基于SCoT分子標記的37份葡萄種質遺傳多樣性分析

馬玉姣，何西堂，吳玉森，劉利，李勃，李秀杰*

（1. 山東省葡萄研究院，山東濟南 250100；2. 莒南縣城鄉建設綜合服務中心，山東莒南 276699）

近年來，DNA分子標記因其操作簡單、反應靈敏、應用范圍廣及受環境因素干擾小等顯著優點，廣泛應用于葡萄遺傳多樣性分析[1-3]。其中，目標起始密碼子多態性（Start codon targeted polymorphism，SCoT）分子標記由Collard和Mackill[4]在水稻研究中開發，是基于ATG起始密碼子兩側短序列的保守性，利用單引物對基因組進行PCR擴增的分子標記方法。相比于SSR、ISSR、AFLP等傳統分子標記，SCoT具有成本低、操作簡單、重復性好、引物通用性強等優勢，已廣泛應用于龍眼、芒果、柿、獼猴桃、桃、櫻桃等[5-10]多種果樹的多態性和系統發育關系的分析研究。

葡萄為葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（VitisL.）植物，是最古老的植物之一[11]。我國現有資源圃中保存的葡萄種質達3000多份[12]，品種豐富多樣，種植范圍廣，在落葉果樹生產中占據重要的位置[13]。近年來，隨著國內葡萄新品種的不斷選育，其中不乏自然變異及民間選育的品種，加之地區之間品種交流頻繁，導致出現“同名異物”或“同物異名”現象[14]。因此，開展葡萄種質資源研究，僅靠形態學標記已遠遠不夠，必須借助簡單高效的分子標記，以實現對種質遺傳關系及多樣性的精準鑒定。目前，SCoT分子標記雖已在葡萄上有所應用[15-16]，但缺乏對主栽品種和自主選育品種的遺傳關系及多樣性分析。本研究基于SCoT分子標記技術，利用11對多態性好的引物，對中國農業科學院鄭州果樹研究所國家葡萄種質資源圃（鄭州）和山東省果樹研究所金牛山基地（泰安）的主栽品種和自主選育品種（優系）共37份種質進行遺傳關系及遺傳多樣性分析，篩選部分品種的潛在親本，為葡萄遺傳育種工作中親本的選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所選取的37份樣品材料，包括27個現有栽培品種：紅地球、美人指、紅巴拉多、魏可、秋紅、秋黑、安藝皇后、巨玫瑰、乍娜、紅乳、矢富羅莎、玫瑰香、巨星、里扎馬特、紅雞心、著色香、牛奶、京秀、黑巴拉多、蜜汁、鳳凰51、巨峰、紅雙味、弗雷無核、早霞玫瑰、山東早紅、87-1，來自國家葡萄種質資源圃（鄭州）；MPG1、JM19、JFF19、JFH19、JF19、錦紅[17]、藤稔芽變7個自育品種（系）及巨峰、藤稔、摩爾多瓦3個現有栽培品種取自金牛山基地（泰安），巨峰在兩地同時采樣（表1）。上述種質于2020年8月取樣，每份樣品隨機采集幼嫩葉片10片，迅速置于液氮中帶回實驗室，保存至-80 ℃冰箱中備用。

表1 試驗所需葡萄種質詳細信息Table 1 Detail information of the tested grape accessions

1.2 葡萄DNA的提取

采用CTAB法提取葡萄葉片基因組DNA，通過1%凝膠電泳和微量核酸蛋白濃度測定儀（NanoDrop2000，Thermo，USA）檢測其純度和濃度，并用ddH2O統一稀釋至30 ng·μL-1，保存至-20 ℃冰箱備用。

1.3 SCoT引物及PCR擴增

本試驗所用引物（表2）均已報道[3-4]，SCoT-PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。SCoT-PCR反應體系（20 μL）：2×PCR Mix 10 μL，SCoT引物（10 μmol）1 μL，30 ng·μL-1DNA 1 μL，ddH2O 8 μL。擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，進行35個循環；72 ℃延伸10 min。將擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，利用ChamlGel 6000型凝膠成像系統進行觀察并拍照。

