CircCDR1as調節miR-671-5p/CBX4軸對NSCLC細胞生物學行為的影響

杜文峰，周玲，李琪

肺癌發病率高、死亡率高，已成為全球腫瘤相關死亡的主要因素［1］。肺癌包括非小細胞肺癌（NSCLC）和小細胞肺癌，其中85%的肺癌病例被診斷為NSCLC［2］。在過去的幾十年里，全球在NSCLC的預防、診斷和治療方面取得了一定進展［3］。之前由于篩查方案不完善，臨床癥狀發現較晚，NSCLC患者確診時大多處于中晚期，預后較差，5年生存率低于20%［4］。近期發現的肺癌多為超早期，說明肺癌的早期診斷技術在不斷提高，但依然有不少患者不能在超早期被確診［5］。因此，尋找早期診斷標志物和新的、有效的NSCLC治療方法勢在必行。有研究顯示，部分環狀RNA（CircRNAs）異常表達與包括NSCLC 在內的肺癌等腫瘤發生與進展相關［6-7］。越來越多的證據表明，CircRNAs 反義小腦變性相關蛋白1轉錄本（CircRNA antisense cerebellar degenerationrelated protein 1 transcript，CircCDR1as）可促進前列腺癌［8］和胰腺癌［9］，抑制膀胱癌［10］和卵巢癌［11］的發生發展。有研究表明，CircCDR1as 作為一種致癌基因，促進了NSCLC 的發展［12］。然而，CircCDR1as 參與NSCLC進展的機制尚不清楚。StarBase 預測顯示CircCDR1as 可能調控miR-671-5p 表達。既往研究表明，沉默miR-671-5p 表達可促進NSCLC 的進展［13］。此外，多梳蛋白（polycomb group，PcG）家族在人類癌癥進展的多個過程中至關重要［14］。染色盒同源物4（chromobox 4，CBX4）是PcG 家族表觀遺傳調控因子中的一員，可能驅動肺癌的惡性進展［15］。既往研究表明，在結腸癌細胞中，CBX4是miR-671-5p的靶基因，且過表達CBX4 能夠逆轉miR-671-5p 上調對細胞增殖、轉移的抑制作用［16］，但是在NSCLC細胞中是否有同樣的調控作用還不清楚。本研究探討了CircCDR1as 在NSCLC 中的生物學功能及其與miR-671-5p 和CBX4 的關系，為深入了解NSCLC 進展的分子機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 CircCDR1as、CBX4 過表達載體及其陰性對照pcDNA3.1 載體（pcDNA），CircCDR1as 小干擾RNA（si-CircCDR1as）及陰性對照（si-NC）、miR-671-5p mimic 及陰性對照（miR-NC）、miR-671-5p inhibitor（anti-miR-671-5p）及陰性對照（anti-NC）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。DMEM 培養基、Trizol 試劑購自Sigma-Aldrich；RNase R 購自Abcam 公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒、BCA 蛋白測定試劑盒、四甲基偶氮唑鹽（MTT）溶液、二甲基亞砜、結晶紫、硝酸纖維素膜購自上海碧云天生物技術有限公司；SYBR Green、甲醇、Lipofectamine 3000 及兔抗人CBX4、GAPDH 抗體、山羊抗兔IgG 二抗（HRP）購自美國Thermo Fisher；總蛋白提取試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；Western 阻斷緩沖液購自上海華雅思創生物科技有限公司；增強的化學發光試劑購自上海谷研實業有限公司；Transwell嵌套24 孔板購自上海凌儀生物科技有限公司；Matrigel 膠購自北京萌壯科技有限公司；Annexin V-熒光素異硫氰酸鹽（FITC）和碘化丙啶（PI）購自北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶測定系統購自Promega。酶標儀購自北京普天新橋技術有限公司；顯微鏡購自奧林巴斯；流式細胞儀購自艾力特生命科學（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染 人支氣管上皮樣細胞（HBE）和人NSCLC細胞株（NCI-H524、NCI-H1734、Calu-3和A549）購自上海ATCC細胞庫，在含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM中培養。使用Lipofectamine 3000對A549細胞進行24 h 的寡核苷酸或載體轉染，并分成Control 組（正常培養）、si-NC 組（轉染si-NC）、si-CircCDR1as 組（轉染si-CircCDR1as）、si-CircCDR1as+anti-miR-NC 組（共轉染si-CircCDR1as和anti-miR-NC）、si-CircCDR1as+anti-miR-671-5p組（共轉染si-CircCDR1as和anti-miR-671-5p）、pcDNA組（轉染pcDNA）、CircCDR1as 組（轉染CircCDR1as）、miR-NC組（轉染miR-NC）、miR-671-5p組（轉染miR-671-5p）、miR-671-5p+pcDNA 組（共轉染miR-671-5p 和pcDNA）、miR-671-5p+CBX4 組（共轉染miR-671-5p 和CBX4）、anti-miRNC 組（轉染anti-miR-NC）和anti-miR-671-5p 組（轉染antimiR-671-5p）。

