NLRP3-CAMKⅡ-IRE-1α通路激活誘導氧化應激增強對糖尿病大鼠心室重構的影響

周夢竹，張海鳳，張雪，張躍，程立君，劉彤，劉長樂

目前糖尿病（DM）的患病率在全球范圍內迅速上升，預計到2045 年將有6.93 億人受到影響，相比2017 年受影響人數增加50%。在高血糖應激狀態下，心肌細胞的穩態被打破，從而促進心肌病的發展［1-2］。糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）促使心臟結構和功能的改變，在高血糖條件下，炎癥、氧化應激、內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）和鈣穩態失衡的相互作用促進心室重構的進展，也是心肌肥厚和心肌纖維化的復雜病理過程［3］。早期心室重構以適應內環境變化，但隨著時間的推移心室重構的失調導致心功能下降［3-4］。格列本脲（glibenclamide，GLB）是一種磺酰脲類降糖藥，同時也是核苷酸結合寡聚結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體的特異性抑制劑，不僅具有降糖作用，也可抑制炎癥反應，減少組織纖維化［5-6］。但鮮見GLB與ERS和氧化應激的相關研究。本研究旨在探索NLRP3 激活ERS 和促進氧化應激是否參與DM 大鼠心室重構以及GLB 能否改善此變化。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 鏈脲佐菌素、檸檬酸鈉緩沖液、HE染色試劑盒和Masson 染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；GLB（2.5 mg×100 片）購自天津太平洋制藥有限公司；二氫乙錠（DHE）購自美國US EVERBRIGHT 公司；血糖試紙條、血糖儀購自三諾生物傳感股份有限公司；PVDF膜購自德國GE Healthcare 公司；雙辛酸（BCA）蛋白測定試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；兔抗NLRP3抗體購自美國NOVUSBIO公司；兔抗鼠胱天蛋白酶-1（caspase-1）多克隆抗體購自美國Proteintech 公司；兔抗鼠肌醇需求激酶-1α（inositol-requiring protein-1α，IRE-1α）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗鼠鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ（calmodulindependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）抗體、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NADPH-oxidase 2，NOX2）抗體和NOX4 抗體均購自英國Abcam 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗購自美國Promega 公司；小動物心臟彩色超聲儀購自美國Visual Sonics 公司；無創血壓計購自Softron biotechnology 公司；心外膜激活映射標測系統購自英國Mapping Lab 公司；化學發光成像分析系統購自上海Tanon科技股份有限公司；正置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；TP1020全自動生物組織脫水機、病理石蠟切片機、石蠟切片展片機、病理組織烤片機、冰凍切片機購自德國Leica公司；生物組織包埋機（BMJ-1）購自上海珂淮有限公司。

1.2 實驗動物及分組 36 只6 周齡健康雄性Sprague-Dawley 大鼠購自北京華阜康生物科技有限公司，體質量200～220 g，按隨機數字表法分為對照組（CTL組）、糖尿病組（DM 組）和糖尿病+GLB 組（GLB 組），每組12 只。每組按隨機數字表法抽取6只大鼠進行超聲心動圖檢測、血流動力學實驗、組織病理學檢查及蛋白免疫印跡分析，另外6只大鼠進行心外膜激活映射標測。DM 模型建立前大鼠禁食12 h，通過單次腹腔注射鏈脲佐菌素（溶于枸櫞酸緩沖液）55 mg/kg進行建模，48 h 后，通過檢測尾靜脈血糖驗證DM 模型，單次空腹血糖≥14 mmol/L 或兩次空腹血糖≥11 mmol/L 為建模成功。GLB 組于造模成功后每日上午灌胃GLB 1.25 mg/kg，連續8周，CTL 組不進行任何干預。將3 組大鼠在相同溫度、濕度，通風良好，水食物供應充足喂養。8周后記錄各組血糖、血壓和體質量。本實驗所有操作均經天津醫科大學動物區域倫理委員會批準。