表2 11條SCoT引物序列及多態性信息Table 2 Polymorphism of 11 SCoT primers in samples

1.4 數據統計與分析

根據擴增結果對條帶進行統計，記錄遷徙位置。對同一遷徙位置的電泳條帶進行賦值，“0”表示無條帶，“1”表示有條帶，構建原始（0,1）矩陣。使用軟件NTSYSpc 2.10對（0,1）矩陣中不同種質進行遺傳相似系數分析，根據軟件中構建的（0,1）矩陣對37份葡萄種質進行主坐標分析，同時利用UPGMA法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄種質SCoT-PCR擴增產物多態性分析

利用11條SCoT引物分別對37份葡萄種質進行SCoT-PCR擴增，共得到整齊、清晰的條帶115條，平均每條引物擴增得到10.45條；其中擴增條帶最多的是SCoT40，共15條；最少的是SCoT23和SCoT37，僅8條；擴增共得到多態性條帶102條，平均多態性比率為87.9%。多態性比率最高的SCoT6和SCoT37，均為100%；最少的是SCoT23，為62.5%（表2）。結果表明，本研究使用的11條SCoT引物擴增條帶多態性豐富，且試驗中用到的葡萄種質遺傳多樣性豐富。

2.2 基于SCoT標記的葡萄種質遺傳聚類分析

基于對37份葡萄種質樣品建立的（0,1）矩陣，對其遺傳相似系數進行分析，結果顯示遺傳相似性系數范圍在0.612～0.929，平均值為0.776（圖1）。37份種質中有20對遺傳相似系數大于0.850。其中，巨玫瑰（8）和玫瑰香（12）、巨星（13）和里扎馬特（14）、早霞玫瑰（25）和山東早紅（26）、JF19（29）和JFH19（32）、JFF19（31）和JFH19（32）、藤稔（35）和藤稔芽變（36）含有親本關系或使用了同一親本，而藤稔（35）和藤稔芽變（36）相似系數高達0.929，說明芽變品種‘藤稔芽變’與其母本‘藤稔’之間相似性極高。37份種質中遺傳相似系數最小的為鳳凰51（21）和JF19（29），僅為0.612，說明二者具有不同的遺傳背景。

圖1 37份葡萄種質遺傳相似性系數熱圖Figure 1 Heat map of genetic similarity coefficient among 37 grape germplasms

2.3 葡萄種質聚類分析和主坐標分析

對37份種質進行聚類分析結果顯示，當遺傳距離為0.67時，可將37份葡萄種質分為兩類，第Ⅰ類包含30份種質（圖2），第Ⅱ類包含7個種質，進一步分類可將其分為6組。第1組包括紅地球、美人指、乍娜、秋黑、87-1、藤稔、藤稔芽變和紅巴拉多8個種質；第2組包括巨玫瑰、玫瑰香、紅雞心、矢富羅莎、紅乳、巨星、里扎馬特、牛奶、黑巴拉多和錦紅10份種質；第3組包括魏可、早霞玫瑰、山東早紅、秋紅、JFH19、JFF19和著色香7份種質；第4組包括安藝皇后、紅雙味、鳳凰51、京秀和弗雷無核5個種質；第5組包括蜜汁、巨峰（鄭州）、JF19和巨峰（泰安）4個種質；第6組包括MPG1、JM19和摩爾多瓦3個種質。