1.2.2 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測CircCDR1as、miR-671-5p和CBX4 mRNA表達水平 用Trizol試劑裂解細胞，分離總RNA。提取CircRNA 時，RNA 經RNase R 進一步處理，利用cDNA 第一鏈合成試劑盒逆轉錄生成互補DNA（cDNA），與SYBR Green和特異性引物混合后用于qRT-PCR檢測。CircCDR1as 引物正向5'-CCCAGTCTTCCATCAACTGG-3'，反向5'-ACCTTGACACAGGTGCCATC-3'，196 bp；CBX4 引物正向5'-TGGAGTATCTGGTGAAATGGA-3'；反向5'-ACGACGGGCAAAGGTAGGCAC-3'，218 bp；miR-671-5p引物正向5'-AGGAAGCCCTGGAGG-3'，反向5'-GAACATGTCTGCGTATCTC-3' ，207 bp；GAPDH 引物正向5'-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3'，反向5'-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'，235 bp；U6引物正向5'-AAAGCAAATCATC-GGACGACC-3'，反向5'-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3'，224 bp。PCR 反應體系：cDNA 5μL，SYBR Green 10μL，正、反向引物各0.4 μL，H2O 4.2 μL。擴增條件：95 ℃30 s；95 ℃10 s，60 ℃15 s，共38 個循環。GAPDH 或U6 作為內部對照，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.2.3 Western blot 分析CBX4 蛋白的相對表達 用總蛋白提取試劑盒制備蛋白樣品，用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，98 ℃變性10 min。對等量的蛋白質進行SDS-PAGE和硝酸纖維素膜轉移。用Western阻斷緩沖液阻斷非特異性結合位點后，用CBX4 或GAPDH 一抗和相應二抗孵育膜，化學發光試劑顯色。采用Quantity One 軟件，以GAPDH 為內參，對灰度值進行半定量分析。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因分析驗證miR-671-5p 與CircCDR1as 或CBX4 的關系 通過StarBase（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）預測miR-671-5p 與CircCDR1as 或CBX4 的潛在結合位點。克隆含有miR-671-5p 結合位點的CircCDR1as 或CBX4 3'-UTR 序列，然后將其連接至psiCHECK-2 雙熒光素酶載體上，生成野生型熒光素酶報告基因載體（CircCDR1as-WT 和CBX4-WT）和相應的突變體（CircCDR1as-MUT 和CBX4-MUT）。然后，將構建的熒光素酶報告基因載體和miR-671-5p 或miR-NC 轉染A549 細胞。轉染24 h后，用雙熒光素酶測定系統測定螢火蟲和海腎的熒光素酶活性。各組螢火蟲熒光素酶活性歸一化為海腎熒光素酶活性，實驗組相對熒光素酶活性歸一化為對照組。

1.2.5 MTT 實驗評估細胞活力 轉染后，收集A549 細胞，調整細胞密度至3×104個/mL。于96 孔板中加入細胞懸液（100 μL/孔），分別培養0、1、2、3 d。在指定的時間點，添加MTT溶液（10μL/孔）再孵育4 h。然后除去培養基，每孔加入100μL 二甲基亞砜溶解晶體，通過酶標儀測定490 nm 波長下的光密度（OD）值。

1.2.6 克隆形成實驗分析細胞增殖能力 A549 細胞（每孔300 個細胞）接種于6 孔板。培養10 d 后，用甲醇固定細胞，1%結晶紫染色，顯微鏡下計數克隆形成情況。