1.3 血流動力學指標測量 將大鼠置于安靜室內，10 min后待大鼠穩定并適應環境，用網袋固定大鼠，并對尾巴進行加溫以擴張血管，待大鼠穩定后測量心率、收縮壓、舒張壓。每只大鼠共測量5次，取平均值。

1.4 心臟超聲檢查 造模成功8 周后，用1.5%異氟醚麻醉大鼠并連接體表心電圖，用心臟彩色超聲儀進行檢查。分別從胸骨旁左心室長軸位、短軸位和心尖四腔切面評估肺動脈血流加速時間、平均肺動脈壓、收縮期與舒張期室間隔、心室前壁和心室后壁厚度。各測量3次，取平均值。

1.5 心外膜激活映射標測 造模成功8周后，大鼠麻醉后游離氣管并進行氣管插管，連接呼吸機后開胸行心外膜激活映射標測。將36個電極（6×6格）置于心臟表面，通過多通道矩陣電生理標測系統選取心室傳導均勻的心室波測量心室傳導速度，選取至少3 個連續心室波，計算心室心外膜傳導速度、心室絕對不均勻性及心室不均勻指數。所有結果均采用EMapScope 4.0軟件進行分析。

1.6 蛋白免疫印跡實驗檢測組織蛋白表達 造模成功8 周后，將大鼠麻醉處死，取心室組織，計算心室體質量比。加入1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA 緩沖液提取心室組織蛋白。組織勻漿用12 000×g離心20 min，取上清液備用。采用BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。樣品蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉移到0.45μm PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封片1 h 后，與特異性一抗，包括炎性相關蛋白NLRP3（1∶500）、caspase-1（1∶1 000），ERS相關蛋白CaMKⅡ（1∶1 000）、IRE-1α（1∶1 000），氧化應激相關蛋白NOX2（1∶1 000）、NOX4（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。然后用含Tween-20 的Tris 鹽酸緩沖液（TBST）清洗PVDF 片，用與HRP 結合的二抗孵育1 h，TBST 再次漂洗，檢測蛋白。抗原抗體反應采用多化學發光成像分析系統進行可視化。采用Image J軟件進行半定量分析。

1.7 熒光染色法測定活性氧（ROS）含量 用10μmol/L DHE染色心室組織冷凍切片（厚度10μm），37 ℃加濕箱孵育切片30 min 后，用磷酸鹽緩沖液沖洗10 min，重復3 次，隨后立即用玻片封片，在相同條件下用熒光顯微鏡成像，并用Image J軟件分析圖像的平均灰度值以量化ROS水平。

1.8 HE 染色及Masson 染色觀察心室組織細胞形態和纖維化 心室組織樣品置于10%福爾馬林中固定，石蠟包埋，切成4～5μm切片。通過HE染色和改良Masson染色觀察細胞形態和纖維化區域。每個樣本取3個隨機區域觀察并分析心室膠原體積分數（collagen volume fraction，CVF）。用Image J軟件分析結果。

1.9 統計學方法 采用GraphPad Prism 9.3.1 軟件進行數據分析。符合正態分布的數據以表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較行Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組基線特征、血流動力學和超聲心動圖指標比較 與CTL 組相比，DM 組的血糖升高，心室體質量比增大，收縮期和舒張期室間隔厚度、左心室前壁厚度增加，體質量降低（P＜0.05）。與DM 組相比，GLB 組收縮期和舒張期室間隔厚度、左心室前壁厚度減低（P＜0.05）。3組間收縮壓、舒張壓、肺動脈血流加速時間、平均肺動脈壓、收縮期和舒張期左心室后壁厚度比較差異無統計學意義。見表1。

Tab.1 Comparison of baseline characteristics,hemodynamic and echocardiographic indexes between the three groups表1 3組基線特征、血流動力學和超聲心動圖指標比較（n=6，）

Tab.1 Comparison of baseline characteristics,hemodynamic and echocardiographic indexes between the three groups表1 3組基線特征、血流動力學和超聲心動圖指標比較（n=6，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與CTL組比較，b與DM組比較，P＜0.05；表2、3同；1 mmHg=0.133 kPa。

