分極其復雜，任何離子干擾（Fe3+、Al3+等離子）或非內毒素的鱟反應等都可能造成假陽性[1-2]。目前，中國藥典中并沒有針對細菌內毒素檢查法假陰性和假陽性問題的有效解決方案，只能在實驗中采用適當的方法消除或減少假陰性和假陽性的出現。有研究指出，可通過對供試品進行更大倍數的稀釋或通過過濾、中和、透析、加熱處理等方法排除相關干擾。本文以《中國藥典》（四部）2020 年版（以下簡稱《中國藥典》）通則中的“1143 細菌內毒素檢查法”“9251細菌內毒素檢查法”為指導原則，采用凝膠法對人血白蛋白熱原檢測所需的鱟試劑生產廠家、靈敏度，供試品稀釋倍數進行選擇，旨在為建立該品種的細菌內毒素檢查法提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

CU-600 型電熱恒溫水槽( 武漢恒豐中欣生物有限公司)；T246 型漩渦混合儀振蕩器( 上海瀚默機電科技有限公司)；SFG-02B 型電熱恒溫鼓風干燥箱( 湖北恒豐醫療制藥設備有限公司) ；其他器皿包括試管、移液器及移液器配套的槍頭(無熱原) 等。

1.2 藥品與試劑

人血白蛋白〔Human Albumin；批號202008056，規格：10 g/ 瓶（10 g/L，50 mL）；批號202008058，規格：10 g/ 瓶（10 g/L，50 mL）；批號202008059，規格：10 g/ 瓶（10 g/L，50 mL）；批號202008057，規格：5 g/ 瓶（5 g/L，50 mL）；批號202008060，規格：5 g/ 瓶（5 g/L，50 mL）；批號202008063，規格：5 g/ 瓶（5 g/L，50 mL）〕；鱟試劑(A 廠家，0.03 EU·mL-1、批號2006122，0.06 EU·mL-1、批號2002213/2009093/2012243，0.125 EU·mL-1、批號2005062，0.25 EU·mL-1、批號2003112，規格0.1 mL/支；B 廠家，0.03 EU·mL-1、批號20081029，0.06 EU·mL-1、批號20051022，0.125 EU·mL-1、批號20091032，0.25 EU·mL-1、批號20081030，規格0.1 mL/ 支) ；細菌內毒素工作標準品(A 廠家，批號1912102，規格10 EU/支)；細菌內毒素檢查用水(Water for Bacterial Endotoxins Test，以下簡稱BET 水，A 廠家，批號1906270，規格5 mL/ 支)。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核

A、B 兩個廠家分別取4 批鱟試劑靈敏度的標示值(λ)，將細菌內毒素工作標準品用BET 水溶解，置漩渦混合器上混勻5 min，然后制成濃度為2 λ、1 λ、0.5 λ 和0.25 λ 四個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在漩渦混合器上混合30 s。取不同濃度的內毒素標準溶液，分別與等體積（0.1 mL）的鱟試劑溶液混合，每一個內毒素濃度平行做4 管；另外取2管加入等體積的BET 水作為陰性對照。按《中國藥典》通則中“1143 細菌內毒素檢查法”復核本試驗所用鱟試劑的靈敏度，結果兩個廠家各4 批鱟試劑靈敏度的測定值(λc)均在0.5 ～2.0 λ 范圍內，符合《中國藥典》中的規定，可用于細菌內毒素檢查，詳見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果匯總

2.2 確定供試品最大有效稀釋倍數

我司主要在產的人血白蛋白的規格分別為蛋白質濃度5 g/L、10 g/L，《中國藥典》（三部）2020 年版人血白蛋白檢定規程中規定其細菌內毒素限值（L）應分別小于0.83 EU/mL、1.67 EU/mL。按《中國藥典》2020 年版通則中的“1143 細菌內毒素檢查法”的規定，MVD=cL/λ，計算各靈敏度鱟試劑對應的樣品最大有效稀釋倍數(Maximum Valid Dilution，MVD) ：MVD0.03=27(5 g/L)、MVD0.03=55(10 g/L)、MVD0.06=13(5 g/L)、MVD0.06=27(10 g/L)、MVD0.125=6(5 g/L)、MVD0.125=13(10 g/L)、MVD0.25=3(5 g/L)、MVD0.25=6(10 g/L)；在不超過對應MVD 的稀釋倍數下進行細菌內毒素檢查。

2.3 干擾試驗

采用A 廠家和B 廠家兩個廠家的鱟試劑，4 種靈敏度（0.03 EU/mL、0.06 EU/mL、0.125 EU/mL、0.25 EU/mL）對5 g/L 和10 g/L 人血白蛋白待包裝產品各3批進行干擾試驗確認。5 g/L 的產品加BET 水分別稀釋至初始濃度的1、6、13、27 倍備用；10 g/L 的產品加BET 水分別稀釋至初始濃度的2、13、27、55 倍備用。以相應供試品溶液作稀釋用液將細菌內毒素標準品逐步配制成干擾試驗系列溶液：2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ；將細菌內毒素標準品用BET 水逐步配制成鱟試劑標示靈敏度對照系列溶液：2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ。按細菌內毒素檢查法進行干擾試驗，結果見表2。

表2 人血白蛋白鱟試劑干擾試驗結果

由表2 可知，靈敏度為0.06 EU/mL 的鱟試劑用于檢測人血白蛋白熱原的效果最佳，具有高靈敏度、少稀釋的優勢。試驗結果表明，人血白蛋白對鱟試劑多表現為陰性干擾，即常出現假陰性，這可能與人血白蛋白中含有螯合劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑等有關。另外，不同規格人血白蛋白的干擾物質有差異。

2.4 中間產品細菌內毒素檢查

我司人血白蛋白的生產工藝流程是：由融漿經分離純化、超濾濃縮等步驟制備原液，再由原液加穩定劑及稀釋液等稀配成半成品，再將經巴氏滅活的半成品分裝為待包裝產品。生產過程中超濾等步驟可有效控制熱原含量。有研究指出，巴氏滅活也可一定程度降低熱原含量[3]。因此，理論上人血白蛋白待包裝產品的熱原含量最低。取5 g/L、10 g/L 人血白蛋白半成品、原液、待包裝產品為供試品，使用靈敏度λ 為0.06 EU·mL-1的鱟試劑，按所建立方法進行細菌內毒素檢查，結果見表3、表4。

表3 5 g/L 中間產品細菌內毒素檢查結果

表4 10 g/L 中間產品細菌內毒素檢查結果

結果表明，待包裝產品的熱原含量最低，原液與半成品的熱原含量無必然關系。這是由于生產過程中原液經超濾濃縮濾去了熱原物質，但在配制半成品的過程中有添加輔料，存在引入熱原物質的風險。因此，試驗結果與生產實際相符。

3 討論

由于人血白蛋白生產過程需要加入多種穩定劑和稀釋液，因此其組成成分極為復雜。大分子量血漿蛋白的疏水基團結合脂多糖影響內毒素活性、含有絲氨酸蛋白酶、Fe3+、Al3+等的干擾[4-5]以及非內毒素的鱟反應均可能造成檢測結果的假陽性和假陰性，本文在盡可能少處理樣品的前提下，選出了適宜規格的鱟試劑及供試品稀釋方法。本次試驗結果表明，在對供試品作最少處理的前提下，選用靈敏度λ 為0.06 EU·mL-1的鱟試劑，可適應人血白蛋白細菌內毒素檢查的不同質量控制要求，具有簡便、靈敏、快速、準確等優點。另外，巴氏滅活也可一定程度降低熱原含量。