1.2.7 流式細胞術評估細胞凋亡 A549 細胞（每孔1×105個）接種于24 孔板，培養3 d。將細胞重懸于結合緩沖液中，用5μL FITC和PI避光染色10 min。流式細胞儀檢測凋亡細胞。凋亡率以右上、下象限細胞占總細胞數的百分比表示。

1.2.8 Transwell法評價細胞遷移、侵襲 采用Transwell嵌套24 孔板測試其遷移和侵襲能力。Transwell 小室上室預涂Matrigel 膠用于侵襲實驗，未處理的Transwell 小室用于遷移實驗。轉染后，用無血清DMEM 制備3×105個/mL 的A549 細胞懸液，并將100μL的細胞懸液放入上室。下室加入含10%血清的DMEM。孵育24 h 后，將遷移或侵襲的細胞固定，用0.1%結晶紫染色，然后在100倍顯微鏡下選取3個視野觀察。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 7 進行統計分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示。2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 細胞中CircCDR1as、CBX4 表達上調，miR-671-5p 表達下調 與HBE 細胞相比，CircCDR1as 在4 種NSCLC 細胞系中的表達增加，miR-671-5p 表達降低，CBX4 mRNA 和蛋白水平升高（P＜0.05），見圖1、表1。且A549細胞中CircCDR1as的表達最高（F=328.965，P＜0.05），故選擇該細胞進行后續實驗。

Tab.1 CircCDR1as,miR-671-5p and CBX4 levels in HBE cells and NSCLC cell lines表1 HBE細胞和NSCLC細胞系中CircCDR1as、miR-671-5p、CBX4表達水平 （n=6，）

Tab.1 CircCDR1as,miR-671-5p and CBX4 levels in HBE cells and NSCLC cell lines表1 HBE細胞和NSCLC細胞系中CircCDR1as、miR-671-5p、CBX4表達水平 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與HBE比較，P＜0.05。

細胞系HBE NCI-H524 NCI-H1734 Calu-3 A549 F CircCDR1as 1.00±0.01 3.92±0.14a 4.09±0.21a 4.15±0.19a 4.29±0.28a 328.965＊＊miR-671-5p 1.00±0.02 0.59±0.05a 0.52±0.06a 0.41±0.04a 0.32±0.02a 243.424＊＊CBX4 mRNA 1.00±0.02 2.86±0.14a 2.95±0.18a 3.18±0.23a 3.32±0.25a 160.266＊＊CBX4蛋白1.00±0.03 2.54±0.11a 2.63±0.14a 2.75±0.21a 2.89±0.16a 175.065＊＊

Fig.1 CBX4 protein expression in HBE cells and NSCLC cell lines圖1 HBE細胞和NSCLC細胞系中CBX4蛋白的表達

2.2 CircCDR1as 在NSCLC 細胞中靶向調控miR-671-5p CircCDR1as 和miR-671-5p 的預測結合位點見圖2。與miR-NC+CircCDR1as-WT 組相比，miR-671-5p+CircCDR1as-WT 組相對熒光素酶活性降低（1.00±0.02vs.0.39±0.01，n=6，t=66.822，P＜0.05）；miR-NC+CircCDR1as-MUT 組與miR-671-5p+CircCDR1as-MUT 組相對熒光素酶活性差異無統計學意義（1.00±0.01vs.1.02±0.04，n=6，t=1.188，P＞0.05）。此外，在A549細胞中，與pcDNA組相比，CircCDR1as 組miR-671-5p 表達降低（1.00±0.03vs.0.36±0.02，n=6，t=43.479，P＜0.05）；與si-NC 組相比，si-CircCDR1as 組miR-671-5p 表達升高（1.01±0.05vs.2.14±0.11，n=6，t=22.907，P＜0.05）。

Fig.2 The binding sites of CircCDR1as and miR-671-5p predicted by starBase圖2 通過starBase預測CircCDR1as和miR-671-5p的結合位點