組別CTL組DM組GLB組F血糖（mmol/L）7.67±1.32 27.72±5.73a 28.33±2.24a 62.870＊＊體質量（g）424.20±33.97 233.20±65.85a 267.50±68.76a 18.260＊＊心室體質量比（‰）2.93±0.17 3.35±0.25a 3.08±0.12 7.830＊＊收縮壓（mmHg）119.30±9.37 126.20±7.94 120.50±10.77 0.902舒張壓（mmHg）85.67±7.17 82.33±9.42 88.17±8.35 0.735心率（次/min）346.50±30.35 295.20±43.80 346.80±29.71 4.275＊肺動脈血流加速時間（ms）32.22±3.16 29.90±6.87 32.58±4.72 0.476組別CTL組DM組GLB組F平均肺動脈壓（mmHg）70.03±1.96 71.46±4.26 69.80±2.92 0.476收縮期室間隔厚度（mm）2.69±0.25 3.41±0.33a 2.62±0.26b 14.350＊＊舒張期室間隔厚度（mm）1.63±0.24 2.06±0.26a 1.54±0.22b 8.134＊＊收縮期左心室前壁厚度（mm）2.89±0.19 3.48±0.42a 2.24±0.32ab 22.140＊＊舒張期左心室前壁厚度（mm）1.76±0.06 2.39±0.36a 1.47±0.17b 24.910＊＊收縮期左心室后壁厚度（mm）2.73±0.42 3.00±0.52 2.64±0.41 1.039舒張期左心室后壁厚度（mm）1.96±0.25 2.11±0.45 1.71±0.39 1.785

2.2 心外膜激活映射標測結果比較 與CTL 組相比，DM組左、右心室心外膜傳導速度減慢，右心室不均勻指數增加（P＜0.05）。與DM組相比，GLB組左、右心室心外膜傳導速度增快，左心室絕對不均勻性和不均勻指數降低（P＜0.05）。見表2、圖1。

Fig.1 Epicardial activation mapping in the three groups圖1 3組心外膜激活映射圖像

Tab.2 Comparison of epicardial activation mapping of rats between the three groups表2 3組大鼠心外膜激活映射標測結果比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of epicardial activation mapping of rats between the three groups表2 3組大鼠心外膜激活映射標測結果比較（n=6，）

組別CTL組DM組GLB組F左心室心外膜傳導速度（m/s）1.05±0.27 0.52±0.24a 1.08±0.29b 7.066＊＊左心室絕對不均勻性2.25±0.23 4.40±2.21 1.68±0.20b 6.230＊左心室不均勻指數1.66±0.19 2.56±0.89 1.49±0.20b 5.635＊組別CTL組DM組GLB組F右心室心外膜傳導速度（m/s）0.87±0.20 0.58±0.15a 1.09±0.16b 11.620＊＊右心室絕對不均勻性2.32±0.47 4.68±3.09 2.39±0.17 2.759右心室不均勻指數1.38±0.13 2.01±0.43a 1.65±0.35 4.620＊

2.3 各組炎癥、ERS和氧化應激相關蛋白表達水平比較 與CTL 組比較，DM 組NLRP3、caspase-1、CaMKⅡ、IRE-1α、NOX2 和NOX4 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與DM 組比較，GLB 組NLRP3、caspase-1、CaMKⅡ、IRE-1α、NOX2 和NOX4 蛋白表達水平下降（P＜0.05）。見表3、圖2。

Fig.2 Protein expression in ventricular tissue in the three groups圖2 3組心室組織蛋白表達情況

Tab.3 Comparison of NLRP3,caspase-1,CaMK Ⅱ,IRE-1α,NOX2 and NOX4 protein expression levels between the three groups表3 3組NLRP3、caspase-1、CaMKⅡ、IRE-1α、NOX2和NOX4蛋白表達水平比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of NLRP3,caspase-1,CaMK Ⅱ,IRE-1α,NOX2 and NOX4 protein expression levels between the three groups表3 3組NLRP3、caspase-1、CaMKⅡ、IRE-1α、NOX2和NOX4蛋白表達水平比較（n=6，）