圖2 37份葡萄種質聚類分析圖Figure 2 Cluster diagram of 37 grape germplasms

同時，利用遺傳相似系數繪制了37份葡萄種質進行主坐標分析，并繪制散點圖。如圖3所示，可將37份葡萄種質分為4組：A組包括紅地球（1）、美人指（2）、紅巴拉多（3）、魏可（4）、秋紅（5）、秋黑（6）、巨玫瑰（8）、乍娜（9）、紅乳（10）、矢富羅莎（11）、玫瑰香（12）、巨星（13）、里扎馬特（14）、紅雞心（15）、著色香（16）、牛奶（17）、京秀（18）、黑巴拉多（19）、弗雷無核（24）、早霞玫瑰（25）、山東早紅（26）、87-1（27）、錦紅（34）、藤稔（35）和藤稔芽變（36）25個種質；B組包括安藝皇后（7）、鳳凰51（21）、紅雙味（23）、JFF19（31）和JFH19（32）5個種質；C組包括MPG1（30）、JM19（33）和摩爾多瓦（37）3個種質；D組包括蜜汁（20）、巨峰-鄭州（22）、JF19（29）和巨峰-泰安（28）4個種質。主坐標分析中的A、B組和C、D組分別對應聚類分析圖中的Ⅰ類和Ⅱ類，且每組成員與聚類分析結果基本吻合。相比于聚類分析圖，主坐標分析圖能更直觀的表現出37個葡萄種質的親緣關系。

圖3 37份葡萄種質主坐標分析圖Figure 3 Pricipal coordinate analysis of 37 grape germplasms

3 討論與結論

葡萄為高度雜合的物種，種內變異大是葡萄具有遺傳多樣性的基礎。利用分子標記對葡萄多樣性及遺傳關系進行鑒定，對葡萄育種和品種保護提供了重要參考[18-19]。近年來，利用SCoT標記進行葡萄種群間遺傳多樣性和親緣關系的研究也有報道。王發明等[15]分別利用ISSR和SCoT對葡萄種質遺傳多樣性進行了分析，結果表明，相比于ISSR標記，SCoT分析的樣本遺傳多樣性更高，且能更好的區分栽培種質和野生種質，在葡萄種質系統進化及遺傳多樣性評價中SCoT比ISSR更有優勢，這與Kumer等[20]的研究結果相符。岳慶春等[16]利用SCoT分子標記對醉金香及其突變株進行遺傳多樣性分析發現，SCoT分子標記可以將親緣關系近的樣本聚到一起，說明SCoT分子標記可應用于葡萄種質遺傳多樣性的評價和雜交育種的早期鑒定工作中。

本研究選用山東地區鮮食葡萄主栽品種和自主選育的品種（優系），利用11對SCoT引物分析親本關系和遺傳多樣性，平均多態性比例達到87.90%，高于可揭示多數葡萄種質的遺傳差異；遺傳范圍區間為0.612～0.929，其中遺傳相似系數大于0.850的有20對，遺傳范圍較窄；當遺傳相似系數為0.67時，可將37份葡萄種質分為兩大類。聚類分析結果表明，具有親本關系的品種遺傳距離很近，如：秋黑是美人指的后代，巨玫瑰是玫瑰香的后代，自主選育品種錦紅是里扎馬特的后代，芽變品種藤稔芽變是藤稔的后代，其中藤稔芽變和藤稔遺傳相似系數高達0.929；多數使用了同一親本的姊妹品種也聚類在同一支上，如：紅雞心和玫瑰香都是白玫瑰的后代，選育的優系JFF19和JFH19都是巨玫瑰的后代等，上述結果與利用SLAF-seq方法報道結果相符[2]。此外，由于葡萄種質遺傳背景較為復雜，許多民間選育品種無法提供確切的親本信息，如本文中提到的牛奶（親本不詳）和黑巴拉多遺傳相似系數為0.844，87-1（親本未知）和秋黑遺傳相似系數為0.875，猜測二者可能具有直接親本關系或為姊妹品種，SCoT標記對這類種質的親本預測工作提供依據。

本研究利用SCoT分子標記客觀評價了37份葡萄種質的遺傳多樣性，為拓寬葡萄種質的遺傳基礎提供了理論依據。同時，該方法可鑒定葡萄潛在的親緣關系，為鑒定未知親緣關系的品種提供參考依據。