2.3 miR-671-5p的敲低可減弱CircCDR1as沉默對NSCLC 細胞生物學行為的影響 與Control 組和si-NC組相比，si-CircCDR1as組CircCDR1as表達降低，miR-671-5p 表達升高，細胞活力降低，克隆形成數減少，凋亡率增高，遷移和侵襲細胞數減少（P＜0.05）；與si-CircCDR1as 組、si-CircCDR1as+antimiR-NC 組相比，si-CircCDR1as+anti-miR-671-5p組CircCDR1as 表達升高，miR-671-5p 表達下降，細胞活力增高，克隆形成數增多，凋亡率降低，遷移和侵襲細胞數增多（P＜0.05），見圖3、表2。

Tab.2 Comparison of NSCLC cell viability,number of clone formation,apoptosis rate,migration and number of invasive cells between the five groups表2 各組NSCLC細胞活力、克隆形成數、凋亡率、遷移侵襲細胞數比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of NSCLC cell viability,number of clone formation,apoptosis rate,migration and number of invasive cells between the five groups表2 各組NSCLC細胞活力、克隆形成數、凋亡率、遷移侵襲細胞數比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與si-NC組比較，c與si-CircCDR1as組比較，d與si-CircCDR1as+anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

組別Control組si-NC組si-CircCDR1as組si-CircCDR1as+anti-miR-NC組si-CircCDR1as+anti-miR-671-5p組F CircCDR1as 1.00±0.03 1.00±0.02 0.38±0.03ab 0.39±0.02 0.91±0.05cd 611.941＊＊miR-671-5p 1.00±0.02 0.99±0.03 1.78±0.06ab 1.75±0.08 1.26±0.05cd 328.761＊＊細胞活力（OD490值）1.18±0.21 1.17±0.19 0.49±0.07ab 0.47±0.06 0.99±0.12cd 36.693＊＊克隆形成數（個）91.45±7.62 91.38±7.49 38.62±3.51ab 38.67±3.48 80.59±6.72cd 121.564＊＊凋亡率（%）10.02±0.91 10.01±0.89 33.45±2.62ab 33.48±2.14 14.13±1.06cd 315.182＊＊遷移細胞數（個）94.38±8.12 94.29±7.91 40.15±10.03ab 40.18±10.06 79.84±9.21cd 55.305＊＊侵襲細胞數（個）97.56±6.89 97.54±6.85 41.32±8.74ab 41.35±6.95 80.69±7.24cd 90.091＊＊

Fig.3 Apoptosis,migration and invasion of NSCLC cells in each group(crystal violet staining,×200)圖3 各組NSCLC細胞凋亡、遷移和侵襲情況（結晶紫染色，×200）

2.4 CBX4 是miR-671-5p 在NSCLC 細胞中的靶點 StarBase 預測結果顯示miR-671-5p 與CBX4 有潛在結合位點，見圖4。與miR-NC+CBX4-WT組相比，miR-671-5p+CBX4-WT組相對熒光素酶活性降低（1.00±0.03vs.0.41±0.02，n=6，t=40.083，P＜0.05）；miR-671-5p+CBX4-MUT 組與miR-NC+CBX4-MUT組相對熒光素酶活性差異無統計學意義（1.02±0.03vs.1.00±0.05，n=6，t=0.840，P＞0.05）。此外，miR-671-5p 組與miR-NC 組相比，CBX4 的mRNA和蛋白表達水平下降（P＜0.05）；anti-miR-671-5p組與anti-miR-NC 組相比，CBX4的mRNA 和蛋白表達水平增高（P＜0.05），見圖5、表3。

Tab.3 Comparison of mRNA and protein levels of CBX4 in A549 cells between the four groups表3 各組A549細胞中CBX4的mRNA和蛋白水平比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of mRNA and protein levels of CBX4 in A549 cells between the four groups表3 各組A549細胞中CBX4的mRNA和蛋白水平比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與miR-NC組比較，b與anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

組別miR-NC組miR-671-5p組anti-miR-NC組anti-miR-671-5p組F CBX4 mRNA 1.00±0.01 0.38±0.04a 1.00±0.02 2.12±0.06b 2 212.351＊＊CBX4蛋白1.00±0.03 0.42±0.04a 1.00±0.02 1.71±0.08b 719.376＊＊

Fig.5 CBX4 protein expression in A549 cells of each group圖5 各組A549細胞中CBX4蛋白表達

Fig.4 The binding sites of miR-671-5p and CBX4 predicted by StarBase圖4 StarBase預測miR-671-5p和CBX4的結合位點