組別CTL組DM組GLB組F NLRP3 0.80±0.27 1.26±0.33a 0.81±0.18b 5.814＊caspase-1 0.41±0.19 0.81±0.10a 0.36±0.20b 12.320＊＊CaMKⅡ1.17±0.16 1.50±0.28a 1.12±0.07b 7.092＊＊組別CTL組DM組GLB組F IRE-1α 0.28±0.09 0.56±0.13a 0.34±0.10b 10.960＊＊NOX2 1.15±0.34 1.93±0.45a 1.25±0.25b 8.459＊＊NOX4 0.92±0.22 1.60±0.21a 0.92±0.21b 20.000＊＊

2.4 ROS 檢測結果 CTL 組、DM 組和GLB 組平均灰度值分別為349.4±221.6、1 353.0±590.0 和509.3±265.9，組間差異有統計學意義（F=11.180，P＜0.01）。與CTL 組比較，DM 組平均灰度值增大，心室肌ROS產生增多（P＜0.01）。與DM 組比較，GLB 組平均灰度值減小，心室肌ROS產生減少（P＜0.01）。見圖3。

Fig.3 Production of ROS in ventricular tissue in the three groups(DHE staining,×100)圖3 3組心室組織ROS產生情況（DHE染色，×100）

2.5 組織病理學染色結果 與CTL 組比較，DM 組心室肌細胞排列紊亂，而GLB 組較DM 組紊亂程度改善，CTL組、DM組和GLB組CVF（%）分別為2.06±0.27、8.47±1.31 和3.72±0.63，3 組差異有統計學意義（F=91.860，P＜0.01）。與CTL組比較，DM組CVF升高（P＜0.05），心室肌纖維化程度加重；與DM 組比較，GLB 組CVF 降低（P＜0.05），心室肌纖維化程度減輕。見圖4。

Fig.4 Pathological staining results of ventricular muscle in the three groups圖4 3組間心室肌病理染色結果

3 討論

在DCM的發展過程中，代謝紊亂會導致心臟結構和功能改變，促進心臟重構、纖維化和功能障礙。心室重構主要包括電重構和結構重構［3］。Zhan等［7］研究表明，DM 大鼠心外膜傳導速度降低，絕對不均勻性和不均勻指數增加。高血糖環境下，心臟復極時間延長，且離散程度和不均一性增加［8］。本研究通過心外膜激活映射標測評估電重構，結果顯示DM組較CTL 組心室外膜傳導速度減慢，右心室不均勻指數增加，而GLB組較DM組心室外膜傳導速度、左心室絕對不均勻性及不均勻指數有所改善。心外膜心電傳導不均勻性升高，心電傳導方向離散程度增大，可能更容易導致心律失常。心肌肥大和纖維化是DCM 結構重構的代表性特征［9］。本研究通過心臟超聲和病理染色結果對心臟結構重構進行評估發現，與CTL 相比，DM 大鼠心室體質量比、室間隔厚度、左心室前壁厚度增加，心室肌細胞排列紊亂，CVF升高，組織纖維化明顯；而GLB組較DM組室間隔和左心室前壁厚度有所改善，心肌細胞排列紊亂程度減輕，纖維化程度減輕，證實DM會對心臟產生不利影響，但這僅是DCM 發生的表觀現象，其分子機制尚不明確。