2.5 miR-671-5p 通過降低NSCLC 細胞中CBX4 抑制細胞活力、遷移和侵襲，促進凋亡 與miR-NC組和Control 組相比，miR-671-5p 組CBX4 mRNA 和蛋白表達降低，細胞活力降低，克隆形成數減少，凋亡率增高，遷移和侵襲細胞數減少（P＜0.05）；與miR-671-5p 組、miR-671-5p+pcDNA 組相比，miR-671-5p+CBX4 組CBX4 mRNA 和蛋白表達升高，細胞活力增高，克隆形成數增多，凋亡率降低，遷移和侵襲細胞數增多（P＜0.05），見圖6、7，表4。

Tab.4 Comparison of NSCLC cell viability,number of clone formation,apoptosis rate,migration and number of invasive cells between the five groups表4 各組NSCLC細胞活力、克隆形成數、凋亡率、遷移和侵襲細胞數比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與miR-NC組比較，c與miR-671-5p組比較，d與miR-671-5p+pcDNA組比較，P＜0.05。

組別Control組miR-NC組miR-671-5p組miR-671-5p+pcDNA組miR-671-5p+CBX4組F CBX4 mRNA 1.00±0.02 0.99±0.03 0.36±0.03ab 0.37±0.02 0.84±0.05cd 613.941＊＊CBX4蛋白1.00±0.03 1.01±0.05 0.33±0.02ab 0.32±0.04 0.81±0.05cd 455.051＊＊細胞活力（OD值）1.09±0.15 1.07±0.13 0.46±0.05ab 0.48±0.06 1.03±0.11cd 55.276＊＊克隆細胞數97.68±5.49 97.75±5.63 39.54±2.16ab 39.57±2.13 82.36±4.25cd 297.408＊＊凋亡率（%）8.24±0.13 8.26±0.15 34.52±2.31ab 34.39±2.46 13.64±1.02cd 441.727＊＊遷移細胞數86.34±3.52 86.38±3.61 40.15±2.03ab 40.19±2.05 81.23±3.12cd 412.551＊＊侵襲細胞數78.69±2.63 78.72±2.62 35.42±1.89ab 35.51±1.92 67.49±2.01cd 585.024＊＊

Fig.6 Expression of CBX4 protein in A549 cells of each group圖6 各組A549細胞中CBX4蛋白表達

Fig.7 Apoptosis,migration and invasion of NSCLC cells in each group(crystal violet staining,×200)圖7 各組NSCLC細胞凋亡、遷移和侵襲情況（結晶紫染色，×200）

2.6 沉默CircCDR1as通過調控miR-671-5p來降低NSCLC 細胞中CBX4 的表達 與Control 組和si-NC組相比，si-CircCDR1as 組CBX4 mRNA 和蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與si-CircCDR1as 組、si-CircCDR1as+anti-miR-NC 組相比，si-CircCDR1as+anti-miR-671-5p組CBX4 mRNA和蛋白表達顯著增高（P＜0.05），見圖8、表5。

Tab.5 Comparison of CBX4 expression in NSCLC cells between the five groups表5 各組NSCLC細胞CBX4表達的比較（n=6，）

Tab.5 Comparison of CBX4 expression in NSCLC cells between the five groups表5 各組NSCLC細胞CBX4表達的比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與si-NC組比較，c與si-CircCDR1as組比較，d與si-CircCDR1as+anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

組別Control組si-NC組si-CircCDR1as組si-CircCDR1as+anti-miR-NC組si-CircCDR1as+anti-miR-671-5p組F CBX4 mRNA 1.00±0.03 1.02±0.05 0.43±0.03ab 0.41±0.02 0.82±0.06cd 322.880＊＊CBX4蛋白1.00±0.02 1.01±0.03 0.49±0.05ab 0.50±0.07 0.87±0.09cd 121.304＊＊

Fig.8 CBX4 protein expression in A549 cells of each group圖8 各組A549細胞中CBX4蛋白表達

3 討論

CircRNAs 在癌細胞中異常表達，可能是癌癥診斷和治療的潛在靶點［17］。由于腫瘤微環境的改變，CircCDR1as可以在不同的癌癥中作為致癌或抑癌基因發揮作用［8-11］。Zhang 等［12］報道了CircCDR1as 在NSCLC 中的異常表達。然而，CircCDR1as 在NSCLC發展中的作用機制尚不明確。本研究在體外驗證了CircCDR1as 基因沉默對NSCLC 發展的抑制作用并揭示了CircCDR1as/miR-671-5p/CBX4 在NSCLC 細胞中的調節機制。

CircRNAs 在肺癌的腫瘤發生中發揮了關鍵作用。本研究發現，CircCDR1as在NSCLC 細胞中的表達明顯增高，提示CircCDR1as 高表達可能導致NSCLC的惡性進展。腫瘤生長和轉移是肺癌惡性進展的兩個關鍵調控因素［18］。為了探討CircCDR1as在NSCLC治療中的潛在價值，本研究通過功能缺失實驗發現CircCDR1as沉默可抑制NSCLC細胞活力，減少克隆形成數和遷移、侵襲細胞數，提高細胞凋亡率，這與既往Zhang 等［12，19］的報道相似，提示CircCDR1as 沉默在NSCLC 細胞中發揮抗癌作用。上皮細胞向間充質細胞的轉化被認為是調節肺癌發生轉移的重要機制［20］。因此，CircCDR1as 可否通過誘導上皮-間充質轉化來促進細胞生長、遷移和侵襲還有待進一步研究。

CircRNAs 可以作為miRNAs的“海綿”參與癌癥的發展［21］。一些報道已經證明CircCDR1as 可以通過調節下游miRNA 的水平來調控腫瘤進展的過程［11，22］。此前的研究發現，CircCDR1as 通過吸附miR-671-5p 促進口腔鱗狀細胞癌細胞自噬［23］。與此一致的是，本研究通過雙熒光素酶報告基因檢測證實CircCDR1as在NSCLC細胞中是miR-671-5p的“海綿”。本研究還發現miR-671-5p 在NSCLC 細胞中的表達下降，其過表達抑制了NSCLC 細胞活力，降低了克隆形成數和遷移、侵襲細胞數，升高了細胞凋亡率，這也與之前的研究［24］一致。這表明miR-671-5p在NSCLC中的抗癌作用。此外，本研究數據顯示，CircCDR1as沉默對NSCLC 進展的抑制作用被miR-671-5p抑制劑削弱，揭示了CircCDR1as可能通過海綿吸附miR-671-5p 促進NSCLC 發展的可能性。

為了進一步闡明CircCDR1as 的作用機制，本研究分析了miR-671-5p 的靶點。以往的研究已經證實miR-671-5p 在不同條件下具有多種靶點，如MFAP3L、TUFT1 等［12，25］。本研究證實了miR-671-5p 和CBX4 在NSCLC 細胞中的靶向關系。CBX4 是一種SUMO E3連接酶，也被稱為HPC2，其作為一種相對保守的PcG 蛋白，參與腫瘤發生和細胞周期調控［26］。本研究發現，CBX4 在NSCLC 細胞中的表達增加，提示CBX4 的高表達可能促進了NSCLC 的發生發展，這與Hu等［15］的研究結果類似。在常氧條件下，CBX4 在乳腺癌［27］和胃癌［28］等多種腫瘤中具有促增殖、促轉移和抑凋亡作用。同樣，本研究也發現CBX4 的高表達可以促進細胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制細胞凋亡，與之前的研究［15］一致。同時，本研究結果顯示，CBX4 逆轉了miR-671-5p 對NSCLC 進展的抑制作用，提示miR-671-5p 通過靶向CBX4 抑制NSCLC 進展。 此外，本研究發現，下調CircCDR1as 可以通過調控miR-671-5p 在NSCLC 細胞中水平來降低CBX4的表達。由于體外細胞培養條件不能完全模擬體內腫瘤微環境，后續研究應利用小鼠肺癌模型進行臨床前分析。

綜上所述，CircCDR1as 在NSCLC 細胞中均高表達。沉默CircCDR1as可能通過上調miR-671-5p、降低CBX4表達來抑制細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡，進而抑制NSCLC 的進展，這可能有助于深入了解NSCLC惡性進展的機制。