目前研究表明，DCM與炎癥、ERS和氧化應激關系密切，三者共同促進DCM發生發展［10］。多種炎癥通路的活化在DCM中發揮重要作用，其中NLRP3炎性小體作為經典的炎性因子被廣泛研究。NLRP3是一種常見的先天免疫信號受體，在炎癥性疾病的刺激和激活下，誘導多種類型細胞死亡［11-12］。NLRP3炎性小體的活化是一個連續的過程，首先需要觸發事件誘導NLRP3表達上調，之后NLRP3與含半胱天冬酶募集域的凋亡相關斑點樣蛋白和caspase-l 組裝成具有酶活性的多蛋白復合物，激活下游經典焦亡通路，進一步聚集炎性細胞，擴大炎癥反應［13］。本課題組前期研究證實，NLRP3/caspase-1/Gal-3 信號通路參與調節DM兔模型的心房重構［14］。GLB作為NLRP3 炎性小體抑制劑，具有抗炎和抗氧化特性［15-16］。既往研究表明，GLB 抑制NLRP3 表達后可減弱高脂飲食大鼠體內的超氧化物生成、脂質過氧化，降低NOX2蛋白水平，改善抗氧化狀態和胰島素信號通路［17］。本研究發現，與CTL 組相比，DM 大鼠心臟組織中NLRP3和caspase-1蛋白表達增多，炎癥反應增強，證實DM 作為觸發點能夠使NLRP3 表達上調，引起炎癥反應；與DM 組相比，GLB 組NLRP3和caspase-1 蛋白表達下調，證實GLB 對NLRP3 的抑制作用可減弱DM大鼠體內炎癥反應。

NLRP3 炎性小體和ERS 參與體內多種病理生理過程。Heijman等［18］研究表明，心臟手術后房顫患者心房肌細胞NLRP3炎性小體表達增強，對小鼠心房肌細胞予白細胞介素-1β刺激也能增強心房肌細胞NLRP3 和CaMKⅡ的表達。CaMKⅡ是一個多效應信號分子，在高血糖、氧化應激、缺氧和缺血性損傷條件下，CaMKⅡ活化導致細胞內Ca2+超載，進一步觸發ERS，促進心肌細胞死亡［19］。NLRP3 炎性小體可能通過調節CaMKⅡ表達啟動ERS。ERS 是細胞的一種保護性應激反應，是細胞應對內質網腔內錯誤折疊與未折疊蛋白聚集以及鈣平衡紊亂等狀況而做出的反應。未折疊蛋白反應（unfolded protein reaction，UPR）是一種信號轉導途徑，由ERS激活，維持蛋白質穩態和細胞的分泌功能［20-22］。UPR通路包括3 個主要的信號級聯，分別由IRE-1α、蛋白激酶RNA 樣內質網激酶和激活轉錄因子6 啟動。慢性ERS 可通過刺激IRE-1α 上調啟動UPR［23］。在DM中，NLRP3 過度表達導致CaMKⅡ表達上調，誘發IRE-1α相關的ERS過度活化，進而導致氧化應激反應增強。氧化應激通過脂質過氧化、DNA 損傷和線粒體功能障礙在DM各種并發癥的病理生理學中起關鍵作用［24-26］。ROS 與NADPH 是細胞內各種氧化應激誘導因子中的關鍵因子，DM 血糖波動可促進ROS、NADPH過度生成［27-28］。NADPH是一個蛋白質家族，包括NOX1-5 和Duox 1/2 共7 個成員，與心肌細胞ER 較為密切相關的亞型是NOX2、NOX4［29］。本研究發現，與CTL 組相比，DM 組大鼠心室肌組織中NLRP3/CaMKⅡ/IRE-1α 和氧化應激相關產物NOX2、NOX4表達上調，ROS產生增多。與DM組相比，GLB 組NLRP3/CaMK Ⅱ/IRE-1α 表達下調，NOX2、NOX4 水平下降，ROS 產生減少，表明在高糖狀態下，NLRP3 活化，進而激活ERS，加劇細胞內氧化應激反應，而GLB 抑制NLRP3 表達后，炎癥水平減輕，ERS 反應減弱，通路下傳受到抑制，心室肌細胞內氧化應激反應減弱，心功能得到改善。

綜上所述，高血糖狀態可誘發心室肌細胞NLRP3-CAMKⅡ-IRE-1α 通路表達上調，氧化應激增強，影響鼠心室重構，GLB可降低ERS和氧化應激水平，從而部分逆轉心室重構，這可能為未來DCM臨床治療提供一種新的方法。